B ộ Y TÊ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI

TRẦN THẾ PHƯƠNG

ĐỈNH LƯỢNG ĐỒNG THÒI THEOPHYLIN,
EPHEDRIN HYDROCLORID,
PHENOBARBITAL TRONG THUỐC HỗN
HỢP TRị HEN SUYỄN BANG PHƯONG
PHÁP SẮC KỶ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
( KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP

Dược s ĩ KHOÁ 1997-2002 )

Người hướng dẫn:

TS. THÁI PHAN QUỲNH NHƯ
TS. THÁI DUY THÌN

Nơi thực hiện:

Phòng Hoá Lý I - Viện Kiểm nghiệm

Thời gian thực hiện: 2/2000 đến 5/2002

M T H tv p ),

Hà Nội 5-2002

'\


3

1.1.1 Đại cương...........................................................................

3

1.1.2 Các phương pháp định lượng............................................................................ 3
1.1.3 Tác dụng dược lý.....................................................................

3

1.2 Phénobarbital..........................................................................

4

1.2.1 Đại cương.....................................................................................

4

1.2.2 Các phương pháp định lượng.......................................................................... 4
1.2.3 Tác dụng dược lý...............................................................................

5

1.3Ephedrin.......................................................................................

5

1.3.1 Đại cương................................................................................................


2.1.3 Viên nén Antasma.......................................................................................

17

2.1.4 Viên nén Asmin.............................................................................

17

2.2 Phương pháp nghiên cứu...........................................................................

18

PHẦN 3: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ.............................................................19
3.1 Thiết bị, hoá chất, dung môi...................................................................

19

3.1.1 Thiết bị.............................................................................................................. 19
3.1.2 Hoá chất, dung môi.......................................................................................... 19
3.2 Xây dựng chương trình sắc ký..........................................................................19
3.2.1 Khảo sát lựa chọn bước sóng...........................................................................19
3.2.2 Lựa chọn dụng môi pha động..........................................................................21
3.2.3 Khảo sát tốc độ dòng....................................................................................... 21
3.2.4 Chương trình sắc ký......................................................................................... 22
3.3 Khảo sát sự phụ thuộc tuyến tính giữa chất khảo sát và diện tích pic tương
ứng thu được........................................................................................................

23

3.4 Khảo sát độ lặp lại...............................................................................................26

xuất, lưu hành và sử dụng rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là ở nước ta, kể cả
thuốc nội và nhập ngoại. Ví dụ các thuốc hỗn hợp vitamin, hỗn hợp hạ nhiệt
giảm đau, chống dị ứng, chữa hen... Nghiên cứu các phương pháp để kiểm tra
chất lượng các thuốc này đang là vấn đề thu hút sự cố gắng của ngành kiểm
nghiệm.
Hiện nay trên thị trường có nhiều loại thuốc chữa hen có 3 thành
phần[l]: Theophylin, Ephedrin hydroclorid, Phénobarbital như biệt dược
Etadasmyl, Tiphasmyl ( Công ty Dược vật tư y tế Tiền Giang ); Asmin (Xí
nghiệp Dược phẩm trung ương 25 ); Dophasmin ( Xí nghiệp Dược phẩm trung
ương II ); Asmalin ( Xí nghiệp Dược phẩm trung ương 5 ); Antasma ( Công ty
vật tư y tế Bến Tre ); Tedralas ( Labomed - Pháp )... Trong các Dược điển hiện
có ở Việt Nam và một số tài liệu tham khảo khác [2][8][13][14] [16][18] 'ichỉ có chuyên luận kiểm nghiêm các dạng bào chế đơn thành phần của các
hoạt chất trên và phương pháp định lượng có thể là: đo mật độ quang, định
lượng trong môi trường khan, phương pháp chuẩn độ acid - base, phương pháp
so mầu... Như vậy muốn định lượng các thành phần trong hỗn hợp thì phải
thực hiện việc chiết tách phức tạp. Hơn nữa, sự chênh lệch về lượng giữa các
thành phần rất lớn trong đó lượng Phénobarbital rất nhỏ làm cho kết quả khó
chính xác phụ thuộc nhiều vào người thực hiện, có thể không định lượng được
bằng các phương pháp cổ điển.

1


Để khắc phục tình trạng này, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài
“Định lượng đồng thòi Theophylin, Ephedrin hydroclorid, Phénobarbital
trong thuốc hỗn hợp trị hen suyễn bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu
năng cao” với hai mục tiêu:
Khao sát và lựa chọn các điều kiện để xây dựng quy trình định lượng
đồng thời Theophylin, Ephedrin hydroclorid, Phénobarbital trong
hỗn hợp bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) với

thích thân kinh, đặc biệt là trung tâm hô hấp và vận mạch, làm giãn phế quản,
giãn động mạch phổi, làm thông khí do tăng tần số, biên độ hô hấp.

3


1.2.

PHENOBARBITAL

1.2.1. Đại cương [8][14]:
• Cổng thức:
/N H -CO

C2H 5

0=c
XN H -C O
• Tên khoa hoc: acid 5 - ethyl - 5 - phenyl barbituric.
• Tính chất: tinh thể không màu hoặc bột kết tinh trắng, không mùi. Bền
vững ngoài không khí. Rất khó tan trong nước lạnh và hexan; khó tan trong
nước nóng, cloroíorm; tan trong ether; dễ tan trong ethanol 96°, các dung
dịch hydroxyd, carbonat kim loại kiềm. Nhiệt độ nóng chảy 176°c.
1.2.2. Các phương pháp định lượng:
• Phương pháp chuẩn đỏ acid - base:
- Hoà tan chế phẩm vào dimethylíormamid ( DMF ) đã được trung hoà
trước ( CT xanh thymol 1% trong D M F). Chuẩn độ bằng dung dịch natri
hydroxyd trong hỗn hợp methanol : benzen tới khi xuất hiện màu
xanh[3].
Hoà tan chế phâm vào pyridin, thêm dung dịch bạc nitrat trong pyridin


• Tên khoa hoc: D ( - ) 2 - methyl - 2 - methylamino - 1 - phenyl ethanol
hydroclorid.
• Tinh chât: tinh thê nhỏ hoặc bôt kết tinh trắng, vi đắng. Dễ tan trong nước
cồn. Không tan trong ether. Nóng chảy ở 216 - 220°c. [a]ổ° = -33

-36°.

Do phân tử có 2 carbon bất đối nên có 4 đồng phân hoạt quang, 2 hỗn hợp
racemic. Dạng dược dụng là Ephedrin tả tuyền.

1.3.2. Các phương pháp định lượng:
• Đinh lương c r bằng phương pháp đo bac T81: dùng chỉ thị hấp phụ
Bromphenol xanh, môi trường acid acetic, chuẩn độ trực tiếp bằng bạc
nitrat cho đến khi tủa vón lại và dung dịch có màu tím.
• Phương pháp so màu T81: dựa vào phản ứng tạo phức màu với đồng Sulfat.
• Đinh lương mỏi trường khan r2ir3iri3iri5iri6iri7iri81: hoà tan chế phẩm
vào acid acetic băng, làm lạnh. Chuẩn độ bằng acid percloric với chỉ thị
tím tinh thể cho tới khi có màu xanh lá cây.

5


• Phương pháp HPLC T191:
-

Cột LI ODS ( 300mm X 4mm ).

-




chất tan vào pha tĩnh và pha động khi pha động luôn luôn chảy qua cột với
một tốc độ nhất định.
Các chất cần phân tách trong dung dịch của hỗn hợp khi được đưa vào
cột sẽ được hấp phụ hoặc liên kết vói pha tĩnh tuỳ thuộc vào bản chất của cột
và kiểu sắc ký áp dụng. Dung môi pha động được bơm vào cột sắc ký dưới áp
suất cao. Các chất tan sẽ di chuyển qua cột với tốc độ khác nhau tuỳ thuộc vào
cấu trúc và tính chất của mỗi chất. Thời gian chất tan bị pha tĩnh lưu giữ được
quyết định bởi bản chất sắc ký của pha tĩnh, cấu trúc và tính chất của các chất
tan, bản chất và thành phần của pha động dùng để rửa giải chất tan ra khỏi cột.
Kết quả là các chất được phân tách khỏi nhau. Sau khi ra khỏi cột, các chất sẽ
được phát hiện bằng detector và được chuyển qua bộ phận xử lý kết quả. Kết
quả sau khi được xử lý sẽ được đưa ra máy ghi hoặc hiển thị trên màn hình.
Tín hiệu phân tích định tính mỗi thành phần trong hỗn hợp là thời gian
lưu của chất đó trên cột hay vị trí của pic tương ứng trên sắc ký đồ, còn tín
hiệu phân tích định lượng là diện tích pic ( hoặc chiều cao pic ) thu được, phụ
thuộc vào nồng độ của chất đó trong dung dịch đem đo HPLC.
1.4.2. Các đại lượng đặc trưng trong kỹ thuật HPLC
• Thời sian lưu ÜR-lvà thể tích lưu:
Thời gian lưu là thời gian cần thiết để một chất tan di chuyển từ nơi
tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ ( tính từ lúc tiêm
tới khi xuất hiện đỉnh của pic ). Dựa vào thời gian lưu có thể phát hiện định
tính chất đó là chất gì. Nếu gọi tRlà thời gian lưu của chất tan thì ta có:
Trong đó:

*R= *0 + í’r
- t0: thời gian chết hay thòi gian không lưu giữ
- t ’R: thời gian lưu giữ thực của chất tan.


Đây là một đại lượng quan trọng được dùng để mô tả tốc độ di chuyển
của một chất. Nó cho ta biết khả năng phân bố của chất tan trong mỗi pha như
thế nào. Thừa số dung lượng được tính theo công thức:
k’ =
Trong đó: Qs và QMlà lượng chất tan phân bố trong pha tĩnh và pha động.
Quan hệ giữa hệ số phân bố và thừa số dung lượng:
k’ = K

vs
s

V M

Trong đó:

vsvà VMlà thể tích pha tĩnh và pha động.

Ngoài ra có thể định nghĩa k ’ theo một cách khác:
T -T
k’ = R 0
T1 M
• Hê số chon loc ( ạ ):
Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất được đặc trưng bởi hệ số chọn lọc:
_

K

B _

a ~ KA


-

_ _ .

f

tR Y

WBlà chiều rộng pic ở đáy pic

- W 1/2 là chiều rộng pic đo ở nửa chiều cao của đỉnh.
Nếu gọi L là chiều cao của cột sắc ký, chiều cao của đĩa lý thuyết được
tính bằng công thức:

• Đỏ phân giải ( Rc ):
Độ phân giải là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký.
Độ phân giải được định nghĩa như sau:
t R . B - t R,A

Rs = 1/ 2f W B+w a ^ị

khoả ng cách gi ữ a hai pic
độ rộng trung b ì nh gi ữ a hai pic

• Phương trình Van - Deemter:
Phương trình Van - Deemter mồ tả ảnh hưởng của tốc độ dòng pha
động và các thông số động học khác đến hiệu lực của cột sắc khí:

H= A + ỵy + c.u

hạt từ 3 -1 0 micrômet, diện tích bề mặt riêng thường từ 50 - 500 m2/g.
• Phân loai pha tĩnh:
-

Căn cứ theo bản chất chính của quá trình sắc ký trong cột tách, người ta
chia nó thành nhiều loại như hấp phụ, phân bố, trao đổi ion và rây phân
tử. Tương ứng với loại chất nhồi như thế người ta có một loại sắc ký
riêng trong kỹ thuật tách HPLC.

-

Căn cứ vào trạng thái là rắn hay lỏng thì pha tĩnh được chia làm 2 loại:
nếu pha tĩnh là chất rắn, người ta có sắc ký lỏng rắn LSC ( Liquid Solid
Chromatography), nếu pha tĩnh là chất lỏng thì chúng ta có sắc ký lỏng
lỏng LLC ( Liquid Liquid Chromatography ).
Xét vê cấu trúc xốp của pha tĩnh là các hạt rắn thì pha tĩnh có 2 kiểu
xốp: xốp toàn phần hạt và xốp chỉ lớp vỏ ngoài ( xốp bề mặ t ).

11


• Điều kiên đối vói mốt pha tĩnh:
- Phải trơ và bền vững với các điều kiện của môi trường sắc ký.
-

Có khả năng tách chọn lọc một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều
kiện sắc ký nhất định.

- Tính chất bề mặt phải ổn định.
- Cân bằng động học của sự tách phải xẩy ra nhanh và lặp lại tốt.

nhất định. Pha tĩnh loại này là kỵ nước, nghĩa là bề mặt hoạt động của
nó không bị ảnh hưởng của các phân tử nước, mà trái lại nước lại là một
thành phần của dung môi rửa giải có ý nghĩa thực tế lớn. Sự tách các
chất nhồi loại này có độ lặp lại tốt hơn. Do đó loại này được ứng dụng
nhiều hơn loại Silica trung tính.
- Silicagel đã được Sunfonic hoá hay nitro hoá: được sử dụng cho sắc ký
trao đổi ion ( cation ). Đây là sản phẩm của sự sunfonic hoá hay nitro
hoá các silicagel trung tính đê thay các nhóm -OH trên bê mặt Silicagel
trung tính bằng các nhóm -SO3H hay -N 0 2H. Các nhóm chưc nay co
ion H+ có thể trao đổi được với các cation kim loại khác. Đây là các pha
tĩnh trao đổi cation mạnh, còn nếu thay thế nhóm -OH bằng nhóm -RCOOH thì ta có loại pha tĩnh trao đổi cation acid yếu. Pha tĩnh loại này
được dùng để tách các chất có cấu tạo ion như ion các kim loại và hợp
chất của chúng, hay các chất khi tan trong pha động thì phân ly thành
ion như các acid, base. Pha động sử dụng trong loại sắc ký này là các
dung dich nước của các muối có chứa chât đệm, chât tạo phưc, dung
dịch acid hay base, hoặc có thể có các chất hữu cơ tan trong nước.
- Các Silicagel được amin hoá: được sử dụng cho sắc ký trao đổi anion.
Các Silicagel này được chế tạo bằng các thay thế nhóm-OH bằng các
nhóm -NH2, -NH, -NR2, -NR3, -CH2(OH). Pha tĩnh loại này sử dụng để
tách các anion trong hợp chất có cấu trúc ion hay cac chât khi tan trong
pha động thì phân ly thành các ion như các base, acid. Pha động của
loại này cũng giống như trên.

13


1.4.5. Pha động trong HPLC:
Pha động là dung môi dùng để rửa giải các chất tan ( chất cần phân
tích ) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Đây là một yếu tố hết
sức linh động và dễ dàng thay đổi. Nó có thể là 1 dung môi hoặc có thể là một

ổn định, độ lặp lại cao, phải bão hoà pha động trước khi chạy sắc ký bằng
nước.
• Trong sắc ký hấp phụ pha đảo, pha động là hệ dung môi phân cực, là
những dung môi đồng tan với nước, có khi nước lại là thành phần chính
trong pha động ví dụ như methanol, acetonitril... Ta có thể tạo ra những
pha động có độ phân cực khác nhau bằng cách thêm vào đó những tỷ lệ
nước nhất định, do đó hệ pha này trở nên linh động và được ứng dụng
nhiều. Ngoài ra, trong nhiều trường hợp, thành phần pha động còn có thêm
các chất đệm pH để ổn định pH cho quá trình sắc ký, chất tạo phức để tạo
ra sự rửa giải chọn lọc, chất tạo cặp ion để sử dụng trong sắc ký cặp ion.
• Trong sắc ký trao đổi ion, pha động là dung dịch nước của các acid hay
base, hoặc là dung dịch nước của các muối kim loại kiềm, kiềm thổ, có
chứa chất đệm pH, chất tạo cặp ion, chất tạo phức. Trong loại sắc ký này
thì pH pha động và chất tạo phức có ý nghĩa rất lớn. Trong sắc ký cặp ion,
pha động vẫn sử dụng nước và methanol là dung môi chính thêm vào đó
các chất chứa ion tạo cặp, chất đệm pH, chất tạo phức.
•

Có 4 yếu tố quan trọng cần chú ý trong lựa chọn pha động:
- Bản chất của dung môi để pha chế pha động.
- Thành phần các chất tạo ra pha động.
- Tốc độ của pha động.
- pH của pha động ( đặc biệt chú ý ở sắc ký trao đổi ion và cặp i on).

1.4.6. Cách đánh giá pic:
•

Đánh giá diên tích pic: diện tích pic của một chất là tươngứng với tổng
lượng chất đó. Để tính diện tích pic, hiện nay người ta thườngdùng máy
tích phân điện tử gắn vói máy vi tính ( sai số khoảng 0,5% ) hoặc máy tích

16


PHẢN 2

ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u
2.1.

ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN c ứ u

2.1.1 Viên nén Tiphasmin:
• Cổng thức:

Theophylin

80 mg

Ephedrin.HCl

10 mg

Phénobarbital

5 mg

Tá dược vđ

1 viên

/,

Theophylin

120 mg

Ephedrin.HCl

25 mg

Phénobarbital

8 mg

Tá dược vđ

1 viên )

• Noi sản xuất: Công ty Dược vật tư y tế Bến Tre.
• Số kiểm soát: 23082000.

9


2.1.4 Viên nén Asmin:
• Cống thức:
Theophylin

120 mg

Ephedrin.HCl



3.1.

THIẾT BỊ, HOÁ CHẤT VÀ DUNG MÔI

3.1.1. Thiết bị:
-

Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao MERCK-HITACHI655A-12.

- Detector UV 655A-22.
-

Cột Lichrosorb RP18 (250 mm X 4,6 mm; 10 |Lim).

- Bộ lọc dung môi vói màng lọc 0,45 ỊLim.
-

Máy lắc siêu âm.

-

Cân phân tích có độ chính xác 0,1 mg.

-

Các dụng cụ thuỷ tinh khác:Bình định mức, pipet, ống đong

3.1.2. Hoá chất và dung môi:
-


-0.0002
’

AK

2:61 .111

256.667

f . r r 2882

400.00
Page
3____m

Bagel ine_________________________________ OFE
DISPLAY DATA

OBS__________
Baseline
Erase

: B.flBBB -> 1.8BB8
View

Re-scale

HH

e