HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM

NGUYỄN THỊ LƯƠNG

THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME
CHITOSANASE KỸ THUẬT TỪ VI KHUẨN
BACILLUS LICHENIFORMIS NN1

LUẬN VĂN THẠC SĨ

NHÀ XUẤT BẢN ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP - 2015


HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM
----------

----------

NGUYỄN THỊ LƯƠNG

THU NHẬN VÀ XÁC ĐỊNH ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME
CHITOSANASE KỸ THUẬT TỪ VI KHUẨN
BACILLUS LICHENIFORMIS NN1

Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ SAU THU HOẠCH
Mã số

: 60 54 01 04

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
PGS.TS. NGÔ XUÂN MẠNH

Thực phẩm, khoa Công nghệ sinh học đã tạo điều kiện thuận lợi trong quá
trình tôi thực hiện đề tài tốt nghiệp.
Đặc biệt, con xin bày tỏ tình cảm sâu sắc nhất đến bố mẹ và những người
thân trong trong gia đình đã luôn luôn quan tâm, lo lắng và tạo điều kiện tốt nhất
cho con trong quá trình học tập, để con hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp này.
Mặc dù đã rất cố gắng nhưng bản luận văn này không tránh khỏi những
thiếu sót và hạn chế. Vì vậy, tôi kính mong nhận được sự quan tâm và đóng
góp ý kiến của quý thầy cô để bản luận văn này được hoàn thiện hơn.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn!
Hà nội, ngày tháng năm 2015
Học viên

Nguyễn Thị Lương

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page ii


MỤC LỤC
Lời cam đoan

i

Lời cảm ơn

ii

Mục lục


1.2.1.

Mục đích

2

1.2.2. Yêu cầu

2

PHẦN II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

3

2.1.

Enzyme chitosanase

3

2.1.1.

Khái niệm

3

2.1.2.

Phân loại enzyme chitosanase



2.1.8.

Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide

12

2.2.

Thu nhận và tinh sạch enzyme chitosanase

15

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page iii


2.2.1.

Nguồn thu nhận enzyme chitosanase đã dùng trong sản xuất chitosanase 15

2.2.2.

Vi khuẩn Bacillus licheniformis

15

2.2.3.


24

3.1.

Vật liệu

24

3.1.1.

Đối tượng nghiên cứu

24

3.1.2.

Môi trường nuôi cấy

24

3.1.3.

Dụng cụ, thiết bị và hóa chất sử dụng

24

3.1.4.

Địa điểm nghiên cứu


28

3.3.3.

Phương pháp xác định hoạt tính enzyme chitosanase kỹ thuật

30

3.3.4.

Xác định đặc tính của enzyme chitosanase

33

3.4.

Phương pháp thống kê và xử lý kết quả

33

PHẦN IV. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
4.1.

34

Xác định điều kiện nuôi cấy tối ưu vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1
sinh tổng hợp cao chitosanase

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp



41

Xác định điều kiện thu nhận chitosanase từ vi khuẩn Bacillus licheniformis
NN1

42

4.2.1.

Nuôi cấy

42

4.2.2.

Cô đặc dịch enzyme thô

42

4.2.3.

Tủa phân đoạn enzyme chitosanase bằng muối amoni sunphate

43

4.2.4.

Quy trình thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis NN1

51

5.1.

Kết luận

51

5.2.

Đề nghị

51

TÀI LIỆU THAM KHẢO

52

PHỤ LỤC

56

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page v


DANH MỤC BẢNG

STT


Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của chitosanase thu được từ một số vi
sinh vật khác nhau

10

2.6:

So sánh đặc tính của một số enzyme chitosanase được sản xuất từ vi sinh vật

2.7:

Điều kiện nhiệt độ, pH và thời gian nuôi cấy của một số chủng vi sinh vật
sinh chitosanase

12

19

3.1:

Ma trận thực nghiệm

27

4.1:

Các mức thí nghiệm

36

43

4.7:

Ảnh hưởng của nhiệt độ tới hoạt tính của enzyme chitosanase

47

4.8:

Ảnh hưởng của pH tới hoạt tính của enzyme chitosanase

48

4.9:

Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt tính enzyme chitosanase

49

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vi


DANH MỤC HÌNH
STT

Tên hình



4.3: Ảnh hưởng của nồng độ chitosan tới quá trình sinh tổng hợp chitosanase từ vi
khuẩn Bacillus licheniformis NN1

35

4.4: Đường cong sinh trưởng và hoạt tính chitosanase của vi khuẩn Bacillus
licheniformis NN1

41

4.5: Quy trình thu nhận enzyme chitosanase kỹ thuật từ vi khuẩn Bacillus
licheniformis NN1

45

4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính của enzyme chitosanase

48

4.7: Ảnh hưởng của pH đến hoạt tính của enzyme chitosanase

49

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page vii


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT


N-acetyl-D-Glucosamine

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page viii


PHẦN I
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ sinh học, các chế
phẩm enzyme ngày càng được sử dụng rộng rãi trong các lĩnh vực như : hóa học,
công nghiệp nhẹ, y tế, nông nghiệp, chăn nuôi,… và nhất là trong công nghệ thực
phẩm. Hàng năm lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000
tấn với giá trị hàng trăm triệu đô la. Thực tế đã có hàng nghìn chế phẩm enzyme bán
trên thị trường thế giới, các chế phẩm này đã được khai thác và tinh chế có mức độ
tinh khiết theo tiêu chuẩn công nghiệp và ứng dụng. Các chế phẩm enzyme phổ
biến như amylase, protease, catalase, cellulase, lipase, glucoseoxydase… [7]. Tuy
nhiên ở nước ta hiện này ngành công nghiệp này vẫn còn rất mới mẻ. Do vậy, việc
nghiên cứu tìm kiếm các loại enzyme mới, tìm hiểu các đặc tính, ứng dụng của
chúng luôn là mục tiêu của các nhà khoa học. Một trong số các enzyme đó là
enzyme chitosanase.
Chitosanase kỹ thuật là một enzyme ngoại bào thủy phân liên kết nội phân tử
cơ chất chitosan, được biết đến ứng dụng chủ yếu để sản xuất ra Chitosan –
oligosaccharide (COS).
COS được ứng dụng giống chitosan nhưng do đặc tính dễ hoà tan trong nước
mà COS được ứng dụng nhiều trong y học và dược phẩm: COS giúp kích thích tiêu
hoá thức ăn, tăng tính thèm ăn ở vật nuôi, tăng cường sức đề kháng, tăng khả năng
miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư… [7,8]

khuẩn Bacillus licheniformis NN1
-

Xác định được một số đặc tính của enzyme chitosanase kỹ thuật thu

nhận từ vi khuẩn Bacillus licheniformis NN1.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 2


PHẦN II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Enzyme chitosanase
2.1.1. Khái niệm
Enzyme chitosanase có tên gọi đầy đủ theo danh pháp quốc tế là: Chitosan
N–acetylglucosaminohydrolase.
Chitosanase (EC 3.2.1.132) là enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân
chitosan bắng cách cắt đứt liên kết β–1,4–glucoside trừ liên kết giữa các
N–acetyl–D–glucosamine (GlcNAc–GlcNAc) và giải phóng ra các Chitosan
oligosaccharide.
Chitosanase

Chitosan + H2O

Các Chitosan Oligosaccharide chứa các
N–acetyl–D–glucosamine, D–glucosamine

Hoạt tính của chế phẩm enzyme đặc trưng cho khả năng xúc tác phân giải

chitosanase đặc trưng cho mỗi họ

Streptomyces griseus HUT 6037

Bacillus sp. No.7M
Bacillus circulans WL-12
Paenibacillus fukuinensis chủng D2
Streptomyces sp. chủng N174
Nocardioides sp. chủng N106
Amycolatopsis sp. chủng CsO–2
Streptomyces coelicolor A3
Streptomyces coelicolor A3 Bacillus
subtilis
Bacillus amyloliquefaciens
Bacillus KF
Bacillus KFB–C044, ( sinh
Chitosanase chịu nhiệt)
Bacillus sp. chủng CK4
Chlorella virus PBCV–1
Chlorella virus CVK2
Bacillus ehimensis
Bacillus coagulans
Burkholderia gladioli
Bacillus circulans MH–K1
Fusarium solani
Aspergillus oryzae
Aspergillus fumigatus
Metarhizium anisopliae

Những điều lưu ý


2.1.2.2. Dựa vào sự phân cắt đặc hiệu cơ chất của enzyme chitosanase
Chitosanase có khả năng nhận dạng liên kết đặc trưng trong chuỗi chitosan để
tiến hành phân cắt. Vị trí đó là liên kết β–1,4 glucoside giữa các phân tử
D–Glucosamine hoặc giữa D–Glucosamine và N–acetyl–D–Glucosamine.
Tuy nhiên không phải bất kỳ enzyme chitosanase nào cũng tấn công vào bất
kỳ vị trí liên kết này, mà có một số chitosanase chỉ có khả năng tấn công vào vị trí
β–1,4 glucoside giữa hai D–Glucosamine, còn một số chitosanase lại có khả năng
tấn công vào liên kết này giữa hai D–Glucosamine và giữa D–Glucosamine với
phần N–acetyl–D–Glucosamine còn lại. Dưới đây là một số vị trí tác dụng của
enzym chitosanase đã tìm thấy được chia theo họ.
Các liên kết đặc hiệu cho nhận của các enzyme chitinolytic và chitosanolytic
đã được điều tra bằng cách sử dụng cơ chất thông thường là acetylated chitosan
20–30%.
Dựa theo sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất chitosanase thì enzyme chitosanase
được phân thành ba loại khác biệt theo đề nghị của Fukamizo và CS [ 12].
Bảng 2.2: Phân loại Chitosanase dựa vào sự phân cắt đặc hiệu của cơ chất
Chitosanase

Kiểu phân cắt

Type I
– Bacillus pumilus BN–262
– Penicillium islandicum Streptomyces sp.
N174
Type II
– Bacillus sp. No 7–M
Type III
– Streptomyces griseus HUT 6037
–Bacillus circulans MH–K1

Bảng 2.3.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 6


Bảng 2.3: Khối lượng phân tử của một số enzyme chitosanase

Chitosanase

Khối lượng phân tử

Bacillus cereus

47 kDa

Bacillus circulans

31 kDa

Bacillus megaterium P1

43 kDa

Bacillus sp.

41 kDa

Bacillus sp. KCTC 0377BP

trình thuỷ phân chitosan đều là dạng α, điều đó cho thấy rằng chitosanase là một
enzyme chuyển hoá.
Cùng với những kết quả thu được khi quan sát dạng tinh thể học và các vùng
biến đổi cho phép chúng ta kết luận rằng đầu Glu22 hoạt động như là nơi cho
proton, trong khi đầu Asp4 hoạt hoá 1 phân tử nước sau đó tấn công vào vị trí C–1
của phân tử đường khử tại vị trí xúc tác.
Cơ chế chuyển hoá này được duy trì liên tục trên thực tế là nhờ 2 đầu xúc tác có
khoảng cách 13.8Å, cao hơn những enzyme chuyển hoá khác gần 10Å [12].

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 7


Cơ chế xúc tác của chitosanase được thể hiện trong hình sau:

Hình 2.2: Cơ chế xúc tác của enzyme chitosanase
Sản phẩm phản ứng của enzyme chitosanase được nghiên cứu bằng cách sử
dụng dung dịch chitosan và một vài COS làm cơ chất. Phương pháp sắc kí lớp
mỏng (TLC) (thin–layer chromatography) cho thấy rằng enzyme chitosanase đã giải
phóng ra COS từ chitosan, phần lớn là các COS dài hơn (GlcN)2 bằng cách phân cắt
nội phân tử. Enzyme này không thể thuỷ phân được (GlcN)2 hoặc (GlcN)3. Còn
(GlcN)4 và (GlcN)5 thì bền với hoạt tính xúc tác của enzyme này. Tuy nhiên,
chitosan oligosaccharide (GlcN)6 và (GlcN)7 được thuỷ phân hoàn toàn sau 15h ủ.
(GlcN)6 chủ yếu được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)3 và (GlcN)2 + (GlcN)4
nhưng (GlcN)2 + (GlcN)4 thì ít hơn nhiều. [Rồi sau đó, (GlcN)4 → (GlcN)2 +
(GlcN)2]. Nó cũng cho thấy rằng (GlcN)7 được phân cắt thành (GlcN)3 + (GlcN)4.
Kết quả này chỉ ra rằng để phản ứng xảy ra nhanh, cơ chất chitosan nên có chiều dài
chuỗi phân tử bằng hoặc dài hơn (GlcN)6, sự phân cắt liên kết glycoside xảy ra tốt
nhất tại trung tâm của mối liên kết hexameric và sinh ra (GlcN)3 là sản phẩm chủ


Chitotriose………………………….

–

Chitotetraose………………………..

15.0

Chitopentaose………………………

16.8

Chitohexaose……………………….

20.0

Chitoheptaose………………………

23.8

Chitosan hoà tan

100

Dịch keo chitin

2.8

CMC

nhiệt độ đó là nhiệt độ tối ưu của enzyme (topt). Nhiệt độ tối ưu của chitosanase thu được từ
các nguồn khác nhau thì cũng khác nhau và topt thường không cố định mà có thể thay đổi
tuỳ theo cơ chất, pH môi trường, thời gian phản ứng…
– Độ bền pH và pH tối ưu cho sự hoạt động của enzyme chitosanase
Giá trị pH của môi trường ảnh hưởng rõ rệt đến phản ứng enzyme vì nó ảnh
hưởng đến mức độ ion hoá cơ chất, enzyme và độ bền của protein enzyme. Đa số các
enzyme bền trong giới hạn pH giữa 5 đến 9. Đối với enzyme chitosanase, pH thích hợp
cho hoạt động của chúng thường vào khoảng 4.0 – 8.0. Tuy nhiên, pH tối ưu (pHopt) cho
hoạt động của chitosanase thu được từ các nguồn khác nhau là khác nhau.
Bảng 2.5: Nhiệt độ và pH tối ưu cho hoạt động của chitosanase thu được
từ một số vi sinh vật khác nhau
pH tối ưu

Nhiệt độ tối ưu (0C)

Bacillus sp. KCTC 0377BP

5.0

60

Bacillus cereus

5.8

54

Bacillus licheniformis MB-2

7.0



2.1.7. Ảnh hưởng của ion kim loại và các chất phản ứng khác tới sự hoạt động
của enzyme chitosanase
Theo các tài liệu nghiên cứu về vấn đề này, các ion như Mg2+, Mn2+ có khả
năng làm tăng hoạt tính của enzyme chitosanase, trong khi đó các ion Hg2+, Cu2+,
Co2+, Zn2+ và Ag+ lại có thể ức chế hoạt tính của enzyme này. Fe3+ kích thích hoạt
tính chitinase nhưng lại ức chế mạnh hoạt tính chitosanase. Các ion kim loại khác
không gây ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme này. Hoạt tính của enzyme
chitosanase giảm khoảng 50% nếu thêm KCl 0.4M hoặc NaCl 0.4M vào hỗn hợp
phản ứng.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 11


Bảng 2.6: So sánh đặc tính của một số enzyme chitosanase được sản xuất từ vi sinh vật
Vi sinh vật
Bacillus sp. strain KCTC 0377BP
Aspergillus oryza IAM 2660
Nocardia orientalis IFO 12806
Acinetobacter sp. strain CHB101
Enterobacter sp. strain G-1
Myxobacter strain AL-1
Matsuebacter chitosanotabidus 3001
B. cereus S1
B. megaterium P1 chitosanase Acetyl
Bacillus sp. strain KFB – C108


45
43
48

Endo
Exo
Exo
Endo
Endo
Exo
Endo
Endo
Endo
Endo
Endo

5.5
5.5
5.5
5-9
5-9
7.0
5.0
4.0
6.0
4.5-6.5
6.5

17.2
38.8

CMC, Chitosan
ND
Chitosan (90)
G1-G3
Chitosan, CMC (21,6)
G2-G4
Chitosan (81), CMC (0,4)
Oligomer
Chitosan
G3-G5
Nguồn: [43]

Chú thích:
(a)

Được xác định bằng phương pháp điện di trên gel polyacrylamide (SDS – PAGE)
(Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis) với enzyme tinh sạch
(b)
Exo: kiểu phân cắt ngoài; Endo: kiểu phân cắt trong
(c)
Sản phẩm cuối cùng khi sử dụng chitosan làm cơ chất
(d)
ND (not determined): không xác định được
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 12


2.1.8. Ứng dụng của enzyme chitosanase và chitosan oligosaccharide
2.1.8.1. Ứng dụng của enzyme chitosanase


Page 12


Không giống với chitosan, COS dễ đồng hóa bên trong cỏ thể và bên cạnh đó nó
có thể làm tăng sự đồng hóa của một số nguyên tố vi lượng như sắt, Canxi,... Ứng dụng
của Oligosaccharide cho phép giải quyết một số vấn đề về dinh dưỡng liên quan đến
thiếu hụt một số nguyên tố vi lượng. Nó loại bỏ một cách hoàn toàn Cholesterol và
lipoprotein mật độ thấp từ mạch máu. Bởi vậy việc bổ sung COS vào cơ thể của các
bệnh nhân bị bệnh béo phì thì có kết quả tốt. COS là cation dương vì vậy nó có thể liên
kết với các ion Cl có trong mạch máu rồi thải ra ngoài làm giảm huyết áp.
COS có nhiều đặc điểm nổi bật hơn so với chitin và chitosan. Tỉ lệ hấp thụ
Chitosan Oligosaccharide trong cơ thể người là 100%, hoạt tính và chức năng sinh
học của nó cao hơn chitosan rất nhiều. Do vậy nên đưa vào cơ thể hàng ngày để duy
trì sức khỏe.
COS còn có thể sử dụng để ức chế sự tiêu hóa các chất béo và nó đóng vai trò
như một tác nhân vận chuyển và nó được sử dụng như là tác nhân làm giảm
Cholesterol. COS phá vỡ khối mỡ thể hiện là nó có thể cản trở sự hấp thụ chất béo
bằng cánh tạo keo với chất béo trong ruột non.
Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh COS có chức năng tăng cường hệ thống
miễn dịch, ngăn cản sự phát triển của tế bào ung thư, tạo thành các kháng thể trong
gan và lá lách, kích thích sự tiêu hóa Canxi và các chất khoáng, kích thích sản sinh
ra các tế bào vi khuẩn có thể chữa bệnh như: Vi khuẩn lactic, làm giảm chất béo
trong máu, giảm huyết áp và lượng đường trong máu, điều chỉnh Cholesterol, giảm
cân và ngăn ngừa các bệnh ở người trưởng thành...Ngoài ra COS còn được ứng
dụng để cầm máu, chữa bỏng da, băng bó vết thương....[16].
Trong công nghệ thực phẩm
COS được dùng trong các quá trình xử lí sản phẩm, để bảo quản rau quả, một
số loại trái cây tươi (cà chua, dâu tây, cam, bưởi...). Tạo gel, tạo độ mịn, bề dày cho
sản phẩm, đặc biệt hơn COS có thể hút nước trong các sản phẩm nhằm tránh một số

hiệu quả cho các hợp chất hữu cơ, nó đóng vai trò như một chiếc kìm liên kết các chất
độc kim loại nặng. Chitosan được dùng như một chất mang để tách và làm giàu các
kim loại nặng trong môi trường nước. Mức độ hấp thu của chitosan với các kim loại
nặng thủy ngân, cadimin (Hg, Cd) đạt bão hòa sau 90 phút khuấy. Hg hấp thụ trên
chitosan đạt cao nhất 90%, Cd đạt 41%. Khả năng hấp thụ của chitosan đối với các ion
trên đạt cực đại và ổn định ở pH 4 ÷ 6. Ngoài ra, nó có khả năng hấp thụ các chất
nhuộm cà nồng độ nhỏ của các phenol khác nhau trong công nghệ xử lý rác thải.

Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp

Page 14