Xác định kiểu gen của HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận được từ
thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC
Phạm Hùng Vân*
(1)
, Bành Vũ Điền
(2)
, Võ Đức Xuyên An
(3)
, Nguyễn Thị Minh Thư
(3)
, Lê Thị Phi Yến
(3)
,
Đỗ Thị Thanh Thủy
(1)
, Hòang Hiếu Ngọc
(1)

Tóm tắt
Đặt vấn đề: Để có thể tiên đóan được hiệu quả điều trị đặc hiệu và quyết định được thời gian điều trị đặc hiệu cho
bệnh nhân viêm gan mạn tính do nhiễm HCV, các nhà điều trị cần phải có thông tin về kiểu gen của HCV trên bệnh
nhân. Trước đây, xét nghiệm xác định kiểu gen HCV phải được gửi sang Singapore để thực hiện với giá thành khá
cao: trên 180USD/mẫu thử.
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng phương pháp giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của thử ngiệm RT real-time
PCR sử dụng mồi và taqman probe đặc hiệu vùng 5’NC của virus để định genotype HCV.
Phương pháp nghiên cứu: Từ đầu năm 2006, các tác giả đã xây dựng được phương pháp xác định kiểu gen của
HCV bằng kỹ thuật giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR thu nhận từ thử nghiệm RT real-time PCR dùng mồi và
taqman probe đặc hiệu vùng 5’NC của HCV rồi sau đó so sánh với các trình tự của trong một thư viện các kiểu gen
HCV để xác định được kiểu gene của HCV.
Kết quả nghiên cứu: Từ tháng cuối 5/2006 đến cuối tháng 9/2006, các tác giả đã áp dụng phương pháp này để xác
định kiểu gen HCV cho 234 trường hợp co kết quả thử nghiệm RT real-time PCR dương tính HCV-RNA, kết quả

taqman probe specific to the 5’NC is the most appropriate approach that can be applied in clinical diagnosis of HCV
infection prior the specific treatment prescription
Đặt vấn đề
Xác định genotype virus viêm gan C (HCV) là
một chỉ định rất cần thiết trước khi bác sĩ điều trị
tiến hành cho chỉ định điều trị đặc hiệu viêm gan
C vì thời gian điều trị kéo dài bao lâu là tuỳ thuộc
vào type virus viêm gan C mà bệnh nhân đang
nhiễm
[1]
. Hiện nay, trên thế giới có 2 phương pháp
1*
Tác giả chính,
()
Đại Học Y Dược,
(2)
Bệnh Viện Chợ Rẫy,
(3)
Công ty Nam Khoa
1
xác định genotype viêm gan C dựa vào phân tích
một vùng đặc trưng trên vùng 5’NC của bộ gen
HCV đã được nhiều nhà nghiên cứu cũng như lâm
sàng chấp nhận và được thực hiện tại các phòng
thí nghiệm lâm sàng, đó là phương pháp lai trên
vạch dò đặc hiệu genotype C (HCV-InoLIPA)
[2]
và phương pháp giải trình tự trên máy Trugene
[3]
.

dụng bộ thử nghiệm RT TQ real-time PCR
(reverse transcriptase real-time PCR dùng taqman
probe) do công ty Nam Khoa sản xuất. Bộ thử
nghiệm này bao gồm một bộ RNAPREP để trích
biệt RNA từ các mẫu huyết thanh theo phương
pháp Chomzynski và Sacchi (số đăng kí chất
lượng: 03200/2001/CBTC-TĐC), bộ cDNA
synthesis hai bước để tổng hợp cDNA từ RNA với
mồi ngẫu nhiên, và bộ TQ real-time PCR mix để
phát hiện và định lượng HCV cDNA bằng phương
pháp real-time PCR dùng taqman probe và mồi
đặc hiệu một đọan đích 240-245bp nằm ở vùng
5’NC của bộ gen HCV (số đăng kí chất lượng:
03201/2001/CBTC-TĐC). Thử nghiệm real-time
PCR được thực hiện trên máy IQ5 của Biorad.
Phương pháp định lượng theo hướng dẫn của bộ
thử nghiệm. Có thể tóm tắt như sau: là trước hết
xây dựng đường chuẩn về mối liên hệ tuyến tính
giữa các nồng độ ban đầu của HCV cDNA chuẩn
(được pha từ mẫu HCV cDNA chuẩn được cung
cấp từ Khoa Sinh, trường Royal Holloway, Đại
Học Luân Đôn) với chu kỳ ngưỡng và sử dụng
đường biểu diễn này để tính được nồng độ ban
đầu của HCV cDNA có trong mẫu thử. Các mẫu
sản phẩm real-time PCR cho kết quả real-time
PCR [+] được làm tinh sạch để thu nhận sản phẩm
PCR với bộ thử nghiệm tinh sạch sản phẩm PCR
(PCR clean-up kit) do Promega sản xuất (Cat.
#A9281). Sản phẩm PCR sau khi tinh sạch được
điện di và định lượng nồng độ DNA bằng máy

genotype HCV dù kết quả định lượng có thấp đến
mức tối thiểu (là 445copies/ml huyết thanh trong
nghiên cứu này). Kết quả này cho phép nhận định
là phương pháp định genotype HCV bằng giải
trình tự trực tiếp sản phẩm PCR của phản ứng
real-time PCR dùng taqman probe mà chúng tôi
xây dựng đạt được độ nhạy cao tương đương
phương pháp RT TQ real-time PCR mà công ty
Nam Khoa đã phát triển và hiện đang được sử
dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm lâm sàng
có trang bị real-time PCR. Trong phương pháp RT
TQ real-time PCR này, nồng độ HCV RNA ban
đầu có trong mẫu thử được định lượng nhờ qui
chiếu chu kỳ ngưỡng của các mẫu thử lên trên
đường biểu diễn chuẩn.
2
Biểu đồ 1 trình bày tỷ lệ phần trăm các genotype
HCV của 234 mẫu huyết thanh thử nghiệm. Kết
quả cho thấy có đến 55% các mẫu là thuộc
genotype 1b, 20% thuộc genotype 6a, 9%
genotype 2, 6% genotype 1a, 5% genotype 2a, 2%
genotype 1, 1% genotype 1a/1b, 1% genotype
2a/2c, và <1% là thuộc genotype 2b.
Biểu đồ 2 trình bày đường biểu diễn khuếch đại
và đường biểu diễn chuẩn về mối quan hệ giữa
chu kỳ ngưỡng (Ct) với nồng độ HCV cDNA
chuẩn ban đầu, kết quả cho thấy thử nghiệm TQ
real-time PCR trên các mẫu HCV cDNA chuẩn
đạt độ chính xác khá cao thể hiện qua R ≥0.99 và
hiệu quả PCR trong khỏang 90% - 105%. Biểu đồ

mẫu cao nhất có kết quả định lượng là 13.792.596 copies/ml.
Biểu đồ 1: Biểu đồ cho thấy các tỷ lệ % các
genotype HCV trong 234 mẫu huyết thanh thử
nghiệm
Biểu đồ 2: (A) trình bày đường biểu diễn khuếch đại
và chu kỳ ngưỡng (Ct) của các nồng độ ban đầu của
các HCV cDNA chuẩn. (B) trình bày đường biểu diễn
chuẩn về mối quan hệ giữa Ct với nồng độ ban đầu
của HCV cDNA
(A)
(B)
Biểu đồ 3: Trình bày đường biểu diễn khuếch đại và Ct
của 13 mẫu. Lưu là đường ngưỡng nền (baseline
threshold đã được điều chỉnh để đạt 199.73 như là
ngưỡng nền của đường biểu diễn khuếch đại của các
mẫu chuẩn (biểu đồ 2-A)
Bảng 2: Trình bày Ct của 13 mẫu và nồng dộ HCV-RNA ban đầu có trong các mẫu. Nồng độ này được tính tóan dựa trên các thông số slope và Int
của đường biểu diễn chuẩn ở trên
Type Ident. Ct
Nồng độ HCV-RNA
(copies/ml)
Type Ident. Ct
Nồng độ HCV-RNA
(copies/ml)
Unkn 4492 25.38 409,173 Unkn 4483 30.75 13,027
Unkn 4488 N/A Unkn 4482 N/A
Unkn 4487 31.82 6,554 Unkn 4490 27.61 97,773
Unkn 4486 30.2 18,542 Unkn 4480 N/A
Unkn 4485 N/A Unkn 4494 30.79 12,696
Unkn 4484 26.95 149,353

tự của Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai trên
vạch của Bayer đều dựa trên một đọan
nucleotide đặc hiệu trên vùng 5’NC. Đây là cả
hai phương pháp được FDA và y học chấp
nhận để dùng trong các phòng thí nghiệm lâm
sàng. Phương pháp InoLIPA tuy kém hơn
phương pháp giải trình tự vì có thể có nhiều
trường hợp không thể phân biệt được các
subtype, nhưng InoLIPA có lợi điểm là không
cần thiết phải có thiết bị giải trình tự vốn được
xem là khá đắt tiền và tương đối khó về mặt
kỹ thuật, do vậy InoLIPA có thể triển khai
thực hiện được tại bất kỳ các phòng thí
nghiệm lâm sàng nào có trang bị phương tiện
cho kỹ thuật PCR. Tuy nhiên, vì InoLIPA
phải thực hiện trên sản phẩm PCR là kết quả
của phản ứng nested PCR nên khả năng bị
ngọai nhiễm là khá cao và đây chính là lí do
giải thích được tại sao có khá nhiều trường
hợp InoLIPA có kết quả không thể xác định
được genotype
[7,8]
. Để có thể khắc phục được
nhược điểm này, chúng tôi đã nghiên cứu
thành công một qui trình thực hiện RT-PCR
với PCR mix cực kỳ nhạy cảm chỉ cần dùng
mồi vòng trong của HCV-InoLIPA và có
thêm khả năng chống được ngọai nhiễm sản
phẩm khuếch đại nhờ có chứa dUTP và UNG;
và chính nhờ cải tiến quan trọng, HCV-

trung tâm Medic chỉ còn không qua
120USD/một mẫu thử. Tuy vậy, giá thành này
cũng hãy còn khá cao để có thể được chỉ định
rộng rãi cho các bệnh nhân. Ngòai ra, Trugene
là một hệ thống hòan tòan kín, chỉ được dùng
để đáp ứng yêu cầu định genotype HCV của
lâm sàng do vậy kết quả chỉ có thể hiển thị
được trên màn hình và in ra giấy, do vậy nhà
nghiên cứu không thể có được kết quả trên
một tập tin vi tính để có thể làm blast search
hay nghiên cứu phylogenetic. Thư viện HCV
là một thư viện được xây dựng sẵn và người
dùng có thể cập nhật thêm các kết quả của
mình (thực hiện trên chính máy giải trình tự
của Trugene) vào thư viện này, nhưng không
thể lấy thư viện này ra bên ngòai cũng như
không thể đăng nhập được một trình tự có
được từ các máy giải trình tự khác để search
trên thư viện này. Đây chính là một bất tiện
đặc biệt cho các nhà nghiên cứu khi muốn
nghiên cứu sâu thêm về HCV genotype trên
các kết quả có được từ các nguồn khác nhau.
Phương pháp giải trình tự để định genotype
HCV do chúng tôi phát triển và trình bày
4
trong công trình nghiên cứu này được thực
hiện trên một trình tự dài không quá 200bp
của một sản phẩm PCR dài khỏang 240-
250bp, kết quả từ thử nghiệm RT real-time
PCR dùng mồi và taqman probe đặc hiệu một

giảm được giá thành của xét nghiệm định
genotype bằng kỹ thuật giải trình tự này vì
không cần thiết phải thực hiện một RT-PCR
để có sản phẩm PCR dành riêng cho giải trình
tự. Giá thành định genotype HCV bao gồm cả
định lượng HCV-RNA hiện nay của chúng tôi
có khả năng sẽ không quá 50USD/mẫu.
Kết quả của công trình nghiên cứu cho thấy
đa số các mẫu huyết thanh được gửi đến xét
nghiệm định lượng HCV-RNA là thuộc
genotype 1b (55%) và 6a (20%), 25% còn lại
phân phối vào các genotype khác như
genotype 2 (9%), genotype 1a (6%), genotype
2a (5%), genotype 1 (2%), genotype 1a/1b
(1%), genotype 2a/2c (1%), và genotype 2b
(<1%). Chúng tôi không cho rằng tỷ lệ này
phản ánh thật sự đúng tần số lưu hành các
genotype HCV trong các người nhiễm HCV
tại Việt Nam mà chỉ nói lên được tần số
genotype trong các bệnh nhân sắp, đang và đã
điều trị đặc hiệu bệnh viêm gan mạn tính do
HCV. Chính trên đối tượng nghiên cứu này
nên chúng ta thấy tỷ lệ genotype 1b (là
genotype đáp ứng kém với điều trị đặc hiệu)
là đến 55% với đa số có giá trị định lượng
HCV-RNA khá cao (từ 100.000 đến
10.000.000 copies/ml)
Có một số nhà nghiên cứu cho là nếu định
genotype bằng giải trình tự vùng 5’NC sẽ
không cho kết quả chính xác mà phải giải

biệt các subtype cao
[12, 16-19]
.
Kết luận
Bằng phương pháp giải trình tự một đọan
DNA đích dài dưới 200bp của sản phẩm PCR
kết quả từ thử nghiệm RT-PCR dùng mồi và
Taqman probe đặc hiệu vùng 5’ NC, chúng tôi
đã định được genotype của HCV trong huyết
thanh của bệnh nhân bị viêm gan mạn tính do
nhiễm HCV. Nghiên cứu này đã mở ra được
một khả năng ứng dụng rộng rãi không chỉ
nhờ giá thành xét nghiệm thấp giúp cho các
bác sĩ điều trị không ngần ngại khi cho chỉ
định xét nghiệm cho bệnh nhân, mà còn có thể
triển khai được tại nhiều phòng thí nhiệm hiện
đang có máy giải trình tự mà vẫn ít hay chưa
có hướng ứng dụng trong y học như thực tế
hiện nay chúng ta vẫn thường gặp.
5
Tài liệu tham khảo
1 National Institute of Health Consensus (2002).
Development Conference Statement: Management of
Hepatitis C: 2002 June 10-12. Final Statement
Revisions made September 12, 2002
2. Versant HCV Genotyping Assay (LiPA)
3. Trugene HCV Genotyping Assay (Sequencing)
4. D. T. T Thuy (2000). Luận văn Thạc Sĩ
5. Trịnh Kim Ảnh và CS. Tình hình viêm gan virus B & C
ở bệnh viện Chợ Rẩy. Mạng y khoa net

Comparison of Hepatitis C Virus NS5b and 5’
Noncoding Gene Sequencing Methods in a Multicenter
Study. Journal of Clinical Microbiology, 43(2); 733-739
13. Chinchai, T., J. Labout, S. Noppornpanth, A.
Theamboonlers, B. L. Haagmans, A. D. Osterhaus, and
Y. Poovorawan. 2003. Comparative study of different
methods to genotype hepatitis C virus type 6 variants. J.
Virol. Methods 109:195–201.
14. Chen, Z., and K. E. Weck. (2002). Hepatitis C virus
genotyping: interrogation of the 5_ untranslated region
cannot accurately distinguish genotypes 1a and 1b. J.
Clin. Microbiol. 40:3127–3134.
15. Joseph D.C. Yao (2003). Evaluation of the TRUGENE
HCV 5_NC Genotyping Kit with the New GeneLibrarian
Module 3.1.2 for Genotyping of Hepatitis C Virus from
Clinical Specimens. Journal of clinical microbiology.
4855–4857
16. Cantaloube, J., H. Venault, J. Zappitelli, P. Gallian, M.
Touinssi, H. Attoui, P. Biagini, X. de Lamballerie, and
P. de Micco. 2000. Molecular analysis of HCV type 1 to
5 envelope gene: application to investigations of
posttransfusion transmission of HCV. Transfusion
40:712–717.
17. Germer, J. J., P. N. Rys, J. N. Thorvilson, and D. H.
Persing. 1999. Determination of hepatitis C virus
genotype by direct sequence analysis of products
generated with the Amplicor HCV test. J. Clin.
Microbiol. 37:2625– 2630.
18. Sandres-Saune, K., P. Deny, C. Pasquier, V. Thibaut, G.
Duverlie, and J. Izopet. 2003. Determining hepatitis C