ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
––––––––––––––––––––

LÊ THỊ THU HÀ

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS
TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG
(NESTED - PCR)

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC ỨNG DỤNG

THÁI NGUYÊN - 2017


ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC
––––––––––––––––––––

LÊ THỊ THU HÀ

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B
Ở MỘT SỐ BỆNH NHÂN NHIỄM VIRUS
TẠI THÁI NGUYÊN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PCR LỒNG
(NESTED - PCR)
Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60 42 02 01


Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè, đồng nghiệp đã
nhiệt tình động viên cho tôi thêm động lực hoàn thành tốt quá trình học tập và
nghiên cứu khoa học.
Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017
Tác giả

Lê Thị Thu Hà


iii
MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .............................................................................................. i
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................... ii
MỤC LỤC ........................................................................................................ iii
NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT................................................................................ v
DANH MỤC CÁC BẢNG.............................................................................. vii
DANH MỤC CÁC HÌNH .............................................................................. viii
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2
Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................ 3
1.1. Đại cương về bệnh viêm gan B và virus viêm gan B ................................ 3
1.1.1. Lịch sử phát hiện bệnh viêm gan B......................................................... 3
1.1.2. Tình hình bệnh viêm gan B trên thế giới và Việt Nam........................... 3
1.1.3. Virus HBV (Hepatitis B virus)................................................................ 5
1.2. Các kiểu gen của HBV và tình hình nghiên cứu về kiểu gen của HBV
trong và ngoài nước......................................................................................... 13
Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 17
2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 17

Bp

Base pair

CS

Cộng sự

CTAB

Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide

ddNTP

Dideoxy Nucleotide Triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxy Nucleotide Triphosphate

EDTA

Ethylene Diamin Tretraaxetic Acid

HBV


LiPA

Line probe assay

LMA

Kết hợp kháng thể

LTC

Lympho T cytotoxic

MHR

Major Hydrophilic Region

ORF

Open - reading frame

PCR

Polymerase Chain Reaction

RAPD

Random Amplified Polymorphism DNA

RFLP


Tris - EDTA

Tris

Trioxymetylaminometan

WHO

World Health Organization


vii
DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Sự phân bố kiểu gen HBV của một số tác giả trong nước và các
nước trong khu vực ......................................................................... 13
Bảng 2.1. Các dung dịch và đệm sử dụng trong thí nghiệm ........................... 17
Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong thí nghiệm ................................... 18
Bảng 2.3. Cặp mồi khuếch đại vùng gen S của HBV ..................................... 23
Bảng 2.4. Thành phần phản ứng PCR vòng ngoài .......................................... 24
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng ngoài .............................. 24
Bảng 2.6. Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm 1) .................. 25
Bảng 2.7. Thành phần phản ứng PCR vòng trong nhóm I .............................. 25
Bảng 2.8. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm I) ............... 25
Bảng 2.9. Mồi sử dụng cho phản ứng PCR vòng trong (nhóm II) ................. 26
Bảng 2.10. Thành phần phản ứng PCR vòng trong (nhóm II)........................ 26
Bảng 2.11. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR vòng trong (nhóm II) ............ 26
Bảng 3.1. Tỷ lệ kiểu gen của HBV trên một số bệnh nhân viêm gan B tại
tỉnh Thái Nguyên ............................................................................ 36


1
MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Hiện nay, tình trạng nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus - HBV)
là vấn đề đang được quan tâm trên thế giới nói chung và Việt nam nói riêng.
Virus viêm gan B là nguyên nhân chủ yếu gây xơ gan, ung thư gan [7], [8].
Theo thống kê của Tổ chức Y tế thế giới (World Health Organization WHO), có khoảng hơn 2 tỷ người bị nhiễm virus viêm gan B; trong đó có 350
triệu người mang virus viêm gan B mạn tính. Những người mang virus viêm
gan B mạn tính là nguồn lây nhiễm quan trọng trong cộng đồng và có nguy cơ
cao mắc các bệnh về gan nguy hiểm liên quan đến nhiễm vi rút viêm gan B
như bệnh viêm gan hoại tử (necroinflammatory) cấp hoặc mạn, xơ gan và đặc
biệt là ung thư biểu mô tế bào gan (hepatocellular carcinoma: HCC), làm cho
khoảng 5 trăm đến 2 triệu bệnh nhân tử vong mỗi năm [46], [47]. Tại Việt
Nam có khoảng 15% - 20% người nhiễm HBV, trong đó có khoảng 80- 92%
bệnh nhân xơ gan và ung thư gan nguyên phát có nhiễm HBV [4].
Kiểu gen của HBV được phát hiện lần đầu tiên năm 1988 bởi Okamoto
và cs dựa vào sự khác biệt trên 8% trình tự nucleotide trên toàn bộ bộ gen của
HBV [37]. Ở các vùng địa lý khác nhau có sự phân bố khác nhau về kiểu gen
của HBV [12], [13].
Để xác định genotype HBV có thể sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử
khác nhau như phân tích đa hình của các đoạn giới hạn (restriction fragment
length polymorphism - RFLP) [6], phương pháp PCR đa mồi (multiplex PCR) [9,28,30], phương pháp realtime - PCR [49], phương pháp
oligonucleotide microarray [41]... Sự hiểu biết về sự phân bố giữa các kiểu
gen của virus HBV có vai trò rất quan trọng trong công việc điều trị và theo
dõi diễn tiến của bệnh, phòng ngừa được các biến chứng của bệnh. Đặc biệt
điều này cũng rất có ý nghĩa trong công tác quản lý và giám sát về mặt dịch tễ
học phục vụ cho công tác phòng chống bệnh viêm gan siêu vi B. Xuất phát từ


2

Nhiễm virus viêm gan B là một vấn đề có tính chất toàn cầu bởi HBV
xuất hiện ngay cả ở các quần thể dân chúng sống cách biệt và những người
sống trên các hòn đảo. Tỷ lệ nhiễm virus viêm gan B và cách thức lây truyền
có sự khác biệt rõ rệt giữa các vùng khác nhau trên thế giới. Trên cơ sở điều
tra huyết thanh học các dấu ấn miễn dịch của virus viêm gan B đặc biệt là
HBsAg, Tổ chức Y tế Thế giới chia mức độ nhiễm virus viêm gan B thành 3
mức độ khác nhau: cao, trung bình, thấp [45], [46], [47].
Vùng lưu hành dịch cao
Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg  8% và tỷ lệ người đã nhiễm
virus viêm gan  60%. Gần 45% dân số thế giới nằm trong vùng này bao gồm
hầu hết các nước thuộc khu vực Châu Á (trừ Nhật Bản, Ấn Độ), Châu Phi,
hầu hết các nước Trung Đông, vùng lưu vực sông Amazon (Nam Mỹ), hầu
hết các đảo thuộc khu vực Thái Bình Dương, và một số dân tộc sống ở Bắc


4
cực như Eskimo, Maoris. Việt Nam là nước được xếp là vùng lưu hành dịch
cao [20].

Hình 1.1: Sự phân bố HBV trên thế giới [50]
Vùng lưu hành dịch trung bình
Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg từ 2-7% và tỷ lệ người đã từng
nhiễm virus viêm gan B từ 20-60%, 43% dân số thế giới nằm trong vùng này
bao gồm Ấn Độ, một phần Trung Đông, Tây Á, Nhật Bản, Nga, Đông Âu,
hầu hết các nước Nam và Trung Mỹ. Phương thức lây truyền rất đa dạng, xảy
ra ở tất cả các lứa tuổi từ trẻ sơ sinh đến người lớn. Hay gặp những trường
hợp nhiễm cấp virus viêm gan B do phần lớn nhiễm trùng xảy ra ở lứa tuổi
thanh niên và người lớn [34], [45].
Vùng lưu hành thấp
Là vùng có tỷ lệ người mang HBsAg  2% và tỷ lệ người đã từng

Chi (genus): Orthohepadnavirus.
Loài (species): viêm gan B.
Các nghiên cứu hiển vi điện tử đã xác định hình thái của HBV. Về cấu
tạo, hạt virus HBV hoàn chỉnh (Virion) có hình cầu nhỏ, đường kính 22-45


6
nm, gồm 3 lớp: lớp bao ngoài dày khoảng 7 nm, lớp vỏ Capsit hình hộp, có
đường kính khoảng 27 - 28 nm và lõi chứa bộ gen của virus.
Trong huyết thanh bệnh nhân ở giai đoạn hoạt động nhân đôi virus,
dưới kính hiển vi điện tử người ta thấy có 3 tiểu thể khác nhau của virus: Tiểu
thể hình cầu nhỏ có đường kính 22 nm; Tiểu thể hình ống (hình que) có
đường kính 20-22 nm, dài 40-400 nm; Tiểu thể hình cầu lớn có đường kính
42-45 nm còn gọi là tiểu thể Dane, đây chính là virus hoàn chỉnh [17].

Hình 1.2: Hạt virus hoàn chỉnh

Hình 1.3: Hình ảnh hiển vi điện tử

(tiểu thể Dane) của HBV [17]

HBV [17]

1.1.3.2. Cấu trúc HBV
Cấu tạo của virus HBV cũng giống đại đa số các virus khác. Chúng có
lớp vỏ ngoài bằng protein, có chứa trên bề mặt nhiều kháng nguyên HBs, và
cấu trúc DNA bên trong. HBV là chủng virus duy nhất có cấu trúc DNA có
khả năng lây truyền qua đường máu. Quá trình sao chép DNA là quá trình
phiên mã ngược nhờ một RNA trung gian. Protein kháng nguyên được lắp ráp
một cách đồng dạng DNA từng phần, trình tự protein tương đồng và phản ứng

Gen C mã hóa cho các cấu trúc lõi bao gồm hai vùng: pre C (29 axít
amin) mã hóa cho HBeAg và vùng C (183 axít amin) mã hóa cho HBcAg.
Gen P (832 axít amin) là gen dài nhất mã hóa cho DNA polymerase và cùng
với RNA trung gian tham gia vào quá trình sao chép ngược của virus.
Gen X gồm 154 axít amin mã hóa cho hai protein của HBV mà chức
năng của chúng là tham gia vào các giai đoạn phiên mã và sao chép trong quá
trình nhân đôi của HBV, cũng như đóng một vai trò chủ yếu trong sự phát
triển thành ung thư gan trên bệnh nhân.
Sự thay đổi trình tự của các nucleotide trên gen S dẫn đến sự thay đổi
trong quá trình dịch mã và sao chép trong gen của HBV, dẫn đến có các sự
khác biệt về cấu trúc tại vùng vỏ và bề mặt của HBV là nguyên nhân tạo
thành 6 kiểu gen khác nhau của virus này [37].


9
1.1.3.3. Thành phần cấu trúc kháng nguyên
HBV có ba loại kháng nguyên chính: kháng nguyên bề mặt là HBsAg,
kháng nguyên lõi là HBcAg và HbeAg [15], [43].
HBsAg (Hepatitis B surface antigen) được tìm thấy ở huyết thanh và
trong tế bào gan của người bị nhiễm HBV dưới dạng hoàn chỉnh hay không
hoàn chỉnh. Kháng nguyên bề mặt này có hai dạng hình cầu và hình ống.
Thành phần cấu tạo của hai dạng này gồm protein, lipid, carbonhydrat, nhưng
không có acid nucleic nên được xem là dạng không hoàn chỉnh của HBV.
HBsAg là chỉ điểm huyết thanh học thường được dùng để xác định nhiễm
HBV [15], [43].

Hình 1.6: Tiểu thể nhỏ hình cầu (A) và hình ống (B) của HBV [15]
HBsAg xuất hiện rất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao
dần và biến mất sau 4-8 tuần kể từ khi có triệu chứng. Nếu sau 6 tháng mà
vẫn còn HBsAg thì có nguy cơ chuyển thành người mang HBsAg mạn

25nm quá nhỏ so với kích cỡ của các hạt lõi là 36nm. Tuy nhiên, hạt lõi có
thể vận chuyển bộ gen virus đến phức hợp lỗ nhân nếu nó bị phosphoryl hóa.
Vì kích cỡ của hạt lõi lớn nên sự phóng thích bộ gen sau đó phải xảy ra khi bộ
gen của virus vào nhân, có thể qua trung gian của polymerase virus nối đồng
hóa trị [3].


11

Hình 1.7: Chu trình nhân lên của HBV trong tế bào gan [23]
Sự biểu hiện các gen của virus thông qua ít nhất hai bản phiên mã
không qua xử lí ghép nối. Không có protein nào được mã hóa bởi mạch
dương. Sau khi cởi bỏ vỏ capsid, HBV DNA kép với 2 sợi không bằng nhau
được chui vào nhân và chuyển thành dạng cccDNA. Dạng này được dùng làm
khuôn để tổng hợp 4 loại RNA với các kích thước khác nhau 3,5; 2,4; 2,1; và
0,7Kb. Trong đó, mRNA 3,5Kb gọi là RNA tiền genome, dùng làm khuôn để
tổng hợp bộ gen. Các mRNA còn lại được gọi là dưới genome, dùng để tổng
hợp các protein khác nhau trong đó có DNA polymerase (P), protein lõi C và
preC, polypeptide X, protein bề mặt S và protienkinase. Các mRNA này được
gắn đuôi và di chuyển ra tế bào chất [13].


12
Polypeptide tiền lõi được vận chuyển đến mạng lưới nội chất, từ đó
chúng được tiết ra ngoài dưới dạng kháng nguyên tiền lõi (HBeAg). RNA tiền
genom được đóng gói cùng với HBV DNA polymerase và proteinkinase để
tạo thành hạt lõi. Trong quá trình nhân lên, virus luôn tổng hợp thừa protein
vỏ nên trong huyết thanh người bị nhiễm HBV, ngoài hạt virus hoàn chỉnh
(hạt Dane) còn xuất hiện các dạng không hoàn chỉnh hình cầu, hình que hoặc
hình sợi [23].

22% B, 31% C, 10% D và 2% E-F). Các dữ liệu gần đây cho thấy kiểu gen
của HBV cũng đóng vai trò quan trọng trong tiến triển của bệnh gan do HBV
[20], [21], [33], [35].
Sự khác nhau giữa các kiểu gen của HBV chính là sự khác nhau hơn
8% trong trình tự của các nucleotid trên DNA của HBV. Sự phân bố của các
kiểu gen khác nhau tùy thuộc các vùng địa lý khác nhau. Kiểu gen A thường
gặp ở các nước ở tây bắc châu Âu, phía nam Sahara, Ấn Độ và Mỹ. Kiểu gen
B và C thường gặp ở các nước Đông nam châu Á, Nhật Bản và các nước ở
Thái bình dương. Kiểu gen D thường gặp ở các nước vùng Địa trung hải.
Kiểu gen E thường thấy gặp ở một số nước tại châu Phi. Kiểu gen F thường
gặp tại một số nước ở trung và nam châu Mỹ [38].
Bảng sau mô tả sự phân bố kiểu gen HBV của một số tác giả trong
nước và các nước trong khu vực [1].
Bảng 1.1. Sự phân bố kiểu gen HBV của một số tác giả trong nước
và các nước trong khu vực [1]
Tác giả

Kiểu
gen A

Kiểu
gen B
56%

Kiểu
gen C
44%

0,8%


6%
87%


14
Mức độ nặng của bệnh cũng như sự tiến triển sang viêm gan B mạn
tính trong các nghiên cứu trên cho thấy có sự giống nhau ở kiểu gen B và C.
Theo tác giả Norio Akuta thì sự tiến triển sang xơ gan và ung thư gan trên
bệnh nhân nhiễm HBV chiếm tỷ lệ 63% đối với kiểu gen C và 16% ở kiểu
gen D và cũng theo tác giả này thì tại Tokyo trong 57 trường hợp viêm gan B
cấp thì kiểu gen A chiếm 22,8%, B là 14%, C là 43,9%, D và F chỉ chiếm
1,8%, trong đó có 15,8% không xác định được kiểu gen, còn trong 1.077
trường hợp viêm gan B mạn tính kiểu gen C chiếm một tỷ lệ cao là 87,7%.
Tiếp theo là B với 9,4% còn A là 1,9%, kiểu gen D và F chỉ chiếm 0,2%, có
0,6% không xác định được kiểu gen. Cũng theo tác giả này thì biến chứng
nặng trên các bệnh nhân viêm gan mạn thường hay gặp trên các bệnh nhân
mang HBV kiểu gen B và C, đặc biệt xơ gan và ung thư gan gặp trên các bệnh
nhân mang HBV kiểu gen C hơn kiểu gen B [36].
Một nghiên cứu khác của Xin Ding tại Trung quốc thì kiểu gen C
chiếm tỷ lệ cao nhất lên đến 80% các kiểu gen còn lại lần lượt là: kiểu gen A
(3%). Kiểu gen B (5,5%), kiểu gen D (0,5%) và kiểu gen B + C là 4,4% còn
3,3 % không xác định được kiểu gen [48].
Mối tương quan giữa kiểu gen và mức độ trầm trọng của bệnh cũng đã
được nhiều báo cáo đề cập trong những năm gần đây. Kiểu gen nhiễm được
cho là gắn mật thiết với tình trạng âm ỷ của bệnh (thông qua việc đánh giá hai
chỉ tiêu HBcAg, HBeAg); quá trình bệnh sinh của gan, sự trốn thoát khỏi hệ
thống miễn dịch, sự đáp ứng thuốc điều trị và kháng thuốc điều trị virus [31].
Một nghiên cứu khác ở Nhật bản thực hiện trên 585 bệnh nhân viêm
gan mạn cũng chỉ ra rằng những người nhiễm kiểu gen B có sự tiến triển sang
xơ gan chậm hơn kiểu gen C [42].

Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và dùng trong việc xác định
kiểu gen HBV như giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay),… Phương pháp