BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
-----------------

ĐỖ THỊ THÙY DƯƠNG

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS GÂY VIÊM
GAN SIÊU VI B (HEPATITIS B VIRUS-HBV) VÀ
MỐI LIÊN QUAN GIỮA KIỂU GEN VỚI MỘT
SỐ ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG, CẬN LÂM
SÀNGTRÊN BỆNH NHÂN NHIỄM HBV TẠI
ĐẮK LẮK
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

BUÔN MA THUỘT, NĂM 2010


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC TÂY NGUYÊN
-----------------

ĐỖ THỊ THÙY DƯƠNG

XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS GÂY VIÊM GAN
SIÊU VI B (HEPATITIS B VIRUS-HBV) VÀ MỐI LIÊN
QUAN GIỮA KIỂU GEN VỚI MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM
LÂM SÀNG, CẬN LÂM SÀNG TRÊN BỆNH NHÂN
NHIỄM HBV TẠI ĐẮK LẮK
Chuyên nghành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60.42.30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

tôi tiến hành ñề tài “Xác ñịnh kiểu gen của virus gây viêm gan siêu vi B (HBV)
và mối liên quan giữa kiểu gen với một số ñặc ñiểm lâm sàng, cận lâm sàng
trên bệnh nhân nhiễm HBV tại Đắk Lắk ”.


2

2. Mục tiêu nghiên cứu của ñề tài
- Xác ñịnh các kiểu gen (genotype) của virus gây viêm gan siêu vi B trên
các bệnh nhân nhiễm virus gây viêm gan siêu vi B (HBV) tại khu vực tỉnh Đắk
Lắk.
- Xác ñịnh mối liên quan giữa các kiểu gen của virus HBV với một số ñặc
ñiểm lâm sàng và cận lâm sàng trên bệnh nhân.
3. Ý nghĩa khoa học
Bằng việc hỗ trợ của các kỹ thuật sinh học phân tử trong chẩn ñoán y
khoa, có thể ñịnh danh ñược ñến kiểu gen của virus HBV với ñộ nhạy cao và ñộ
ñặc hiệu tuyệt ñối. Kết quả nghiên cứu giúp chúng ta hiểu rõ hơn về bệnh, các
ñặc thù nhiễm virus HBV của công ñồng dân cư khu vực tỉnh Đắk Lắk. Đây
cũng là tiền ñề ñể phát triển nghiên cứu ở mức cao hơn, mang tầm vóc của một
nghiên cứu dịch tễ học phân tử bệnh nhiễm virus HBV ở khu vực Tây nguyên.
4. Ý nghĩa thực tiễn
Kết quả nghiên cứu sẽ chỉ ra ñược các kiểu gen của HBV ở những bệnh
nhân nhiễm HBV khu vực tỉnh Đắk Lắk, ñiều này rất quan trọng trong công tác
ñiều trị, quản lý và phòng chống bệnh viêm gan siêu vi B trên ñịa bàn tỉnh.


3

Chương 1


thường này, hệ miễn dịch sẽ tấn công kẻ xâm lược. Nếu “cuộc chiến” thắng lợi,
tế bào gan tổn thương sẽ ñược thay thế bằng những tế bào khỏe mạnh và bệnh
nhân sẽ phục hồi. Nhưng ở một số người hệ miễn dịch không loại trừ ñược virus
và họ trở thành người mang virus viêm gan B mạn tính. Khoảng 10% số người
nhiễm virus B rơi vào trường hợp này. Trong các trường hợp xấu nhất, các tế
bào gan bị virus phá hoại bị thay thế bằng các mô sợi bất thường, dẫn ñến ung
thư gan và xơ gan.
Trên bản ñồ dịch tễ của tổ chức Y tế Thế giới, tỷ lệ dân số Việt Nam
mang kháng nguyên HBsAg (chứng tỏ nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng
quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế giới. Nhận ñịnh này cũng ñược một số
công trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngoài nước xác nhận. Tuy rằng
không phải tất cả các trường hợp nhiễm HBV ñều cần phải ñặt ra vấn ñề phải
ñiều trị vì ña số bệnh nhân ñều có thể tự khỏi nhờ cơ thể có thể tạo ra ñáp ứng
miễn dịch bằng kháng thể bảo vệ là kháng thể kháng kháng nguyên bề mặt của
virus. Tuy nhiên vẫn có một tỷ lệ người nhiễm HBV cần phải ñược ñiều trị ñặc
hiệu bằng thuốc kháng virus một khi có dấu hiệu viêm gan mạn tính và lượng
virus tăng cao [6].
1.1.3. Dịch tễ học của bệnh viêm gan siêu vi B
Hiện nay, theo thống kê của các tổ chức Y tế Thế giới (WHO), ước tính
có khoảng 2 tỷ người bị nhiễm HBV, trong ñó có khoảng 350 triệu người mang
mầm bệnh mạn tính. Viêm gan siêu vi B thường là nguyên nhân dẫn ñến viêm
gan mạn, xơ gan và ung thư gan nguyên phát với tỷ lệ tử vong là 1-2 triệu người.
Tình hình nhiễm HBV thay ñổi theo từng khu vực ñịa dư. Tùy theo tỷ lệ
người mang HBsAg (+) mà người ta chia làm 3 khu vực chính:


5

1.1.3.1. Vùng nội dịch lưu hành cao (high endemic area)
Tỷ lệ HBsAg (+) vào khoảng 5-20% như khu vực Đông Nam Á, Trung

B. Tiếp theo ñó, kháng nguyên Australia ñã ñược chứng minh là ñại diện cho các
quyết ñịnh kháng nguyên bề mặt của HBV, vì vậy ñược thay thế bằng thuật ngữ
“kháng nguyên bề mặt virus viêm gan virus B” (Hepatitis B surface Antigen), ký
hiệu HBsAg. Năm 1970, nghiên cứu dưới kính hiển vi ñiện tử Dane ñã mô tả hạt
virus HBV hoàn chỉnh, ñược gọi là hạt Dane.
HBV thuộc họ Hepadnaviridae. Cấu trúc của lõi (core) của HBV là một
DNA mạch ñôi không khép kín, với trọng lượng phân tử 2×106 dalton, ñược cấu
tạo bởi 3200 nucleotide. Vỏ capsid hình hộp có kích thước khoảng 27 nm, vỏ
bao ngoài (precore) cấu tạo bởi 3 protein cấu trúc là prôtêin lớn, prôtêin trung
bình và prôtêin nhỏ dày khoảng 7 nm. Vỏ bao tạo cho virus có hình cầu ñường
kính 42 nm (hạt Dane) [5],[10].

Hình 1.1. Sơ ñồ cấu trúc của hạt Dane [10]


7

1.2.1. Thành phần cấu trúc kháng nguyên
HBV có 2 loại kháng nguyên chính: kháng nguyên bề mặt là HBsAg,
kháng nguyên lõi là HBcAg và HBeAg.
HBsAg: ñược tìm thấy ở huyết thanh và trong tế bào gan của người bị
nhiễm HBV dưới dạng hoàn chỉnh hay không hoàn chỉnh. Kháng nguyên bề mặt
này có hai dạng hình cầu và hình ống. Ống phần cấu tạo của hai dạng này gồm
prôtêin, lipid, cacbohidrat, nhưng không có acid nucleic nên ñược xem là dạng
không hoàn chỉnh HBV. HBsAg là chỉ ñiểm huyết thanh học thường ñược dùng
ñể xác ñịnh nhiễm HBV.
HBsAg xuất hiện rất sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao dần
và biến mất sau 4-8 tuần kể từ khi có triệu chứng. Nếu sau 6 tháng mà vẫn còn
HBsAg thì có nguy cơ chuyển thành người mang HBsAg mạn tính.
Sự hiện diện của HBsAg trong huyết thanh chứng tỏ có DNA của virus

hóa cho HBeAg và vùng C (183 aa) mã hóa cho HBcAg.
- Gen P (832 aa) là gen dài nhất mã hóa cho DNA polymerase và cùng với
RNA trung gian tham gia vào quá trình sao chép ngược của virus.
- Gen X gồm 154 aa mã hóa cho hai protein của HBV mà chức năng của
chúng là tham gia vào các giai ñoạn phiên mã và sao chép trong quá trình nhân


9

ñôi của HBV, cũng như ñóng một vai trò chủ yếu trong sự phát triển thành ung
thư gan trên bệnh nhân [10], [42].
Sự thay ñổi trình tự của các nucleotide trên gen S dẫn ñến sự thay ñổi
trong quá trình dịch mã và sao chép trong gen của HBV, dẫn ñến có các sự khác
biệt về cấu trúc tại vùng vỏ và bề mặt của HBV là nguyên nhân tạo thành 8 kiểu
gen khác nhau của virus này.
1.2.3. Sự ñột biến trên gen của HBV
Sự thay ñổi trình tự các nuclêotide trên gen S dẫn ñến sự thay ñổi trong
quá trình dịch mã và sao chép trong gen của HBV, dẫn ñến có sự khác biệt về
cấu trúc tại vùng vỏ và bề mặt của HBV là nguyên nhân tạo thành 8 kiểu gen
(genotype) khác nhau (ñược ký hiệu từ A- H) của virus này. Đặc biệt hai vùng
gen Pre S1 và PreS2 mã hóa cho sự tạo thành kháng nguyên bề mặt HBsAg, nếu
sự ñột biến xảy ra ở ñây có thể dẫn ñến sự vắng mặt của HBsAg trong huyết
thanh của bệnh nhân nhiễm HBV, ñây là nguyên nhân dẫn ñến sự sai lệch kết
quả trong các xét nghiệm nhanh phát hiện HBsAg trong chẩn ñoán huyết thanh
miễn dịch, ñiều này làm tăng nguy cơ lan truyền của HBV trong cộng ñồng.
Tại vùng gen S với hai alen, một trong hai alen này mã hóa cho thành
phần cấu trúc a là một thành phần cấu trúc không ñổi giữa các HBV, alen còn lại
thay ñổi mã hóa cho bốn thành phần cấu trúc là: r, d, w và y. Sự ñột biến xảy ra
trên vùng gen S có thể dẫn tới các HBV vacxin và HBIg bị mất tác dụng. Ngoài
ra còn có giả thiết cho rằng sự ñột biến trên gen S làm tăng tỷ lệ a/w ñây ñược

hoặc nặng hơn kết hợp với vàng da. Trong trường hợp ñiển hình, gồm ñau ñầu,
mệt mỏi, chán ăn, buồn nôn và nôn, sốt nhẹ (37,5-390C) là những dấu hiệu sớm
xuất hiện 2-7 ngày trước khi vàng da trong các trường hợp có vàng da. Đầy bụng
hoặc ñau cư trú ở hạ sườn phải hay gặp. Nước tiểu trở nên sẩm màu và phân thì
lại nhạt màu hơn. Ngứa nhẹ gặp ở những ngày sau và chỉ có trong ít ngày ở 50%
trường hợp, ñau khớp 10-20% số bệnh nhân.


11

Gan to (tới 15cm ño theo ñường vú), nhu mô ñều, ít khi thấy gan rất to.
Lách có thể sờ ñược ở 15% số bệnh nhân.
Có thể sờ thấy hạch to, nhất là vùng sau cổ. Dấu sao mạch sưng vú nhất
thời. Trong thời gian toàn phát, dấu hiệu rối loạn tiêu hóa vẫn tồn tại. Tuy nhiên
các biểu hiện nặng như mệt lả, gan nhỏ, lách to, phù chi và hôn mê chỉ gặp ở một
số trường hợp ở thể kéo dài. Đây cũng là các dấu hiệu giúp thầy thuốc thực hành
có những dự ñoán về tiên lượng viêm gan siêu vi B cấp.
Khi bắt ñầu thấy ăn ngon, tiểu nhiều, vàng da, vàng mắt giảm dần là lui
bệnh. Trẻ nhỏ hồi phục sau 2 tuần còn người lớn từ 4-6 tuần. Trong thời kỳ hồi
phục, dấu hiệu mệt mỏi và chán ăn có thể kéo dài nhiều tháng sau.
Với các dấu hiệu lâm sàng không ñặc hiệu, các dấu hiệu sinh học mang
tính hướng dẫn, muốn xác ñịnh chắc chắn viêm gan siêu vi B phải dựa vào các
chỉ ñiểm huyết thanh học và chẩn ñoán virus học.
* Các thể lâm sàng của viêm gan siêu vi B
- Thể không triệu chứng: 80-90% các trường hợp nhiễm trùng HBV là
không có triệu chứng.
- Thể vàng da thông thường: có một giai ñoạn ủ bệnh 50-150 ngày. Giai
ñoạn tiền hoàng ñản không ổn ñịnh, giao ñộng 5-15 ngày, kết quả với một số
triệu chứng như ñau ñầu, ñau cơ, ñau khớp, mệt mỏi, nổi mày ñay, rối loạn tiêu
hóa (chán ăn, buồn nôn, ñau bụng) và sốt vừa (38-38,50C).

thấy ngay từ ñầu.
- Thể viêm gan ở người có suy giảm miễn dịch: những bệnh suy giảm
miễn dịch (ADIS, bệnh máu ác tính, hóa trị liệu chống ung thư) nói chung có
những biểu hiện không ñiển hình, thường không có vàng da, nhưng nguy cơ
mang HBV mạn và bị viêm gan rất cao[5].


13

1.3.2. Viêm gan siêu vi B mạn
* Viêm gan mạn tồn tại:
Thường không có triệu chứng, có thể ñi kèm với mệt mỏi, chán ăn, ñau
tức nhẹ vùng hạ sườn phải.
Thăm khám bình thường hoặc có vẻ thấy gan to nhẹ. Tiên lượng nói
chung tốt, với những thương tổn tồn tại không tiến triển. Tuy nhiên, có thể tiến
triển thành viêm gan mạn hoạt ñộng, nhất là nếu vẫn có sự nhân lên của virus.
* Viêm gan mạn hoạt ñộng:
Thường có mối tương ứng giữa các biểu hiện lâm sàng, dấu sinh học và tổ
chức học.
Các dấu hiệu lâm sàng gồm mệt mỏi, ñau hạ sườn phải, vàng da và ngứa
khi có ứ mật nhiều. Biểu hiện tăng áp lực tĩnh mạch cửa (cổ trướng, xuất huyết
tiêu hóa) xuất hiện ngay khi không có xơ gan. Khám thấy gan chỉ có to vừa, ñôi
khi ñau, có thể thấy lách to.
Tiến triển theo hướng nặng lên, hoặc thành ñợt dẫn tới xơ gan sau nhiều
năm tiến triển [5].
1.4. Chu kỳ sinh sản của HBV trong cơ thể
Thông thường DNA của những virus ñược sao chép trực tiếp ñể trở thành
những phân tử DNA mới, nhưng ñối với virus viêm gan B, có bước sao chép
trung gian qua mARN. Trước tiên virus vào tế bào gan, giải phóng khỏi lớp vỏ,
rồi sau ñó thoát khỏi lớp capside. DNA của virus ở trong nhân tế bào gan nhưng

theo sau. Khả năng lây nhiễm cao nhất trong giai ñoạn sớm của nhiễm trùng là
do ñộ tập trung cao của virus trong máu (1010 hạt virus/ml). Rất hiếm khi phát
hiện ñược HBcAg tự do trong huyết thanh.
Sự tăng nồng ñộ IgM Anti-HBc xuất hiện ñồng thời với sự tăng Amino
alanin transferase (ALT). Do kháng thể này ñược sản xuất khi có sự tổng hợp
của Nucleocapside của virus, sự xuất hiện của Anti-HBcIgM trong huyết thanh
phản ánh ñang có sự nhân lên của virus và bệnh ñang ở giai ñoạn cấp. Kháng thể


15

Anti-HBcIgM mất ñi trong giai ñoạn hồi phục, kháng thể HBc IgG nói chung tồn
tại rất lâu dài. Trong giai ñoạn sớm của thời kỳ hồi phục và trước khi HBsAg
biến mất, Anti-HBe xuất hiện thay thế HBeAg mất ñi, chỉ ra sự tiến triển tốt của
bệnh.
Dưới 5% trường hợp viêm gan siêu vi B cấp có biểu hiện nặng như hoại
tử gan cấp, HBsAg có thể không phát hiện ñược. Xét nghiệm huyết thanh có thể
thấy Anti-HBc IgM (có hoặc không có Anti-HBe) như một chỉ ñiểm về sự hoạt
ñộng nhân lên của virus.
Kết thúc của nhiễm HBV là sự biến mất của HBsAg và xuất hiện AntiHBs (chuyển ñổi huyết thanh). Kháng thể Anti-HBs thường ñược phát hiện sau
HBsAg 2-8 tuần.
Khoảng 30-50% bệnh nhân không phát hiện ñược Anti-HBe sau 6 tháng.
Sự xuất hiện của các dấu ấn HBeAg, DNA của HBV (ñược xác ñịnh bằng kỹ
thuật PCR) tùy thuộc vào giai ñoạn nhân lên của virus.
Trong quá trình nhân lên của virus-giai ñoạn hoạt ñộng : HBeAg và DNA
của HBV(HBV-DNA) xuất hiện, không có Anti-HBe. Ở giai ñoạn sau, HBVDNA giảm xuống và biến mất khi có sự chuyển ñổi huyết thanh ñối với HBe
(xuất hiện Anti- HBe và biến mất HBeAg).
Trong giai ñoạn viêm gan không hoạt ñộng, Anti- HBe xuất hiện và các
dấu ấn khác biến mất.
Giai ñoạn tái hoạt ñộng có sự xuất hiện trở lại trong huyết thanh của


Kiểu

gen A

gen B

gen C

gen D

gen F

38,8%

53,8%

56%

44%

63,6%

17,4%

45%

38,7%

81%

17

không xác ñịnh ñược kiểu gen, còn trong 1.077 trường hợp viêm gan B mạn tính
kiểu gen C chiếm một tỷ lệ cao là 87,7%. Tiếp theo là B với 9,4% còn A là
1,9%, kiểu gen D và F chỉ chiếm 0,2%, có 0,6% không xác ñịnh ñược kiểu gen.
Cũng theo tác giả này thì biến chứng nặng trên các bệnh nhân viêm gan mạn
thường hay gặp trên các bệnh nhân mang HBV kiểu gen B và C, ñặc biệt xơ gan
và ung thư gan gặp trên các bệnh nhân mang HBV kiểu gen C hơn kiểu gen B
[31].
Dưới ñây là một số các kết quả nghiên cứu của một số tác giả tại châu Á [10]:
Quốc gia

Biểu hiện lâm sàng

Kiểu gen của HBV

Hồng Kông

Nhiễm HBV

Kiểu gen B nhiều hơn C

Nhật

Nhiễm HBV

Kiểu gen B nhiều hơn C

Đài Loan



Biến chứng ñến xơ gan và
UTGNP
Kháng thuốc ñiều trị
Lamivudine
Kháng thuốc ñiều trị
Lamivudine
Kháng thuốc ñiều trị
Lamivudine
Đáp ứng Lamivudine

Thường gặp ở kiểu gen B hơn C

Gặp kiểu gen B & C

Gặp kiểu gen B & C

Gặp kiểu gen B & C
Kiểu gen B nhiều hơn C


18

Một nghiên cứu khác của Xin Ding tại Trung quốc thì kiểu gen C chiếm
tỷ lệ cao nhất lên ñến 80% các kiểu gen còn lại lần lượt là: kiểu gen A (3%).
Kiểu gen B (5,5%), kiểu gen D (0,5%) và kiểu gen B + C là 4,4% còn 3,3 %
không xác ñịnh ñược kiểu gen [43].
Mối tương quan giữa kiểu gen và mức ñộ trầm trọng của bệnh cũng ñã
ñược nhiều báo cáo ñề cập trong những năm gần ñây. Kiểu gen nhiễm ñược cho
là gắn mật thiết với tình trạng âm ỷ của bệnh (thông qua việc ñánh giá hai chỉ