XÁC ĐỊNH KIỂU GEN VI RÚT VIÊM GAN B
VÀ CÁC ĐỘT BIẾN KHÁNG THUỐC BẰNG
KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ CHUỖI

I, NHỮNG TIẾN BỘ CỦA XÉT NGHIỆM TRONG CHẨN ĐOÁN BỆNH
VIÊM GAN SIÊU VI B
Mặc dù chương trình tiêm ngừa vi rút viêm gan B (HBV) đã làm giảm đáng kể tỷ
lệ bệnh viêm gan do vi rút B, nhưng HBV vẫn còn là một “tên sát nhân giấu mặt”
vì đôi khi triệu chứng của bệnh rât mơ hồ làm cho ta lầm tưởng với một trường
hợp rối loạn tiêu hóa hay gặp, và đa số trường hợp không có triệu chứng lâm sàng
ở những trường hợp viêm gan vi rút B mãn tính mà chỉ có xét nghiệm máu chúng
ta mới chẩn đoán được bệnh. Do đó, vai trò của xét nghiệm trong chẩn đoán viêm
gan do vi rút B giữ một vai trò cực kỳ quan trọng. Có nhiều loại xét nghiệm khác
nhau được xử dụng trong chẩn đoán viêm gan vi rút B, mỗi loại có một ý nghĩa
khác nhau tùy vào từng giai đoạn của bệnh mà người bác sĩ sẽ lựa chọn xét
nghiệm thích hợp.
Có 5 xét nghiệm hay được dùng trong chẩn đoán, đánh giá vi rút viêm gan siêu vi
B trước đây là HBsAg, AntiHBs, HBeAg, AntiHBe, AntiHBc IgM và AntiHBc
IgG. Các xét nghiệm này là những xét nghiệm cơ bản, dùng phương pháp miễn
dịch để phát hiện nhưng vẫn có một số hạn chế.
Vào những năm cuối thế kỷ 20, kỹ thuật sinh học phân tử ra đời và có tốc độ phát
triển nhanh chóng đã mở ra một kỷ nguyên mới về chẩn đoán gen nên chúng ta đã
có thể chẩn đoán được vi rút viêm gan B ở mức độ phân tử (Đó là các xét nghiệm
phân tích trên phân tử di truyền của HBV là DNA). Nhờ ứng dụng các kỹ thuật về
phân tích DNA của HBV mà chúng ta có thể giải quyết được các hạn chế của các
kỹ thuật miễn dịch kinh điển cũng như phân tích DNA vi rút giúp chúng ta có
những cơ sở đánh giá tình trạng bệnh, khả năng diễn tiến của bệnh, theo dõi điều
trị bệnh và lựa chọn phương thuốc điều trị thích hợp. Cho đến nay chúng ta có thể
thực hiện được một số xét nghiệm sinh học phân tử ở HBV như sau:
F Xác định được tình trạng đang tăng sinh của vi rút trong những trường hợp có
đột biến ở vùng trước lõi (Pre Core) để từ đó có quyết định điều trị đặc trị không.

HBV đã được xác định (Từ A đến H) dựa vào sự khác nhau trên 8% của toàn bộ
trình tự chuỗi của bộ gen HBV, và sự phân bố của các kiểu gen khác nhau ở các
châu lục, các nước khác nhau.
Tuy nhiên sự phân loại các HBV genotypes có thể chỉ cần dựa trên trình tự chuỗi
(sequence) của một đoạn gen nào đó của HBV như trên một phần trình tự chuỗi
của gen pre-S; S. Có nhiều phương pháp đã được nghiên cứu và dùng trong việc
xác định HBV genotypes như giải trình tự chuỗi (sequencing), RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism), LiPA (Line Probe Assay), phản ứng miễn dịch
men (Enzyme-linked Immunoassay). Mỗi phương pháp có những ưu và nhược
điểm khác nhau, tuy nhiên phương pháp giải trình tự chuỗi có thể xem như có
nhiều ưu điểm nổi bật vì bên cạnh việc xác định được trình tự chuỗi các
Nucleotids trong bộ gen của HBV để từ đó so sánh với thư viện gen và xác định
được HBV genotypes mà còn dựa vào kết quả giải trình tự này chúng ta có thể xác
định được một số dạng đột biến kháng thuốc của HBV để từ đó có phát đồ điều trị
tối ưu.
Hiên nay, tại trung tâm y khoa MEDIC TP Hồ chí Minh xử dụng hệ thống giải
trình tự Trugen của hãng Bayer (Đức). Đây là hệ thống giải trình tự xác định được
cùng một lúc kiểu gen và các đột biến kháng thuốc của HBV và lần đầu tiên xử
dụng như một xét nghiệm thường qui. Ngoài HBV, hệ thống này còn dùng cho xác
định kiểu gen vi rút viêm gan C (HCV genotype) cũng như xác định các đột biến
kháng thuốc vủa HIV.
1, KHÁI NIỆM VỀ CẤU TRÚC PHÂN TỬ DNA:

Nguyên tắc bổ sung trong cấu tạo phân tử DNA: DNA là một chuỗi xoắn kép, hai
mạch đơn được nối với nhau bằng liên kết Hydro. Mối liên kết này có thể bị phá
vỡ bởi nhiệt độ cao (Thường là trên 90 o C, và ứng dụng thực tế là 94 o C), làm
cho phân tử DNA biến thành 2 mạch đơn. Có 4 loại Nucleotid (Nu ) căn bản cấu
tạo nên DNA: A(Adenine), T(Thymine), G(Guanine), C(Cytosine).

Và ở phân tử RNA là A, U, G, C. Các Nu này bắt cặp với nhau theo nguyên tắc

SEQUENCING TRUGENE
Để thực hiện được kỹ thuật giải trình tự chuỗi, chúng ta phải thực hiện 3 bước
chính sau: (1) Thực hiện PCR; (2) Thực hiện phản ứng cắt; (3) Điện di và phân
tích kết quả.

3.1, THỰC HIỆN PCR.
Để khuếch đại gene của HBV ta dùng kỹ thuật PCR. Mục đích của giai đoạn này
là khuếch đại đoạn gen đặc hiệu cho HBV có ở trong máu bệnh nhân: Từ một
phân tử ban đầu thành hàng tỷ bản sao DNA, từ đó mới thực hiện được giải trình
tự chuỗi của HBV. Đây là giai đoạn quan trọng, quyết định cho sự thành công khi
thực hiện giải trình tự chuỗi.
Kỹ thuật này gồm có 4 bước chủ yếu sau đây (Theo thứ tự từng bước thực hiện):
1, Lấy mẫu, bảo quản mẫu & cách gửi mẫu.
2, Ly trích và tinh sạch DNA của HBV.
3, Khuếch đại DNA vi rút bằng phản ứng PCR trong máy luân nhiệt.
4, Kiểm tra & phát hiện sản phẩm khuếch đại (Amplicon) trên gel Agarose.
Sau đây là chi tiết và ý nghĩa của mỗi bước thực hiện.
3.1.1, Lấy mẫu, bảo quản mẫu & cách gửi mẫu.
Yêu cầu của mẫu máu:
Serum, plasma (tuyệt đối không dùng Heparin)
Tách serum hoặc plasma trong vòng 4 giờ sau khi lấy máu
Nếu chưa thực hiện ly trích DNA thì mẫu phải được lưu ở –20oC. Nếu gửi mẫu
phải giữ mẫu trong đá khô là tốt nhất.
Tránh hiện tượng phải rả đông mẫu máu nhiều lần.
Máu tĩnh mạch, lấy lúc đói và buổi sáng là tốt nhất
Dụng cụ lấy máu: Vô trùng, loại dùng một lần, thao tác đúng nguyên tắc vô trùng,
có bao tay.
3.1.2, Ly trích và tinh sạch DNA của HBV.
Phương pháp ly trích của chúng tôi chọn là hấp thụ DNA lên các hạt silica, rửa
bằng Ethenol 70%.

nên một mạch đơn mới bổ sung với mạch đơn cũ. Và một bản sao DNA mới đã
được hình thành. Như vậy, sau giai đoạn này ta có được hai phân tử DNA có cấu
trúc giống hệt như phân tử DNA ban đầu.
Cả ba giai đoạn biến tính, bắt cặp và kéo dài thuộc một chu kỳ của khuếch đại
DNA. Như vậy, sau mỗi chu kỳ khuếch đại thì từ một phân tử DNA ban đầu sẽ
thành 2 phân tử DNA giống hệt nhau, và sau 30 chu kỳ khuếch đại sẽ có khoảng
230 phân tử DNA giống hệt nhau (Khoảng 1 tỷ DNA). Như vậy khi số lượng
DNA trong mẫu là vài triệu thì chỉ sau 30 chu kỳ khuếch đại (Thời gian khoảng 2-
3 giờ) ta đã có hàng nghìn tỷ bản sao, lượng DNA này đủ để ta làm phản ứng cắt
cho giải trình tự chuỗi.
Hình minh họa giai đoạn kéo dài: 3.1.4, Kiểm tra & phát hiện sản phẩm khuếch đại (Amplicon) trên gel Agarose.
Sau khi đã thực hiện phản ứng PCR, ta điện di trên gel agarose 2%, mục đích chủ
yếu của bước này là xem có sản phẩm của PCR không và đánh giá kích thước của
sản phẩm khuếch đại có đúng là đoạn dài như ta đã biết (Có nghĩa là có bắt cặp
của primer và chiều dài của amplicon đúng cho HBV).
3.2, THỰC HIỆN PHẢN ỨNG CẮT (CLIP).
Về nguyên tắc của phản ứng này giống hệt phản ứng PCR (Cũng gồm có 3 bước:
Biến tính, bắt cặp và kéo dài). Tuy nhiên có một điểm khác biệt cực kỳ căn bản là
thành phần các Nu trong Clip buffer để khuếch đại ngoài A, T, G, C còn có thêm
dd Nucleotides. Như vậy trong ống nghiệm của phản ứng clip sẽ có các thành
phần sau:
DNA đích cần cho phản ứng clip
2 cặp mồi chuyên biệt.
A, C, G, T Deoxynucleotides Triphosphate
A, C, G, T DiDeoxynucleotides Triphosphate
DNA Polymerase
Trong giai đoạn kéo dài của phản ứng clip (Giống giai đoạn kéo dài của phản ứng

Không giống như kiểu gen của vi rút viêm gan C, vai trò của kiểu gen vi rút viêm
gan B cho đến nay vẫn chưa được biết rõ ràng. Nhiều câu hỏi về vai trò của kiểu
gen HBV đã được đặt ra và các nhà chuyên môn vẫn đang cố gắng để trả lời:
(1) Có hay không sự liên quan giữa kiểu gen HBV và khả năng nhân đôi của vi
rút, hoạt tính của bệnh gan, sự khỏi bệnh, và đáp ứng với điệu trị.
(2) Kiểu gen nào chủ yếu ở các nước. Sự phân bố kiểu gen HBV theo các
vùng địa lý có liên quan với dịch tể nhiễm HBV.
(3) Anh hưởng của kiểu gen HBV trong diễn tiến đến viêm gan B mạn tính.
(4) Khi nhiễm với một kiểu gen này thì có được bảo vệ khỏi nhiễm với kiểu gen
khác không.
Cho đến hiện nay, các nghiên cứu về kiểu gen HBV vẫn còn rải rác, số liệu không
được nhiều cũng như các kết quả chưa được thống nhất hoàn toàn.
Kiểu gen HBV ở vùng Đông Nam Á, trong đó có Việt Nam, chủ yếu là kiểu gen B
và C. Có nhiều nghiên cứu cho thấy có mối liên quan giữa kiểu gen HBV và các
đột biến ở vùng Precore và Core Promoter: Kiểu gen B, C và D thường có đột biến
hơn kiểu gen A.
Về độ thanh thải HBeAg và kiểu gen HBV, các nghiên cứu trên bệnh nhân Châu Á
cho thấy ở kiểu gen B có sự thanh thải HBeAg cao hơn so với kiểu gen C.
Mối quan hệ giữa kiểu gen vi rút viêm gan B và diễn tiến của bệnh cũng được
nhiều nhà nghiên cứu quan tâm. Rối loạn chức năng gan hình như ít gặp ở kiểu
gen B so với kiểu gen C, và kiểu gen C thì thường gặp ở bệnh nhân xơ gan.
Vai trò của kiểu gen HBV và đáp ứng điều trị cũng được quan tâm. Trong điều trị
với Interferon, kiểu gen A có đáp ứng điều trị tốt nhất, kiểu gen B có đáp ứng điều
trị tốt hơn kiểu gen C. Đối với Lamivudine, kiểu gen B dễ phát triển kháng thuốc
hơn.
IV, CÁC ĐỘT BIẾN CỦA VI RÚT B
Hơn một thập kỷ nay, nhiều kiểu đột biến của HBV đã được nhận diện. Đa số các
đột biến này là thầm lặng hoặc không có một ý nghĩa lâm sàng nào, tuy nhiên có
một số đột biến có ý nghĩa trong quá trình diễn tiến của bệnh từ việc tiêm chủng
phòng ngừa (S escape mutants), diễn tiến tự nhiên của bệnh (Pre-core, Core

độ tương đồng là bao nhiêu so với gen gốc, và các đột biến đã được công bố của
HBV. Nhờ việc thực hiện xét nghiệm này, cho đến nay chúng ta có thể nói đã giải
quyết cơ bản những xét nghiệm cần thiết trong vấn đề chẩn đoán và điều trị HBV
Nhờ các kỹ thuật sinh học phân tử mà cho đến nay người bác sĩ có thể đánh giá và
biết chi tiết, toàn diện vi rút viêm gan B ở mỗi người bệnh nhân để từ đó có một
phác đồ điều trị tối ưu. Tuy nhiên, cuộc chiến chống lại vi rút viêm gan B vẫn
chưa có hồi kết, HBV cũng như mọi vi rút nói chung luôn luôn biến đổi cấu trúc di
truyền của nó để tránh được tác động của các thuốc đặc trị.