Định genotype và phát hiện đột biến YMDD kháng lamivudine của HBV bằng kỹ thuật giải trình
tự vùng gene rt của HBV
Phạm Hùng Vân*
(1)
, Nguyễn Thị Minh Thư
(2)
, Võ Đức Xuyên An
(2)
, Lê Thị Phi Yến
(2)
, Đỗ Thị Thanh Thủy
(1)

Tóm tắt
Đặt vấn đề: Thất bại trong điều trị nhiễm HBV bằng lamivudine là do virus có đột biến gần và/hay ngay tại YMDD
chính là vị trí tác động thuốc trên gene polymerase của HBV. Có 4 đột biến giúp HBV kháng lamuvidine đã được
chứng minh; đó là rtV173L, rtL180M, rtM204I/V, và rtV207I.
Mục tiêu nghiên cứu: Xây dựng kỹ thuật giải trình tự để định genotype HBV và phát hiện đột biến YMDD kháng
lamivudine của HBV
Phương pháp nghiên cứu: Các tác giả đã thiết kế được kỹ thuật PCR nhân bản một đọan DNA của gen rt và giải
trình tự đọan DNA này nhờ đó phát hiện được các đột biến trên. Ngòai ra, các tác giả cũng đã xây dựng được một
thư viện HBV-DNA để xác định được genotype của HBV khi truy cập đọan trình tự đã giải trên thư viện này.
Kết quả nghiên cứu: Áp dụng vào chẩn đóan, trong thời gian từ 10/7/2006 đến 7/10/2006, các tác giả đã giải được
trình tự 87mẫu huyết thanh lấy từ bệnh nhân nhiễm HBV đáp ứng kém với điều trị lamivudine, kết quả cho thấy 57
trường hợp thuộc genotype B, 30 trường hợp thuộc genotype C. Có 54% được ghi nhận có đột biến tại vị trí 204
và/hoặc 180 là hai đột biến quan trọng nhất được ghi nhận là giúp HBV kháng lamivudine. Xét về tần số các kiểu
gen đột biến; 2.3% (2/87) mang một kiểu gen đột biến với 1.1% (1/87) rtM204I, 1.1% rtM204Ih; 31% (27/87)
mang hai kiểu gene đột biến với 4.6% (4/87) rtL180M-rtM204V, 1.1% rtL180M-M204I, 9.2% (8/87) rtL180Mh-
rtM204I, 2.3% (2/87) rtL180Mh-rtM204Vh, 1.1% rtL180Mh-rtM204Ih, 3.4% (3/87) rtV173Lh-M204I, và 9.2%
rtV173Lh-rtM204Ih; 20.7% (18/87) mang ba kiểu gene đột biến với 1.1% rtV173L-rtL180M-rtM204V, 1.1%
rtV173Lh-rtL180M-rtM204I, 12.6% (11/87) rtV173Lh-rtL180M-rtM204V, 1.1% rtV173Lh-rtL180Mh-rtM204I,

and this high ratio may be came from the selectivity effect of the lamivudine treatment that occurs naturally or
because of the not-compliance of the treatment from the patients. However, with this situation, the physicians should
think to another antiviral drug to replace lamivudine for the treatment of patients with HBV infection.
Đặt vấn đề
1*
Tác giả chính,
()
Đại Học Y Dược,
(2)
Công ty Nam Khoa
1
Trên bản đồ dịch tễ của tổ chức y tế thế giới, tỷ
lệ dân số Việt Nam manh kháng nguyên HBsAg
(chứng tó nhiễm HBV) là trên 8%, xếp vào hàng
các quốc gia có tỷ lệ nhiễm HBV cao nhất thế
giới
[1]
. Nhận định này cũng được một số công
trình nghiên cứu về dịch tễ học trong và ngòai
nước xác nhận
[2,3,4]
. Tuy rằng không phải tất cả các
trường hợp nhiễm HBV đều cần phải được đặt ra
vấn đề phải điều trị vì đa số bệnh nhân đều có thể
tự khỏi nhờ cơ thể có thể tạo ra đáp ứng miễn dịch
bằng kháng thể bảo vệ là kháng thể kháng kháng
nguyên bề mặt của virus. Tuy nhiên vẫn có một tỷ
lệ người nhiễm HBV cần phải được điều trị đặc
hiệu bằng thuốc kháng virus một khi có dấu hiệu
viêm gan mạn tính và lượng virus tăng cao. Từ

hướng dẫn của nhà sản xuất.
Phát hiện và định lượng HBV-DNA: 10ul trích
biệt DNA được cho vào 40ul HBV SYBR PCR
mix (PCR mix để định lượng HBV-DNA bằng kỹ
thuật real-time PCR với SYBR Green I do công ty
Nam Khoa sản xuất) và chạy chương trình real-
time PCR dùng SYBR như là hướng dẫn của nhà
sản xuất để phát hiện và định lượng HBV-DNA có
trong huyết thanh bệnh nhân.
Giải trình tự định genotype HBV và phát hiện
các đột biến liên quan đến kháng lamivudine:
Đồng thời 10ul trích biệt DNA cũng được cho vào
40ul PCR mix để khuếch đại một đọan DNA dài
564bp trong phần rt của gene polymerase của
HBV. PCR mix này được pha từ PCR master mix
do công ty Nam Khoa sản xuất (từ các hóa chất
của Biorad, Roche, và Promega) có thêm cặp mồi
xuôi 264F và của mồi ngược 827R (trình tự các
mồi được giữ trong tài liệu nghiên cứu cấp I tại
phòng RD của công ty Nam Khoa) được thiết kế
bằng phần mềm Primer premier đặc hiệu đọan
DNA nêu trên. Mồi được cho vào PCR mix với
hàm lượng 15pm cho một PCR mix. Thực hiện
PCR theo chu kỳ nhiệt như sau: 1 chu kỳ 95oC
trong 5 phút; sau đó là 40 chu kỳ 94oC trong 30
giây, 55oC trong 30 giây và 72oC trong 1 phút; và
cuối cùng là 1 chu kỳ 72oC trong 7 phút. Sau khi
hòan tất PCR, phát hiện sản phẩm khuếch đại
bằng điện di trong thạch 1.5%. Sau khi điện di và
xác định có sản phẩm khuếch đại đặc hiệu dài

phần mềm miễn phí Bio-edit trong đó chúng tôi có
cài một thư viện genotype của HBV, sau đó truy
cập dể so sánh trình tự đã giải được với trình tự
trong thư viện, nhờ vậy xác định được genotype
HBV của mẫu thử.
2
Phát hiện đột biến rtL180M, rtM204I/V bằng
phương pháp PCR-RFLP: Một số mẫu có kết quả
ghi nhận là có đột biến một phần ở vị trí 180
và/hay 204 được thực hiện thêm kỹ thuật PCR-
RFLP để xác định lại xem kết quả có trùng hợp
được với kết quả ghi nhận từ phương pháp giải
trình tự hay không. Trong phương pháp PCR-
RFLP này, để phát hiện đột biến 180, cho 10ul
trích biệt DNA của huyết thanh vào 40ul PCR mix
A chứa mồi xuôi 180F và mồi ngược 180/204R;
để phát hiện đột biến 204, cho 10ul trích biệt DNA
của huyết thanh vào PCR mix B chứa mồi xuôi
204F và mồi ngược 180/204R (trình tự các mồi
được giữ trong tài liệu nghiên cứu cấp I tại phòng
RD của công ty Nam Khoa). Tiến hành PCR theo
chu kỳ nhiệt như sau: 1 chu kỳ 95oC trong 5 phút;
sau đó là 40 chu kỳ 94oC trong 30 giây, 55oC
trong 30 giây và 72oC trong 30 giây. Sản phẩm
PCR mix A được cắt bằng men cắt NlaIII (Bio
New England), sản phẩm PCR mix B được cắt
bằng cả hai men cắt NdeI (Bio New England) và
NlaIII sau đó được điện di trên agarose 2.5%. Nhờ
mồi 180F được thiết kế có đầu 3’ nằm đúng vị trí
180 mà khi có đột biến rtL180M xãy ra thì sẽ

được phân tích bằng chức năng investigator của
phần mềm kèm theo máy CEQ8000. Trong chức
năng này, chúng tôi so sánh trình tự giải được với
trình tự tham chiếu do chúng tôi thành lập bằng
cách thu thập các trình tự phần rt của gene
polymerase của các chủng HBV không đột biến
(wild type). Các ví dụ minh họa trong hình 1 cho
thấy cách để chúng tôi kết luận như thế nào là có
đột biến hòan tòan và như thế nào là có đột biến
không hòan tòan tại các vị trí acid amin trên: (A)
là đột biến rtM204V hòan tòan với ATG bị thay
thế bằng GTG, trong khi đó (B) là đột biến
rtM204Vh (không hòan tòan) vì chồng lên tín hiệu
của base A của mã ATG là tín hiệu G do vậy máy
vẫn ghi nhận là ATG nhưng thật ra có thêm mã
đột biến GTG; (C) là đột biến rtL180M hòan tòan
với TTG bị thay thế bằng ATG, trong khi đó (D)
là đột biến rtL180M không hòan tòan vì bên dưới
tín hiệu T của TTG, có tín hiệu A do vậy mà máy
ghi nhận là TTG nhưng thật ra có thêm mã đột
biến là ATG; (E) là đột biến rtV173L với GTG bị
thay thế hầu như hòan tòan bởi CTG, trong khi đó
(F) là đột biến rtV173L không hòan tòan do dưới
tín hiện G của GTG là có tín hiệu C do vậy máy
ghi nhận là GTG nhưng thật ra có thêm mã đột
biến CTG nữa.
Để có thể chắc chắn các phân tích dựa vào các
tín hiệu giải trình tự nhờ đó phát hiện có các đột
biến không hòan tòan tại hai vị trí 180 và 204 là
chính xác, chúng tôi đã thực hiện kỹ thuật PCR-

10
4
- <10
5
13 5
10
5
- <10
6
9 5
10
6
- <10
7
6 6
10
7
- <10
8
15 7
10
8
- <10
9**
5 1
57 30
*Số lượng thấp nhất là 429 copies/ml. **Số lượng cao nhất là
822,401,747 copies/ml
một kiểu gen đột biến với 1.1% (1/87) rtM204I,
1.1% rtM204Ih; 31% (27/87) mang hai kiểu gene

vậy đây là đột biến rtM204Ih (không hòan tòan). Các mẫu 5646, 5650 không có đột biến vì sản phẩm PCR không bị NlaIII cắt nhưng bị
NdeI cắt. Các mẫu 5647 và 5570 không bị cả hai enzyme này cắt nên đây là đột biến rtM204I hòan tòan. Mẫu 5649 có đột biến rtM204V
hòan tòan vì sản phẩm PCR bị NlaIII cắt mà không bị NdeI cắt. Mẫu 5525 có sản phẩm PCR vừa bị cắt vừa không bị cắt bởi hai enzyme
này nên khả năng cao nhất là có đột biến rtM204Vh (không hòan tòan)
Biện luận
Mặc dù đã có vaccin ngừa an tòan và hiệu quả
nhiễm HBV, nhưng viêm gan mạn tính do HBV
vẫn còn là một trong 10 nguyên nhân gây tử vong
hàng đầu trên thế giới
[5]
. Từ năm 1998, lamivudine
đã được công nhận là thuốc uống để điều trị
HBV
[6]
. Nhiều dữ liệu lâm sàng đã cho thấy
lamivudine đã làm giảm ngọan mục lượng virus
và cải thiện đáng kể sự tổn hại mô gan do virus
[7,8]
.
Tuy nhiên, cho đến ngày nay vẫn chưa có một nhà
lâm sàng nào có thể khẳng định cho đến khi nào
thì có thể ngưng điều trị lamivudine mà không bị
tái phát dù trước đây người ta cho rằng chỉ cần
nghĩ đến phương án điều trị lamivudine lâu dài khi
sau 52 tuần điều trị lamivudine mà bệnh nhân vẫn
không có chuyển đổi huyết thanh (HBeAg trở nên
5
Hình 3: Phân tích đột biến ở vị trí 180; Sản
phẩm PCR của các mẫu 5718, 5646, 5647, 5648 và
5650 không bị NlaIII cắt, do vậy không có đột biến

10
7
- <10
8
1 1
10
8
- <10
9
0 1 1 0 2
2B: Mang hai kiểu gene đột biến
2
đột biến
V173Lh
M204Ih
V173Lh
M204I
L180Mh
M204Ih
L180Mh
M204Vh
L180Mh
M204I
L180M
M204I
L180M
M204V
Genotype B C B C B C B C B C B C B C Tổng
<10
3

2 2
7 1 1 2 1 0 2 0 6 2 0 1 3 1 27
2C: Mang ba kiểu gene đột biến
3
đột biến
V173Lh
L180Mh
M204Ih
V173Lh
L180Mh
M204I
V173Lh
L180M
M204V
V173Lh
L180M
M204I
V173L
L180M
M204V
Genotype B C B C B C B C B C Tổng
<10
3
10
3
- <10
4
1 1 2
10
4

46% sau 3-4 năm điều trị
[8,10]
.
HBV đề kháng được với lamivudine là do đột
biến thay thế acid amin xãy ra trên domain B
(L180M) và trên motif YMDD (M204V/I) của
domain C của men polymerase của virus
[11-18]
. Đột
biến M204V/I là đột biến ngay trên vị trí tác động
của lamivudine đối với men polymerase do vây đã
làm cho HBV trở nên kháng Lamivudine, tuy
nhiên đột biến này lại làm cho men polymerase
họat động trở nên kém hiệu quả hơn, do vậy làm
giảm khả năng nhân bản của HBV trên bệnh nhân
cũng như trên thí nghiệm
[19-21]
. Cấu trúc không
gian của men polymerase của HBV cho thấy vị trí
180 trên domain B khá gần với motif YMDD, do
vậy đột biến L180M một khi xãy ra thì sẽ làm cho
cấu hình của YMDD có thể phục hồi được, do vậy
giúp cho virus đã có đột biến M204V/I phục hồi
được phần nào chức năng sao chép nhưng vẫn giữ
nguyên hay thậm chí tăng khả năng kháng
lamivudine
[21]
. Do vậy các nhà nghiên cứu thường
thấy đột biến L180M hay đi kèm với M204V và
cũng đôi khi đi kèm M204I

của chúng tôi cho thấy các kiểu đột biến hòan tòan
phù hợp với các kiểu đột biến được thế giới ghi
nhận, chỉ có một khác biệt nhỏ là có 12.6%
(11/87) được ghi nhận có đột biến V173L không
hòan tòan đi kèm đột biến M204Ih (9.2%) và
M204I (3.4%).
Kết luận
Xác định đột biến trên gen polymerase của HBV
giúp virus kháng được lamivudine là một nhu cầu
rất cần thiết hiện nay đối với lâm sàng để có thể
xem xét việc ngưng điều trị lamivudine hay sử
dụng các phương thức kết hợp điều trị khác. Hiện
nay phương pháp giải trình tự của Trugene là
thường được các phòng thí nghiệm lâm sàng sử
dụng trong chẩn đóan để xác định genotype HBV
đồng thời phát hiện các đột biến giúp virus kháng
được lamivudine
[23]
. Tuy nhiên, các phòng thí
nghiệm có trang bị máy giải trình tự không phải
của hệ thống Trugene vẫn có thể thực hiện được
yêu cầu này của lâm sàng. Hy vọng rằng các thông
tin mà chúng tôi có được qua kết quả công trình
nghiên cứu này sẽ có thể có một số đóng góp hữu
dụng cho các nhà lâm sàng đang ngiên cứu và
điều trị bệnh viêm gan mạn tính do HBV, và đồng
thời cho các nhà cận lâm sàng, đặc biệt cho các
phòng thí nghiệm có trang bị máy giải trình tự để
có thể ứng dụng được.
Tài liệu tham khảo

resistance to lamivudine given for recurrent infection
after orthotopic liver transplantation. Lancet. 349:20–22.
12. Ling, R., et al. 1996. Selection of mutations in the
hepatitis B virus polymerase during therapy of transplant
recipients with lamivudine. Hepatology. 24:711–713.
13. Tipples, G.A., et al. 1996. Mutation in HBV RNA-
dependent DNA polymerase confers resistance to
lamivudine in vivo. Hepatology. 24:714–717.
6
14. Allen, M.I., et al. 1998. Identification and
characterization of mutations in hepatitis B virus
resistant to lamivudine. Lamivudine Clinical
Investigation Group. Hepatology. 27:1670–1677.
15. Chayama, K., et al. 1998. Emergence and takeover of
YMDD motif mutant hepatitis B virus during long-term
lamivudine therapy and retakeover by wild type after
cessation of therapy. Hepatology. 27:1711–1716.
16. Yeh, C.T., Chien, R.N., Chu, C.M., and Liaw, Y.F. 2000.
Clearance of the original hepatitis B virus YMDD-motif
mutants with emergence of distinct lamivudine-resistant
mutants during prolonged lamivudine therapy.
Hepatology. 31:1318–1326.
17. Benhamou, Y., et al. 1999. Long-term incidence of
hepatitis B virus resistance to lamivudine in human
immunodeficiency virus-infected patients. Hepatology.
30:1302–1306.
18. Bartholomeusz, A., Schinazi, R.F., and Locarnini, S.A.
1998. Significance of mutations in the hepatitis B virus
polymerase selected by nucleoside analogues and
implications for controlling chronic disease. Viral