SỞ KHOA HỌC & CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH Báo cáo nghiệm thu đề tài:
XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG
KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH TỰ ĐỂ XÁC ĐỊNH
KIỂU GENE VIRÚT VIÊM GAN SIÊU VI C

Chủ nhiệm đề tài: TS. BS. Phạm Hùng Vân
PGS. TS. Nguyễn Thanh Bảo
Cộng tác viên: CN. Võ Đức Xuyên An
CN. Trần Quốc Việt
BS. Hoàng Hiếu Ngọc
ThS. Lê Thuý Quyên ( Bảng báo cáo đã được chỉnh sửa theo ý kiến của hội đồng nghiệm thu
Ngày 11 tháng 08 năm 2008 )

TP. HCM 04/2008

1
TÓM TẮT ĐỀ TÀI
Tên đề tài:
XÂY DỰNG VÀ ỨNG DỤNG KỸ THUẬT GIẢI TRÌNH
TỰ ĐỂ XÁC ĐỊNH KIỂU GENE VIRÚT VIÊM GAN
SIÊU VI C
Chủ nhiệm đề tài:

¤ Nội dung 1: Xây dựng kỹ thuật RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng 5’-NC
có những trình tự đặc hiệu cho kiểu gene tương tự như trình tự mà Trugene và
LIPA đã nghiên cứu.
¤ Nội dung 2: Xây dưng kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR của nội dung 1 trên
máy giải trình tự CEQ 8000 hiện nay đang được trang bò tại công ty Nam Khoa
¤ Nội dung 3: Xây dựng thư viện các trình tự của các kiểu gene HCV từ gene
bank
¤ Nội dung 4: Đònh kiểu gene các trình tự đã giải bằng các xác đònh phần trăm
tương đồng với các trình tự của các kiểu gene lưu trong thư viện. So sánh kết
quả đònh kiểu gene bằng thư viện đã xây dựng với kết quả đònh kiểu gene khi
blast search trên thư viện HCV kiểu gene của NCBI
¤ Nội dung 5: So sánh kết quả ghi nhận được với với kết quả đònh kiểu gene
HCV bằng kỹ thuật HCV-LIPA và/hay kỹ thuật giải trình tự TRUGENE của
Bayer.
¤ Nội dung 6: Workshop hay seminar để phổ biến kết quả nghiên cứu và khi có
yêu cầu, đưa vào áp dụng một phần tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và
áp dụng toàn diện tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và máy sequencer

TIẾN ĐỘ DỰ KIẾN THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Nội dung 1
Nội dung: Xây dựng kỹ thuật RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng 5’-NC có những trình
tự đặc hiệu cho kiểu gene tương tự như trình tự mà Trugene và LIPA đã nghiên
cứu.
Sản phẩm: Là kit RT-PCR phát hiện HCV dựa trên vùng 5’NC dùng cho giải trình tự HCV.
Thực hiện tại phòng nghiên cứu và phát triển công ty Nam Khoa phối hợp với
Bộ Môn Vi Sinh, Khoa Y, ĐHYD TP. HCM
Thời gian: Giai đoạn này dự kiến thực hiện trong 1 tháng (tháng 7/2006 đến 8/2006)
Nội dung 2
Nội dung: Xây dưng kỹ thuật giải trình tự sản phẩm PCR của nội dung 1 trên máy giải
trình tự CEQ 8000 hiện nay đang được trang bò tại công ty Nam Khoa

Nội dung 6
Nội dung: Workshop hay seminar để phổ biến kết quả nghiên cứu và khi có yêu cầu, đưa
vào áp dụng một phần tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và áp dụng toàn
diện tại các phòng thí nghiệm có máy PCR và máy sequencer
Sản phẩm: Sản phẩm chính là phổ biến và chuyển giao. Thực hiện tại sở Khoa Hoc công
Nghệ TP. HCM
Thời gian: Nội dung này dự kiến thực hiện vào tháng 6 năm 2007 trước khi kết thúc đề tài

4
KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI
Xây dựng và áp dụng kỹ thuật giải trình tự
để xác đònh kiểu gene virút viêm gan C
Đặt vấn đề
Xác đònh kiểu gene virút viêm gan C (HCV) là một chỉ đònh rất cần thiết trước khi bác só
điều trò tiến hành cho chỉ đònh điều trò đặc hiệu viêm gan C vì thời gian điều trò kéo dài bao
lâu là tuỳ thuộc vào type virút viêm gan C mà bệnh nhân đang nhiễm
[1]
.
Hiện nay, trên thế giới có 2 phương pháp xác đònh kiểu gene viêm gan C dựa vào phân
tích một vùng đặc trưng trên vùng 5’NC của bộ gen HCV đã được nhiều nhà nghiên cứu cũng
như lâm sàng chấp nhận và được thực hiện tại các phòng thí nghiệm lâm sàng, đó là phương
pháp lai trên vạch dò đặc hiệu kiểu gene C (HCV-InoLIPA)
[2]
và phương pháp giải trình tự
trên máy Trugene
[3]
. Tuy nhiên vì hai phương pháp này phải dựa trên các hệ thống thiết bò và
thuốc thử phụ thuộc hoàn toàn vào các nhà sản xuất (chúng ta thường gọi là hệ thống kín)
nên có giá thành khó có thể được chỉ đònh sử dụng rộng rãi dù tại Việt Nam tỷ lệ lưu hành
HCV là khá cao trên thế giới (5-8% người bình thường có nhiễm HCV)

proteine xuyên màng, NS3 cho các protease và
Hình 1: Hình chụp qua KHV điện t
virút viêm gan C
ử

5
RNA helicase, NS4A và NS4B cho các protein đồng yếu tố, NS5A cho các protein kháng
interferon, và NS5B cho RNA polymerase (hình 3).
Hình 3: Cấu trúc bộ gene của virút viêm gan C
Hình 2: Hình vẽ mô tả cấu trúc của
HCV
Virút viêm gan C xâm nhập vào cơ
thể người bệnh qua đường máu, tình dục.
Sau khi xâm nhập và cơ thể, HCV sẽ
bám vào các thụ thể CD81 và SR-BI
(scavenger receptor class B1) trên tế bào
để xâm nhập vào tế bào gan (hình 4).
Sau khi xâm nhập, virút sẽ bắt đầu quá
trình nhân bản bằng cách trước tiên sẽ
dòch mã từ bộ gene của nó để tổng hợp
một protein đầu tiên 3011AA, rồi
proteine sẽ được các protease của tế bào
chủ và của virút phân cắt thành 3 loại
proteine cấu trúc (C và E) và 7 loại
proteine không cấu trúc (NS). Sau đó
virút hoàn chỉnh sẽ được thành lập từ các thành phần đã được tổng hợp và quá trình hoàn
chỉnh virút được xãy ra trong lưới nội sinh chất và bộ golgi của tế bào để cuối cùng các virút
hoàn chỉnh được liên tục phóng thích khỏi tế bào nhiễm virút để tiếp túc xâm nhập và các tế
bào gan mới
[9]

hợp người nhiễm tạo được kháng
thể bảo vệ loại trừ được virút hay
là một số ít hơn trở thành người
lành mang trùng; có đến 85%
người nhiễm viêm gan virút C bò
diễn tiến đến viêm gan mạn tính
rồi đến xơ gan với 20% trong số đó có nguy cơ diễn tiến đến ung thư gan
[12]
. Do vậy mà dù tỷ
lệ người nhiễm viêm gan C tại Việt Nam thấp hơn nhiễm viêm gan B nhưng tình trạng bệnh
tật do nhiễm virút viêm gan C mang lại là khá cao, không thua mà thậm chí còn hơn viêm
gan B. Nguy hiểm như vậy nhưng bệnh viêm gan C mạn tính lại là một bệnh mà dưới ánh
sáng của y học hiện đại lại là một bệnh có thể chữa khỏi được hoàn toàn với xác suất thành
công có thể đến 60%. Tuy nhiên, để có thể cho được chỉ đònh điều trò đặc hiệu viêm gan C
mạn tính, theo hội nghò đồng thuận của các nhà chuyên môn vào năm 2002 (biểu đồ 1), bác só
cần phải xác đònh là bệnh nhân đang mang virút viêm gan C trong máu bằng xét nghiệm
đònh tính HCV-RNA
[1,13]
vì xét nghiệm anti-HCV chỉ là xét nghiệm sàng lọc trong cho và
truyền máu chứ không phải là xét nghiệm trong chẩn đoán lâm sàng, hơn nữa một người có
kếtquả anti-HCV [+] vẫn có thể không mang virút viêm gan C mà chỉ là kết quả của tình
trạng nhiễm mầm bệnh trước đó và nay đã khỏi. Sau khi xác đònh được người bệnh dương
tính HCV-RNA, trước khi cho chỉ đònh điều trò bác só cần phải làm thêm hai xét nghiệm nữa
là đònh lượng HCV-RNA
[1,13]
và đònh genotype của virút
[1,13]
. Lý do là vì bác só cần phải đánh
giá hiệu quả điều trò mà mình đã cho trên bệnh nhân sau 3 tháng điều trò và phương pháp
đánh giá là đònh lượng lại HCV-RNA. Nếu kết quả đònh lượng cho thấy lượng virút giảm trên

, bDNA (của Bayer)
[16]
. Đối với kỹ thuật real-time PCR, nhờ là hệ
thống mở nên đã có nhiều nhà khoa học trong nước (Đại Học Y Dược, Công ty Nam Khoa,
Đại Học Khoa Học Tự Nhiên ) phát triển được kỹ thuật này áp dụng trong phát hiện và đònh
lượng HCV-RNA, và chính nhờ vậy mà xét nghiệm đònh lượng HCV-RNA hiện đang được
triển khai sử dụng rộng rãi tại nhiều phòng thí nghiệm trong nước có trang bò real-time PCR
(Meid, Hoàn Mỹ, Đại Học Y Dược, BV. Bạch Mai, Bệnh viện 108, Học viện quân y 103,
phòng thí nghiệm NK-Biotek ). Đối với xét nghiệm đònh kiểu gene HCV, hiện nay chỉ có
hai kit được thương mại hoá là kit InoLIPA dựa trên kỹ thuật lai trên vạch tẫm các mẫu dò
đặc hiệu
[2]
và kit Trugene dựa trên kỹ thuật giải trình tự một đoạn đặc hiệu trên vùng 5’NC
của bộ gene virút
[3]
. Ngoài ra cũng có những phương pháp tiếp cận khác được các nhà khoa
học thử nghiệm như phương pháp giải trình tự vùng NS5B
[17]
, phương pháp real-time PCR
[18]
,
hay phương pháp PCR với mồi đặc hiệu. Tuy nhiên các phương pháp này chỉ trong phạm vi
nghiên cứu và chỉ giới hạn trong giá trò học thuật chứ chưa được ứng dụng rộng rãi vì có
những hạn chế nhất đònh, đặc biệt là độ nhạy.
Tại Việt Nam hiện nay, cả hai phương pháp giải trình tự và InoLIPA đều đã được triển
khai thực hiện tại một số rất ít các phòng thí nghiệm để đáp ứng với yêu cầu xét nghiệm xác
đònh kiểu gene của HCV. Tuy nhiên do giá thành của các xét nghiệm này khá đắt nên các
bác só cũng rất hạn chế sử dụng. Nguyên do gía thành đắt là vì các xét nghiệm này phải được
thực hiện trên các bộ thử nghiệm thương mại khá đắt tiền. Do vậy phương án để có thể triển
khai xét nghiệm đònh kiểu gene HCV phục vụ cho nhu cầu lâm sàng hiện nay tại Việt Nam

Thực hiện phiên mã ngược để tổng hợp toàn bộ các RNA tách chiết được thành cDNA.
Phương pháp RT là sử dụng bộ thuốc thử tổng hợp cDNA do công ty Nam Khoa sản xuất. Bộ
thuốc thử này hoạt động theo nguyên tắc sử dụng mồi ngẫu nhiên 6 nucleotides (Random
hexaner primers) mà không cần dùng mồi đặc hiệu để tổng hợp toàn bộ RNA từ mẫu thử
thành cDNA từ RNA nhờ men Reverse Transcriptase, sau đó cắt bỏ RNA bò bắt cặp vào
cDNA sau khi phiên mã ngược thành cDNA bằng men RNAse H. (3) Thực hiện phản ứng
PCR với cặp mồiđã thiết kế. Phương pháp là cho 5ul cDNA vào HCV-PCR mix được pha
trong PCR master mix 1.5mM Mg
++
có dUTP và UNG do công ty Nam Khoa sản xuất bổ
sung thêm hai mồi trên với hàm lượng 50pm/thể tích phản ứng 50ul. Sau đó chạy chương
trình PCR như sau: 40
o
C/10’, 95
o
C/5’, 40 chu kỳ 94
o
C/15”-60
o
C/30”-72
o
C/1’, và cuối cùng là
72
o
C/7’. Kết quả sản phẩm PCR được phát hiện bằng điện di trên thạch 2%. Để đánh giá qui
trình này có khuếch đại trình tự vùng 5’NC của HCV-RNA như thiết kế mồi hay không,
chúng tôi sẽ thử qui trình trên một mẫu huyết thanh HCV-RNA dương tính đã được xác đònh
và lưu trữ ở điều kiện -70oC có trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Nếu kết qủa có sản
phẩm khuếch đại đúng như thiết kế thì qui trình này có thể được xem là thành công trong
khuếch đại trình tự ở vùng 5’-NC như thiết kế mồi. Để đánh giá qui trình này có cho được

là so chuỗi các trình tự của các kiểu gene tham chiếu để tìm trình tự bảo tồn đáp ứng được
các tiêu chí đề ra ở trên. Ngoài ra, bằng một qui trình đặc biệt, chúng tôi cũng sẽ thiết kế và
tạo dòng trong plasmid pGEMT-easy một chứng nội tại dùng chung mồi (IC-HCV) nhưng cho
sản phẩm khuếch đại có chiều dài 40-50bps khác biệt với sản phẩm PCR đích và đã có sẵn
taqman probe đặc hiệu chứng nội tại này (IC-probe) khác biệt hoàn toàn với taqman probe
đích. Ngoài ra chúng tôi cũng sẽ tạo chứng nội tại là RNA (IC-HCVRNA) bằng cách phiên
mã từ IC-HCV nhằm mục đích cho chứng nội tại RNA này vào với mẫu chứng [-] là huyết
thanh được xác đònh [-] HCV-RNA để được tách chiết RNA, tổng hợp cDNA và khuếch đại
real-time cùng với các mẫu huyết thanh thử nghiệm nhờ vậy chứng minh được toàn bộ qui
trình không có bò ngoại nhiễm nếu trong chứng [-] này chỉ có tín hiệu khuếch đại của chứng
nội tại, và đồng thời kiểm soát được độ nhạy các quá trình tách chiết-tổng hợp cDNA và
khuếch đại real-time. Taqman probe cho chứng nội tại này đã có sẵn với đầu 5’ gắn màu
huỳnh quang HEX và đầu 3’ gắn BHQ1 với các tiêu chí thích hợp cho taqman probe đã nói ở
trên. Qui trình thực hiện RT-realtime PCR do chúng tôi xây dựng này cũng sẽ bao gồm các
bước tách chiết RNA, tổng hợp cDNA như qui trình RT-PCR đã trình bày ở trên. Nhưng khi
thực hiện real-time PCR thì sau khi cho 5ul cDNA vào HCV-realtime PCR mix (được pha như
HCV-PCR mix ở trên, nhưng bổ sung thêm HCV-probe với hàm lượng 3pm và IC-probe với
hàm lượng 2pm và thêm Mg++ để đạt 6mM), cho thêm 5ul chứng nôi tại (IC-HCV được pha
loãng đến nồng độ LOD). Sau đó chạy chương trình realtime PCR như sau: 40oC/10’,
95oC/5’, 40 chu kỳ 94oC/15”-60oC/30” trong đó lấy tín hiệu realtime ở giai đoạn 60oC với
hai kênh màu FAM và HEX. Trong kỹ thuật này, chúng tôi cũng đã xây dựng được chuẩn là
sản phẩm PCR đích được dòng hoá vào plasmid và được đònh lượng số copies sau khi đã tách
chiết.
Để đánh giá qui trình real-time có thành công như mong muốn hay không, chúng tôi sẽ thử
nghiệm trên một số mẫu huyết thanh [+] HCV-RNA và [-] HCV-RNA được lưu trữ ở -70oC
có trong phòng thí nghiệm. Tiêu chí xác đònh qui trình thành công là đường chuẩn xây dựng
với 5 nồng độ chuẩn đạt R>0.990 và E nằm trong khoảng 90-105%. Ngoài ra mẫu [+] phải
cho biểu diễn khuếch đại với kênh màu FAM, còn mẫu [-] không có biểu diễn khuếch đại
với kênh màu FAM nhưng phải cho biểu diễn khuếch đại với kênh màu HEX.
Giai đoạn 2

tự là 50-100fm cho dsDNA và 25-50fm cho ssDNA. Kinh nghiệm của chúng tôi cho thấy là nếu kết quả diện di sau tinh sạch cho hình ảnh
vạch điện di đậm dày và rõ nét thì thể tích DNA cho vào là 1µl, nếu vạch điện di đậm mãnh và rõ nét thì thể tích DNA cho vào là 2 hay
3µl, nếu vạch điện di nhạt hơn thì có thể phải đến 5µl (nhưng không bao giờ quá 5µl). **Lượng primer cho vào so với lượng DNA là phải
gấp trên 40 lần (tỷ lệ primer/DNA phải ≥40:1). Thường chúng tôi pha primer đạt 5pm/µl và thể tích primer cho vào là 1µl. ***Lượng DTCS
master mix cho vào theo kinh nghiệm của chúng tôi là 3µl nếu giải trình tự sản phẩm PCR có chiều dài khoảng 400-500bp. Nếu chiều dài
khoảng 200bp thì chỉ cần 2µl DTCS. Nếu là plasmid thi chi cần 4µl DTCS.
Vì thể tích cho vào khá nhỏ, do vậy nên đặt thể tích dung dòch trong đầu pipette lên thành
tube để chắn chắn dung dòch được cho vào tube. Sau khi cho đủ các thành phần vào tube,
quay ly tâm 13000rpm thời gian vài giây để lắng toàn bộ xuống đáy tube, búng nhẹ đáy tube
để trộn đều. Cho tube vào lại máy ly tâm rồi ly tâm 13000rpm một lần nữa trong thời gian
vài giây. Đặt tube phản ứng vào máy PCR rồi chạy chương trình giải trình tự 30 chu kỳ gồm
ba bước nhiệt độ: 96
o
C/20 giây, 50
o
C/20 giây, 60
o
C/04 phút; sau đó giữ 4
o
C. Đây là chương
trình luân nhiệt được nhà sản xuất nghiên cứu tối ưu cho DTCS, do vậy chúng ta không nên
thay đổi.
(3) Tủa sản phẩm của chu kỳ nhiệt giải trình tự: Sản phẩm của chu kỳ nhiệt giải trình tự
được tủa bằng ethanol để loại sạch các ddNTP gắn màu huỳnh quang còn thừa lại trong phản
ứng. Thực hiện như sau: Đối với mỗi mẫu, đánh dấu một tube Eppendorf tinh sạch. Chuẩn bò
dung dòch dừng phản ứng (stop solution) có glycogen như sau: 2µl Sodium Acetate 3M
(pH5.2), 2µl Na
2
-EDTA (pH8), 1µl glycogen (20mg/ml). Cho toàn bộ sản phẩm chu kỳ nhiệt
giải trình tự vào tube Eppendorf có pha dung dòch dừng phản ứng có glycogen như trên. Trộn

hư do không hút được dòch SLS vào và sẽ tạo ra các khoảng trống trong mao quản sau này.
Tương tự như vậy trong khay chứa đệm. Chạy điện di theo chương trình thích hợp cho sản
phẩm PCR đoạn ngắn và với chế độ phân tích là giải trình tự.
(5) Đònh kiểu gene HCV trình tự giải được: Để có được một trình tự chuẩn nhất, trình tự giải
được từ máy sẽ được phân tích bằng cách chọn chế độ phân tích đoạn PCR kích thước
≤200bp và triming 2 đầu. Kết quả được xuất qua chế độ report để từ đó dễ dàng copy sang
đònh dạng MS. Trình tự được copy sẽ được blast search trên thư viện kiểu gene HCV của
NCBI. Kết quả blast search sẽ cho biết kiểu gene nào có trình tự tương đồng nhất và đó
chính là kết quả kiểu gene HCV của trình tự giải được.
Để đánh giá xem qui trình RT real-time PCR cho sản phẩm PCR có thể đưa vào giải trình
tự để đònh được kiểu gene HCV hay không, chúng tôi sẽ thực hiện qui trình này trên 10 mẫu
huyết thanh [+] HCV-RNA đã xác đònh được kiểu gene trên hệ thống Trugene và cho giải
trình tự trực tiếp tất cả sản phẩm PCR của 10 mẫu trên bằng qui trình giải trình tự với mồi
giải trình tự đã thiết kế. Sau khi có trình tự của 10 mẫu sản phẩm PCR, chúng tôi sẽ làm blast
search trên thư viện kiểu gene HCV để xác đònh kiểu gene HCV của các mẫu thử. Kết quả
được xem là đạt khi kiểu gene HCV thu nhận được từ blast search trùng khớp với kiểu gene
HCV đã xác đònh được nhờ hệ thống Trugene.
Giai đoạn 3
Xây dựng thư viện các trình tự của các kiểu gene HCV từ gene bank
Để thực hiện nội dung này, chúng tôi vào genebank để load trình tự của phần 5’NC của
HCV genome tham chiếu rồi đưa vào thư viện local blast của phần mềm Bioedit. Thư viện
nay sẽ liên tục được cập nhật với các trình tự mà chúng tôi giải được và đònh kiểu gene đươc.
Giai đoạn 4
Thử độ chính xác của việc sử dụng thư viện các kiểu gene HCV đã thành lập

12
Trong giai đoạn này, chúng tôi thực hiện thử nghiệm RT real-time PCR phát hiện và đònh
lượng HCV trên ít nhất 200 mẫu huyết thanh (được xét nghiệm thường qui với yêu cầu phát
hiện và đònh lượng HCV-RNA tại phòng thí nghiệm của mình và có kết quả xác đònh HCV-
RNA [+]) rồi giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại để đònh kiểu gene các trình tự đã

của một số kiểu gene HCV do hệ thống Trugene giải trình tự, cũng như nhờ sử dùng phần
mềm Primer Premier chúng tôi đã thiết kế được một cặp mồi được xem là phù hợp nhất để
khuếch đại được đoạn sản phẩm PCR tương thích với mồi giải trình tự của phản ứng CLIP
thực hiện với kit của Trugene. Cặp mồi này có nhiệt độ bắt cặp tối ưu của cặp mồi là 60
o
C,
cho sản phẩm khuếch đại #240bps, và có trình tự như sau:
Mồi xuôi HCV-59F 5’-TGT CTT CAC GCA GAA AGC GTC TAG C-3’
Mồi ngược HCV-302R 5’-ACC CTA TCA GGC AGT ACC ACA AGG C-3’ 13

Hình 5: Kết quả so chuỗi các trình tự tham chiếu để từ đó chọn được mồi HCV-59F
và HCV-302R
Từ cặp mồi thiết kế được, chúng tôi đã xây dựng được kỹ thuật RT-PCR phát hiện HCV
dựa trên vùng 5’-NC. Hình 6 dưới đây trình bày kết quả điện di sản phẩm PCR khi chúng tôi
thử qui trình RT-PCR phát hiện HCV do chúng tôi xây dựng với cặp mồi HCV-59F và HCV-
302R trên một mẫu huyết thanh HCV-RNA dương tính đã được xác đònh và lưu trữ ở điều
kiện -70oC có trong phòng thí nghiệm của chúng tôi. Kết qủa cho thấy sản phẩm khuếch đại
tạo thành vạch rất rõ trên thạch diện di với kích thước #240bp như thiết kế.

Hình 7: Kết quả tín hiệu giải
trình tự trên máy Trugene
sản phẩm PCR của qui
trình RT-PCR mà chúng
tôi gửi đến thử tại
MEDIC
Nhờ kết quả này, Trung tâm MEDIC đã sử dụng qui trình RT-PCR phát hiện HCV do
chúng tôi cung cấp để thực hiện xét nghiệm đònh kiểu gene HCV bằng kỹ thuật giải trình tự
trực tiếp sản phẩm PCR trên hệ thống Trugene. Dưới đây là một biểu đồ 2 tổng kết các kết
quả xét nghiệm kiểu gene HCV trên hệ thống Trugene với giai đoạn PCR sử dụng qui trình
RT-PCR phát hiện HCV của chúng tôi cung cấp.
3
3
24
2 2
12
0
5

và HCV-302R nhưng dùng mồi HCV-302R có gắn biotin ở đầu 5’ để có được sản phẩm PCR
đánh dấu biotin, nhờ vậy mà có thể phát hiện và đònh type được khi thực hiện lai trên các
vạch gắn các probe đặc hiệu trên que InoLIPA. Chúng tôi đã chọn 5 mẫu huyết thanh [+]
HCV-RNA biết rõ được các kiểu gene HCV khác nhau nhờ thử nghiệm InoLIPA để thử
nghiệm lại qui trình của chúng tôi (RT-PCR với mồi HCV-302R gắn Biotin). Các kết quả
trình bày trong hình 8 cho thấy sản phẩm PCR gắn biotin của qui trình RT-PCR của chúng tôi
hoàn toàn tương thích với que InoLIPA để có thể xác đònh được kiểu gene HCV vì cách kiểu
Hình 8: Các kết quả lai
sản phẩm PCR của qui
trình RT-PCR của
chúng tôi cho phép
đònh được các kiểu
gene của HCV

16
vạch lai [+] hoàn toàn rõ ràng để xác đònh được các kiểu gene HCV trên các mẫu thử và
trùng khớp với các kết quả InoLIPA trước đó.
Các kết quả (1) và (2) đã cho phép chúng tôi nhận đònh là chúng tôi đã xây dựng được qui
trình RT-PCR khuếch đại được vùng đặc hiệu kiểu gene của HCV, và vùng này có thể rất
trùng lặp với vùng đặc hiệu kiểu gene HCV mà dựa vào đó Trugene đã phát triển kit giải
trình tự và InoLIPA phát triển các que lai trên vạch để làm xét nghiệm đònh kiểu gene HCV.
(3) Từ qui trình RT-PCR đã nghiên cứu được, đã xây dựng thành công qui trình RT real-
time PCR dùng taqman probe
Chúng tôi cũng đã xây dựng được kỹ thuật RT-realtime PCR dùng taqman probe để phát
hiện và đònh lượng HCV. Trình tự của taqman probe này (HCV-probe) như sau:
HCV-86F: 5’-FAM-TGG CGT TAG TAT GAG TGT CGT GCA GC-TAMRA-3’.
Chúng tôi cũng đã xây dựng và tạo dòng được một chứng nội tại dùng chung mồi HCV-
59F và HCV-302R (IC-HCV) nhưng cho sản phẩm khuếch đại #190bps và chứng nội tại này
đã có taqman probe tương ứng (IC-probe) khác biệt hoàn toàn với taqman probe HCV-86F.
IC-probe cho chứng nội tại này có đầu 5’ gắn màu huỳnh quang HEX và đầu 3’ gắn BHQ1.

SQ:
17 000
Hình 10: Kết quả mẫu thử dương tính biểu hiện bằng đường khuếch đại tính hiệu huỳnh
quang đọc bởi kênh màu “Fam” so với đường khuếch đại tín hiệu huỳnh quang
các mẫu chuẩn. Kết quả tính tóan từ biểu đồ chuẩn cho thấy mẫu thử có Ct =
23.33, và lượng HCVcDNA ban đầu có trong mẫu thử là 17.000 copies.

ình 11: Kết quả mẫu thử có số copies dưới ngưỡng phát hiện, biểu hiện bằng đường

iai đoạn 2

HEX
FAM
H
khuếch đại tính hiệu huỳnh quang đọc bởi kênh màu “Fam” là âm tính, nhưng
đường biểu diễn khuếch đại tín hiệu huỳnh quang đọc bởi kênh màu ”HEX” là
dương tính.
G
ïc kỹ thuật giải trình tự sản phẩm RT real-time PCR trên máy giải trình tự
CE
phẩm
PC
A GGC CTT TCG CGA-3’.
Xây dựng đươ

ctactcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatggccgggcatagagtgggtttatccaagaaagg
acccagtcttcccggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggggg
ggcctggaggctgtacgacactcatactaacgccatggctagac
2a
3 1b
actactcggctagcagtctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggttgatccaagaaag
gacccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggggg
ggtcctggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctt
1b
4 1b
tcgcgctagcagtctcgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggttgatccaagaaaggac
ccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctccggagggggggtcct
ggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctttctgca
1b
5 1c
actactcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatctccagagcattgagcgggtgaatccaagaaa
ggacccggtcgtcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggagggg
gggtcctggaggctgcacgacactcatactaacgccatggctagacgctt
1c
6 6a
tcggctagcagtcttgcgggggcacgcccaaatctccaggcatgtgagcgggtttgatccaatggaaagg
acccggtcatcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaaccactatggctctcccgggaggggg
gggcctggaggctgtacgacactcatactaacgccatggctaaacgcttt
6a
7 6a
gctactcggctagcagtctgcgggggcacgcccaaatctccaggcattgagcgggtttgatccaatggaa
aggacccggtcatcctggcaattccggtgtactcaccggttccgcagaccactatggctctcccgggaggg
gggggcctggaggcgtgtacgacactcatactaactccatggctagacgcttt
6a
8 1a

Hình 12: Minh họa một kết quả giải trình tự với trình tự A-T-C-G tương ứng với các tín
hiệu huỳnh quang ghi nhận từ máy và kết quả kiểu gene sau khi blast search trên
thư viện kiểu gene HCV

20
Trên 10 mẫu này, khi điện di sau khi tinh sạch sản phẩm RT real-time PCR, chúng tôi vẫn

Thư viện kiêu gen HCV trong
thu mu
ï
c Database của Bioedit
Hình 14: Thư viện các kiểu
gene HCV trong thư mục
database của Bioedit

21
Đã chứng minh độ chính xác của việc sử dụng thư viện các kiểu gene HCV đã thành lập
là hoàn toàn không khác biệt với sử dụng HCV genotype blast search của NCBI
Với 234 mẫu huyết thanh HCV-RNA [+], chúng tôi đã thực hiện thử nghiệm RT real-time
PCR phát hiện và đònh lượng HCV rồi giải trình tự trực tiếp sản phẩm khuếch đại để đònh
kiểu gene các trình tự đã giải bằng local blast search trên thư viện các kiểu gene đã thành
lập, đồng thời blast search trên thư viện HCV genotype của NCBI. Kết quả trình bày trong
bảng 3 theo sau đây cho thấy không hề có sự khác biệt giữa hai phương pháp blast search.
Bảng 3: Kết quả đònh kiểu gene HCV của 234 trình tự bằng cách blast search trên thư
viện kiểu gene HCV được lập ở Bioedit (NCBI local blast search) và trên thư
viện kiểu gene HCV của NCBI genbank (NCBI blast search).
KQ đònh lượng HCV (copies/ml) Số mẫu Kết quả kiểu gene (số mẫu)
NCBI local blast search /NCBI blast search
100 – 999 1 1b(1)/
1b(1)
1.000 – 9.999 14 1a(1), 1b(10), 2a(2), 6a(1)/


Hình 16: Minh hoạ một màn hình local blast search trên thư viện kiểu gene HCV do
chúng tôi thiết lập và nhập vào cơ sở dữ liệu của BioEdit.

Hình 17: Minh hoạ phần một màn hình cho thấy kết quả bảng điểm của các kiểu gene
tương đồng sau khi blast search cùng một trình tự trên thư viện HCV genotype

10.000 – 99.999 57 I 1(3), 1a(3), 1b(28), 1a/1b(1), 2(4), 2a(4), 2c(2), 2a/2c(1),
6a(11)
II 1a(3), 1b(32), 2a(9), 2c(2), 6a(11)
100.000 – 999.999 123 I 1(1), 1a(8), 1b(63), 1a/1b(1), 2(12), 2a(7), 2b(1), 6a(30)
II 1a(8), 1b(65), 2a(15), 2b(5), 6a(30)
1.000.000 – 9.999.999 37 I 1a(1), 1b(27), 2a(5), 6a(4)
II 1a(1), 1b(27), 2a(5), 6a(4)
10.000.000 – 99.999.999 2 I 1(1), 1b(1)
II 1b(2)
Tổng cộng 234 I 1(5), 1a(13), 1b(130), 1a/1b(2), 2(21), 2a(12), 2b(1), 2c(2),
2a/2c(2), 6a(46)
II 1a(13), 1b(137), 2a(31), 2b(5), 2c(2), 6a(46)
(2) Đã áp dụng phương pháp xác đònh kiểu gene HCV bằng giải trình tự trực tiếp sản
phẩm RT real-time PCR phát hiện và đònh lượng HCV trên một lượng lớn mẫu để tìm hiểu
sự phân bố các kiểu gene HCV trên các bệnh nhân Việt Nam nhiễm HCV được bác só chỉ
đònh xét nghiệm để được điều trò đặc hiệu.
Trong thời gian từ 21 tháng 9 năm 2006 đến 29 tháng 12 năm 2007, chúng tôi đã thực hiện
xét nghiệm đònh kiểu gene HCV của 918 mẫu huyết thanh HCV-RNA [+] được các bác só
cho xét nghiệm xác đònh kiểu gene HCV. Kết quả được tổng kết trong biểu đồ 3 trình bày
theo sau đây. Phân tích kết quả kiểu gene với lượng lớn này cho phép chúng tôi nhận đònh đa
số bệnh nhân nhiễm HCV của Việt Nam là nhiễm kiểu gene 1, đặc biệt 1b (57%) là kiểu
gene đòi hỏi thời gian điều trò lâu dài. Rất ít các trường hợp nhiễm kiểu gene 3 hay 4.

241b
56.96%
2c
0.22%


Biểu đồ 3: Phân bố các kiểu gene HCV trên 918 mẫu huyết thanh HCV-RNA [+] được bác
só cho chỉ đònh xét nghiệm để được quyết đònh điều trò đặc hiệu
Bàn luận
Đònh kiểu gene HCV bằng kỹ thuật giải trình tự của Trugene hay kỹ thuật InoLIPA lai trên
vạch của Bayer đều dựa trên một đọan nucleotide đặc hiệu trên vùng 5’NC. Đây là cả hai
phương pháp được nhiều nhà y học chấp nhận để dùng trong các phòng thí nghiệm lâm sàng.
Phương pháp InoLIPA tuy kém hơn phương pháp giải trình tự vì có thể có nhiều trường hợp
không thể phân biệt được các subtype, nhưng InoLIPA có lợi điểm là không cần thiết phải có
thiết bò giải trình tự vốn được xem là khá đắt tiền và tương đối khó về mặt kỹ thuật, do vậy
InoLIPA có thể triển khai thực hiện được tại bất kỳ các phòng thí nghiệm lâm sàng nào có
trang bò phương tiện cho kỹ thuật PCR. Tuy nhiên, vì InoLIPA phải thực hiện trên sản phẩm
PCR là kết quả của phản ứng nested PCR nên khả năng bò ngọai nhiễm là khá cao và đây
chính là lí do giải thích được tại sao có khá nhiều trường hợp InoLIPA có kết quả không thể
xác đònh được kiểu gene
[19,20]
.
Trong phương pháp giải trình tự của Trugene, các nhà sản xuất khuyến cáo nên thực hiện
trên sản phẩm PCR của Roche Amplicor, và đây chính là một trở ngại khá lớn vì giá thành
của Roche Amplicor dành cho HCV rất đắt (trên 120 USD/mẫu thử). Ngòai giá thành của
Roche Amplicor, các vật liệu tiêu hao khác đi kèm với thử nghiệm giải trình tự cũng phải
đến trên 60USD nữa, do vậy giá thành của một thử nghiệm kiểu gene HCV bằng giải trình tự
của Trugene tại Việt Nam khó có thể thấp dưới 180USD.
Với công trình này, chúng tôi đã nghiên cứu thành công một bộ thử nghiệm RT-PCR với
PCR mix dùng cặp mồi hòan tòan tương thích với hệ thống Trugene nhờ vậy mà phòng thí
nghiệm không nhất thiết phải sử dụng Roche Amplicor làm RT-PCR
[20,21]
. Chính nhờ áp dụng

25