Một số phương pháp cụ thể thường được dùng
cho kỹ thuật giải trình tự ADN – Phương pháp 2 Phương pháp 2. Chuẩn bị gel cho giải trình tự ADN
Giới thiệu chung:
Phương pháp này giới thiệu cách đổ gel, lên mẫu và chạy gel giải trình tự
ADN. Có nhiều cách đổ gel, có thể tham khảo các cách khác nhau để chọn cách
tiện ích nhất.
Điều quan trọng nhất là các bản kính phải được rửa sạch tuyệt đối.
1, Mang găng tay và loại bỏ hết bột găng tay đi. Rửa bản kính một lần với
nước nóng. Sau đó dùng bàn chải rửa với 0.5N NaOH. Lau bản kính với
dung dịch Alconox hay chất tẩy rửa có chức năng tương đương. Sau đó rửa
sạch lại bằng nước.
2, Rửa các bản kính với nước trao đổi ion sau đó dựng lên giá cho khô,
tránh bụi bám vào kính. Lau với ethanol và dùng giấy Kimwipes hay Scott
Utinity để lau cho sạch không tạo vết. Kiểm tra lại bụi bám vào kính để lau
cho sạch, sau đó kính được lau bằng lớp dịch Rain-X hay Sigmacott, Gel
Slick của hãng AT Biochem. Mục đích dùng chất này là giúp cho việc đổ
gel dễ dàng hơn và gel không bị dính vào các bản kính.
3, Rửa lại bản đệm cách gel (spacer) với nước đặt vào dọc theo hai cạnh đối
xứng của bản kính.
4, Ghép hai bản kính với nhau. Đặt cẩn thận hai bản kính bằng nhau sao
cho hai bản spacer sát tận cuối bản gene (tạo mặt phẳng cùng với hai bản
kính). Nếu không đảm bảo mặt phẳng thì dễ bị chảy gel trong quá trình đổ
gel. Kẹp 2 cạnh của gel tại 3 vị trí.
5, Chuẩn bị gel acrylamid 8% Long Ranger (Hoefer Rig).
Trộn đều hỗn dịch:
16 ml Acrylamid Long Ranger (LR) 50%.
5 ml 10X TBE
70 ml 10M Urea (46 gam)

6, Đặt gel nằm ngang và đưa cạnh bằng của lược răng cá mập vào gel, tạo
một góc hơi nghiêng nhằm tránh tạo bọt khí. Chắc chắn rằng đã đặt cạnh
bằng của lược vào phía trên của gel và phần răng cá mập sẽ nằm dọc theo
đỉnh của bản kính dài (lược sẽ nằm ngược với vị trí trong hình 1.10). Bổ
sung thêm gel và đẩy thêm lược vào đúng vị trí và cố định lược lại bằng
kẹp để tránh xê dịch.
7, Bao bọc gel với giấy nilon SaranWrap để tránh gel tiếp xúc với không
khí. Ngoài ra có thể thấm giấy lọc với đệm TBE để đậy lên. Điều này giữ
cho gel luôn ẩm và tránh gel tiếp xúc với oxy (oxy làm cản trở quá trình
polyme hóa).
8, Quá trình polyme xảy ra từ 30 phút đến 1 giờ. Để xác định polyme hóa
có thể hút một ít gel vào pipét pastuer và để cho đến khi quá trình polyme
hóa xảy ra. Hoặc có thể lấy gel cho vào ống falcon và đậy chặt nắp lại,
trong nhiều trường hợp thì gel chỉ nên polyme hóa trong 15-20 phút hoặc
nhanh hơn. Nếu quá trình polyme hóa không xảy ra thì lại phải tiến hành
rửa kính và đổ lại gel. Chú ý nhiều khả năng quá trình polyme hóa không
xảy ra do Ammonium persulphat không còn tốt khi dùng lâu, nên chuẩn bị
dịch này để dùng trong tuần. Điều cần chú ý nữa là gel phải được bọc kỹ
với SaranWrap để qua đêm.
9, Chuẩn bị gel trước khi chạy:
a. Lấy SaranWrap ra khỏi gel.
b. Đặt gel vào thiết bị điện di (bản kính dài đặt áp vào thiết bị), chắc chắn là
đã cắt bỏ lớp băng dính ở đáy gel để việc điện di xảy ra.
c. Đổ 0,5X TBE vào bể đệm dưới của thiết bị, lượng đệm cần phải đủ để
cho bản gel nằm trong đệm.
d. Đổ đệm vào bể trên của thiết bị, đảm bảo gel nằm dưới lớp đệm. Kiểm
tra xem đệm có bị chảy ra hay không.
e. Chạy thử 20-30 phút tại hiệu điện thế 2000V (phải cẩn thận vì rất nguy
hiểm), sau đó nhiệt độ của bản gel nên đạt tới 50
o

16, Quá trình điện di với hiệu điện thế 2000V cho đến khi màu BPB
(Bromophenolblue) di chuyển đến tận cùng bảng gel (1-2 giờ). Nếu chạy
gel có gradient muối sẽ cho phép đọc được nhiều base hơn trên một gel do
việc làm ngắn lại khoảng cách giữa các băng ADN ở phần cuối bản gel.
Nên dừng điện di từ 45 phút – 1 giờ. Tắt nguồn điện, bổ sung 1/2 thể tích
3M NaOAc vào bể đệm đáy, trộn đều. Lại tiếp tục công việc chạy gel cho
đến khi BPB di chuyển đến cuối bản gel. Chú ý sự có mặt của muối nồng
độ cao sẽ dẫn đến nhiệt độ tăng, do đó cần phải kiểm soát nhiệt độ của quá
trình chạy gel nhằm tránh vỡ kính và hỏng gel.
Chuẩn bị gel cho phát hiện bằng ảnh phóng xạ.
17, Lấy bản gel ra khỏi thiết bị, chú ý bể đệm đáy chứa chất phóng xạ, các
nucleotid dư sẽ đi ra khỏi bản gel.
18, Đổ bỏ bể đệm trên.
19, Đặt bản gel trên bàn thí nghiệm sao cho tấm kính ngắn lên trên. Phủ lên
một lớp SaranWrap, dùng đá lạnh đặt lên trên khoảng 2 phút để cho gel co
lại, dùng thanh nhựa tách các lớp kính ra, giữ nguyên không cho tấm kính
trên tiếp xúc lại với gel vì như vậy gel sẽ dính và bị vỡ. Lúc này gel sẽ chỉ
dính vào tấm kính dưới không có silicon được phủ khi đổ gel.
20, Đặt tấm giấy Whatman lên trên gel và vuốt đều nhẹ nhàng, lúc đó gel sẽ
dính vào giấy và có thể lấy ra dễ dàng (Chú ý trong trường hợp sử dụng
chất phóng xạ là S
35
thì nên cố định mẫu theo cách dưới đây).
21, Sau khi lấy gel ra hỏi tấm kính đáy thì bọc gel với SaranWrap, chú ý
tránh không khí đi vào giữa lớp SaranWrap và gel, điều này sẽ cản trở ảnh
phóng xạ trên phim.
22, Có thể đưa vào thiết bị sấy gel.
23, Sấy gel trong khoảng 45 phút tại 80
o
C.

được rút gọn, có nhiều phần tiện ích chi tiết hơn và thay đổi trong các tài liệu
hướng dẫn.
Điều quan trọng để có kết quả tốt trong việc giải trình tự ADN là chất
lượng cao của ADN plasmid. Trong các khâu chuẩn bị việc xuất hiện các phân tử
đứt gãy sẽ dẫn đến kết quả không rõ, khó xác định các băng. Các plasmid sợi đơn
phải được làm biến tính cho mở xoắn trước khi giải trình tự. Biến tính các plasmid
xoắn do liên kết hóa trị không phải lúc nào cũng đạt được bằng xử lý nhiệt tại
nhiệt độ bắt cặp mồi hay trong đệm phản ứng, bởi lẽ nhiệt độ mở xoắn thường là
105ng là 105
o
C. Có hai phương pháp khá nhanh và tiện lợi: Một phương pháp xuất
phát từ thực tế là glycerol hoặc ethylen glycerol có tác dụng làm giảm nhiệt độ mở
xoắn, còn phương pháp thứ 2 là mở xoắn bằng môi trường kiềm. Cả hai phương
pháp đều thực hiện đơn giản cho hầu hết các loại ADN khuôn.
Đối với hai phương pháp biến tính ADN, nên dùng lượng ADN khuôn ở nồng
độ 0.5 pmol (05- 0.3 mg) và lượng primer 2-5 pmpol. Nếu sử dụng thể tích ADN
nhỏ hơn thì phải pha đến nồng độ thích hợp bằng nước. Kết quả tốt nhất thu được
là theo tỷ lệ phân tử mồi : sợi khuôn là 4 : 1. Tỷ lệ này nên được duy trì khi tiến
hành với lượng ADN khuôn khác nhau. Trong mọi trường hợp khi mà số lượng
thành phần nào quá ít thì đều dẫn đến băng không rõ ở cuối bản gel. Lượng ADN
khuôn cần theo phương pháp này ít hơn so với sử dụng sequenase KIT 2.0 do
không bị mất ADN trong bước kết tủa với ethanol. Tác nhân gây biến tính ADN
khuôn trong KIT này là đệm 40:50 glycerol và ethylen glycerol. Việc bổ sung đệm
này vào dung dịch ADN theo tỷ lệ chỉ dẫn; 40% glycerol sẽ làm giảm nhiệt độ
biến tính ADN xuống khoảng 20
o
C. Chý ý khi dùng đệm glycerol sẽ gây nên việc
di chuyển không đều trên gel điện di tại vùng có khoảng cách 300-400 kể từ đoạn
ADN mồi. Nên sử dụng đệm chạy gel hạn chế tác dụng của glycerol (thay taurin
cho đệm chạy gel TBE) sẽ khắc phục được điều này.

Nước cất dẫn đến: 11 ml.
Trộn đều, giữ trong 10 phút tại 37
o
C, làm lạnh nhanh trên đá.
Điều quan trọng trong phương pháp này là bước trung hòa phải được
thực hiện chính xác với HCL.
Sau đó bổ sung HCL 1M : 2 ml.
Đệm phản ứng plasmid: 2 ml.
Tổng thể tích là: 15 ml.
2. Bắt cặp mồi vào sợi khuôn:
Giữ hỗn dịch ADN và mồi ở 37
o
C trong 10 phút, sau đó giữ trên đá lạnh
(mẫu chỉ nên dùng trong vòng 4 giờ).
3. Chuẩn bị tube chứa hỗn dịch kết thúc chuỗi:
Trong khi thực hiện bước bắt cặp sợi khuôn và sợi mồi, tiến thành hút
2,5 ml hỗn dịch kết thúc chuỗi cho từng loại (ddA, ddC, ddG, ddT) cho
vào từng tube riêng biệt. Đậy nắp, để trên đá để dùng cho các bước 5 và
7.
4. Pha loãng dịch đánh dấu:
Pha loãng dịch đánh dấu 5 lần với nước và giữ trên đá. Không nên pha
loãng dịch đánh dấu khi muốn đọc đoạn ở xa mồi.
Dịch đánh dấu: 2 ml
Nước: 8 ml
Tổng số: 10 ml.
5. Làm ấm các mẫu đá chuẩn bị trong bước 3:
Bốn mẫu được chuẩn bị trong bước 3 lần lượt là ACGT được ủ ở 37
o
C
trong 1 phút.

a. Lấy 4,5 ml hỗn dịch thu được từ bước 6 cho vào thành trên của 4 tube kết
thúc chuỗi đã được làm ấm ở bước 5 (A, C, G, T). Đậy nắp lại và li tâm
nhanh để trộn đều, tiếp tục ủ trong 5 phút tại 37
o
C (có thể kéo dài tới 30
phút). Nếu thấy cần thiết thì có thể li tâm nhanh để thu lấy hỗn dịch trước
khi tiến hành phản ứng đánh dấu.
b. Tại thời điểm cuối của 5 phút, bổ sung 4 ml hỗn dịch dừng phản ứng vào
thành trên của các tube và đóng nắp nhanh. Như vậy có thể dừng phản ứng
tại thời gian thích hợp bằng cách li tâm để dịch dừng phản ứng đi xuống
hỗn dịch phản ứng.
c. Ngay lập tức li tâm để dịch dừng phản ứng đi xuống hỗn dịch phản ứng,
sau bước này phản ứng đánh dấu đã hoàn tất và mẫu có thể được giữ ở 4
o
C
để sử dụng trong ngày hôm sau.
d. Xử lý ở nhiệt độ 75
o
C cho các mẫu khoảng 2-3 phút ngay trước khi tra
mẫu lên gel, với các mẫu chứa glycerol thì việc lên mẫu dễ dàng với đầu
côn vàng.
e. Lên khoảng 2-3 ml mẫu cho mỗi giếng trên gel giải trình tự. Nên đưa
một lượng đồng mẫu trên các giếng. Cách tốt nhất để lên mẫu không bị bọt
là hút 3 ml mẫu nhưng khi tra chỉ dùng 2 ml là đủ.
Hóa chất:

Hỗn dịch kết thúc chuỗi:

Tube A C G T
dATP 80µM 80µM 80µM 80µM

cho kết quả tốt. Có một giải pháp nữa là có thể sử dụng gel với gradient
muối nhưng vẫn giữ nguyên thời gian chạy gel (xem phương pháp 2, bước
16).
- Sự dồn các băng:
Nguyên nhân chung để không thể hoàn tất việc giải trình tự ADN là các
băng không rõ do cấu trúc bậc hai trong sản phẩm của phản ứng kéo dài
chuỗi, điều này thường được mô tả là sự dồn ép các băng do các băng bị thu
hẹp một cách bất thường trên ảnh fim của kết quả giải trình tự ADN. Các
khoảng cách hoàn toàn như nhau khi mà khoảng 3 liên kết G-C bổ sung
kèm với 2-5 base có thể dẫn đến kết quả không thể đọc được đoạn gene
chiếm một khoảng nhỏ trên bản gel. Khoảng trống bất thường là do ảnh
hưởng của chuỗi với khoảng cách ngắn của cấu trúc bậc 2 sẽ có cùng tốc độ
di chuyển như là sợi thẳng có chiều dài ngắn, tại ví trí bản fim ngoài vùng
dồn băng thì khoảng cách các băng sẽ rộng khác thường do sự kém bền của
cấu trúc bậc 2 làm cho chiều dài của chuỗi tăng lên và sự di động của chuỗi
trở nên như bình thường.
Việc giải trình tự qua vùng gene dồn nén có thể được khắc phục bằng cách
thực hiện việc đọc trình tự trên cả hai sợi. Sự bất thường về việc di chuyển
nảy sinh ở các chuỗi có chiều dài không đủ cho việc bắt cặp. Điều này có
nghĩa vùng gene có các băng không rõ ràng sẽ được khắc phục bằng cách
sử dụng dITP thay cho dGTP trong phản ứng giải trình tự ADN. Lý do là
base I chỉ có 2 liên kết với C thay vì 3 liên kết trong trường hợp với G, kết
quả là ADN sẽ dễ duỗi hơn. Kỹ thuật này thường được dùng, do đó dITP có
trong KIT sequenase.
Một cách khác có thể làm kém bền vùng base dồn nén do còn cặp đôi đó là
thực hiện chạy gel trong điều kiện biến tính (ví dụ sử dụng formamide
trong nước dùng đổ gel). Trong trường hợp này khi thay thế 25%
formamide cho nước sẽ đạt được kết quả tốt nhất. Gel có formamide
thường được dùng khi vùng dồn nén khá gần mồi, nên xử lý formamide qua
gel trao đổi ion ngay trước khi chuẩn bị gel.

- Nước cất vô trình: đủ 20 µl
Chuẩn bị Teminator Ready Reaction Mix cho 4 phản ứng:
15 µl Bigdye Sequencing Buffer 3.1 (5X) + 15 µl nước = 30 µl (2.5X)
20 µl đệm 2.5X + 20 µl Ready Reaction Premix= 40 µl Terminator Ready
Reaction Mix (dùng 8 µl) cho một phản ứng.
2. Tiến hành phản ứng:
Phản ứng được thực hiện trong 200 ml tube hay trong microplate.
Cycling được thực hiện trong máy PCR theo chương trình sau:
Denature 96
o
C: 1 phút
96
o
C: 10 giây
50
o
C: 5 giây
60
o
C: 4 phút
Cycling: 25 cycles.
3. Kết tủa sản phẩm PCR:
- Cho vào 5µl EDTA 125 mM + 60µl E-OH 100%E-OH 100%
- Trộn đều, để 15 phút ở nhiệt độ phòng. Ly tâm 15 000 v/phút
- Rửa lại bằng 60µl E-OH 70% và lại ly tâm (4
o
C)
- Làm khô mẫu ở nhiệt độ phòng (Speed Vac).
- Khi mẫu khô, thêm 10µl Hi-Di formamide, trộn đều sau đó ủ ở 96
o