Một số phương pháp cụ thể thường được dùng
cho kỹ thuật giải trình tự ADN – Phương pháp 1
Phương pháp 1: Tinh sạch Plasmid cho giải trình tự ADN.
Hiện nay có nhiều kỹ thuật tinh sạch plasmid khác nhau, phương pháp được
trình bày dưới đây là phương pháp thu được plasmid có độ tinh sạch cao, có thể
dùng cho cả giải trình tự ADN thủ công và tự động hóa. Quá trình này là cải tiến
phương pháp sử dụng dịch kiềm làm tan tế bào, sau đó sử dụng sắc ký qua cột trao
đổi ion. Cũng như các sản phẩm được lưu hành trên thị trường của các công ty,
hạn chế lớn nhất của phương pháp này là giá thành của nhựa trao đổi ion tương
đối đắt. Thực tế có rất nhiều công việc phải giải trình tự một cách thủ công và các
cán bộ nghiên cứu đã tìm ra nhiều phương pháp tinh sạch khác nhau để thu nhận
ADN đạt độ sạch cần thiết, thậm chí có thể dùng cho giải trình tự ADN tự động.
Tuy vậy, nhiều người vẫn thích sử dụng cột trao đổi ion, kết quả có thể đọc được
tới 600 bps hoặc nhiều hơn nữa.

Quá trình tinh sạch như sau:
+ Nuôi cấy vi khuẩn mang plasmid trên môi trường chọn lọc với kháng
sinh tương ứng (khoảng 3 ml).
1, Phân 3 ml môi trường LB chứa 100 mg/ml apicilin trong ống nghiệm
vô trùng (12X100 nm có nút).
2, Vô trùng đầu que cấy trên lửa và làm nguội trên mặt đĩa thạch.
3, Lấy sinh khối từ một khuẩn lạc và đưa vào ống nghiệm chứa môi
trường nuôi cấy trên.
4, Nuôi cấy vi khuẩn 37
o

7. Rửa cột 2 lần, mỗi lần 1 ml đệm QC.
8. Thu ADN với 0.8 ml đệm QF.
9. Kết tủa ADN với 0.7 thể tích isopropanol (trước đó đưa về nhiệt độ
phòng). Ly tâm 15000 v/phút tại 4
o
C.
10. Rửa ADN thu được với ethanol 70%, để khô 5 phút và hoà tan lại
trong thể tích đệm thích hợp (25ml). Chú ý trong trường hợp mẫu
dùng cho giải trình tự ADN tự động huỳnh quang thì hoà tan mẫu
trong nước.
Nói chung sử dụng cột Qiagene thu được trên 90% ADN và thường được
dùng cho tinh sạch Plasmid và cosmit (kích thước dưới 2 Kbs đến lớn hơn 50
Kbs). Số lượng plasmid thu nhận được từ tế bào E.coli phụ thuộc vào hệ tế bào
chủ, loại plasmid từ thấp trung bình đến số lượng plamid cao và điều kiện nuôi cấy
(có thể tham khảo tài liệu liên quan từ các chỉ dẫn của Qiagene để quyết định số
lượng tế bào dùng để xử lý cho mỗi loại kích thước cột).
Chú ý cách làm sạch và tái sử dụng cột:
1, Thêm ethanol đầy vào cột, ly tâm.
2, Bỏ ethanol và ly tâm lại một lần nữa.
3, Lặp lại bước 1 và 2 với nước cât.
4, Giữ cột ở trạng thái khô cho đến lần sử dụng về sau.
(Cột có thể được dùng cho nhiều lần tuy nhiên khi muốn tinh sạch ADN
dùng cho tách dòng thì nên dùng cột mới).

Các loại dịch đệm dùng cho cột Qiagene:
Đệm P1 50 mM Tris -HCl, 10 mM EDTA, pH 8.0, Rnase A
pha ngay trước khi dùng trong đệm P1 nồng độ 100
µg/ml
B
ảo quản