-
BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO BỘ QUỐC PHÒNG
HỌC VIỆN QUÂN Y
HOÀNG XUÂN SỬ
NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR - RFLP
XÁC ĐỊNH KIỂU GEN CỦA VIRUS VIÊM GAN B
LUẬN VĂN THẠC SỸ Y HỌC
Chuyên ngành : Vi sinh y học
Mã số : 62.72.68.05
Hướng dẫn khoa học: TS. BS. NGUYỄN LĨNH TOÀN
Hà Nội 2009
2
-
ĐẶT VẤN ĐỀ
Nhiễm virus viêm gan B (Hepatitis B virus, HBV) là một trong những
nhiễm trùng phổ biến nhất ở loài người và là một vấn đề y tế lớn của nhiều
quốc gia trên thế giới trong đó có Việt Nam. Mặc dù đã có vaccine phòng
nhiễm HBV đặc hiệu nhưng tỷ lệ nhiễm virus này đến nay vẫn còn rất cao.
Theo ước tính hiện nay trên thế giới đã có khoảng 2 tỷ người đã nhiễm HBV,
trong đó đang có gần 400 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính, chiếm 6%
dân số thế giới [23]. Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từ
người mang virus không triệu chứng, viêm gan cấp tính tự hồi phục, viêm gan
tối cấp đến viêm gan mạn, xơ gan và ung thư biểu mô tế bào gan
(UTBMTBGUTTBG) [8], [243] [53], [72]. Ước tính mỗi năm có hơn một
triệu người chết do hậu quả của nhiễm HBV mạn tính [Lee57, 1997]. Vậy câu
hỏi đặt ra là tại sao cùng nhiễm HBV mà lại gây các bệnh cảnh lâm sàng khác
nhau. Một trong nhiều lý do của sự khác nhau đó là do đáp ứng miễn dịch của
vật chủ, đặc điểm di truyền tế bào và chính bản thân virus như sự khác biệt về
kiểu gen (genotype), đột biến vùng gen S, preCore, Core của HBV cũng có
liên quan nhất định đến bệnh sinh và đáp ứng điều trị của các thuốc kháng

microarray [8692] và đặc biệt là phương pháp PCR - RFLP (PCR - restriction
fragment length polymorphism) [38], [39], [57]. Ở Việt Nam phổ biến hiện
nayđang sử dụng phương pháp đọc trình tự gen, lai đầu dò và multiplex -
PCR [5], [8], [19]. Tuy nhiên, các phương pháp này giá thành khá cao, cần
nhiều trang thiết bị đắt tiền và mất khá nhiều thời gian.
Vì vậy, nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen
HBV có ý nghĩa quan trọng góp phần làm giảm giá thành xét nghiệm, phổ
biến kỹ thuật, tiết kiệm thời gian và đầu tư trang thiết bị cũng như mang lại
4
-
lợi ích về kinh tế và tiết kiệm chi phí điều trị cho người bệnh. Chính vì những
lý do đó chúng tôi tiến hành đề tài này với mục tiêu:
1. Xác định điều kiện tối ưu và lựa chọn enzyme giới hạn thích hợp
cchoủa kỹ thuật PCR - RFLP xác định kiểu gen HBV.
2. Đánh giá độ đặc hiệu và sự phù hợp của kỹ thuật PCR - RFLP xác
định kiểu gen HBV so với kỹ t
huật đọc trình tự gen.
CHƯƠNG 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Tình hình nhiễm virus viêm gan B
1.1.1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới và Việt Nam
1.1.1.1. Tình hình nhiễm HBV trên thế giới
Mặc dù đã có vaccine phòng nhiễm virus viêm gan B (hepatitis B virus,
HBV) đặc hiệu, nhưng nhiễm HBV vẫn đang là vấn đề mang tính toàn cầu.
Nhiễm HBV có thể gây nên nhiều thể bệnh khác nhau từ người mang virus
không triệu chứng, viêm gan cấp tính tự hồi phục đến viêm gan mạn, xơ gan
và ung thư biểu mô tế bào gan (UTBMTBGUTTBG) [Acharya SK và CS,
200021], [23], [5357]. HBV có thể lây qua đường tình dục, đường máu, từ mẹ
sang con. Ước tính hiện nay trên thế giới đã có khoảng 2 tỷ người đã nhiễm
HBV, trong đó đang có gần 400 triệu người đang nhiễm HBV mạn tính.

sinh
Hiếm Không phổ biến Phổ biến

Phân bố
Tây Âu,
Bắc Mỹ,
Australia
Địa Trung Hải,
Liên Xô cũ, Đông
Âu, Trung Đông,
Nam Mỹ, Nhật Bản
Trung Quốc,
Đông Nam Á,
Hạ Sahara,
Châu Phi
1.1.1.2. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam
Ở Việt Nam rất nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng tỷ lệ nhiễm HBV đứng
hàng cao nhất thế giới. Tần suất có HBsAg (+) ở người lớn từ 15 đến 21%
6
-
thậm chí có nơi lên đến 26% và ước tính chúng ta đang có hơn 10 triệu người
mang HBV mạn tính [3], [4], [16], [20], [6266]. Tỷ lệ mang anti - HBs trên
60%. Tuy vậy, tỷ lệ nhiễm HBV ở từng nhóm đối tượng, từng vùng theo từng
tác giả cũng khác nhau [6266].
Theo Phạm Song và cộng sự CS thấy tỷ lệ nhiễm HBsAg ở 6 - 14%,
anti - HBs ở 35 - 37% số người không mắc bệnh gan và tăng theo lứa tuổi.
Nguyễn Anh Tuấn bằngvới kỹ thuật miễn dịch phóng xạ (RIA:
Radioimmunoassay) đã phát hiện 11% số người khỏe mạnh có HBsAg (+)
[3], [16]. Tình hình nhiễm HBV ở Việt Nam được các nghiên cứu công bố
gần đây tóm tắt ở bảng 1.2.

1994
Tiền
Giang
Trần Minh Phụng Người tự nguyện và
công nhân
21, 28 1995
Lâm Đồng Hoàng Công Long Số liệu của phòng xét
nghiệm
16, 74 1994
Bình
Thuận
Lê Khai Thọ Số liệu của phòng xét
nghiệm
17, 68 1994
An Giang Châu Hữu Hầu Cộng đồng
Bệnh viện
11, 0
16, 2
1995
1995
7
-
Thanh
Hóa
David B. Hipgrave,
Nguyen Thu Van và
CS.
Cộng đồng (n=1579)
Sơ sinh
Trẻ em

1.1.3. Cấu trúc của HBV
1.1.3.1. Hình thể và cấu trúc của HBV
HBV là một thành viên thuộc họ Hepadnaviridae, là một loại virus
hướng gan (hepatotropic) có bộ gen (genome) là chuỗi xoắn kép DNA đóng
vòng không kín, có capside và quá trình nhân lên không gây tan tế bào gan
nhiễm virus [3639]. Dưới kính hiển vi điện tử (Hình 1.1A) quan sát thấy HBV
tồn tại dưới 3 loại tiểu thể khác nhau:
+ Tiểu thể hình cầu nhỏ (small particle) có đường kính 22 nm.
+ Tiểu thể hình ống (tubular particle) kích thước 22nm dài 40 - 400nm.
+ Tiểu thể hình cầu lớn (large particle) có kích thước 42 - 45 nm. Đây
chính là hạt virus hoàn chỉnh (Tiểu thể Dane) có cấu tạo gồm 2 lớp [3336]:
- Bao ngoài: Lớp bao ngoài có bản chất là Lipoprotein. Lớp này có các
kháng nguyên bề mặt (HBsAg).
- Lớp lõi: Capside đối xứng hình hộp có chứa các kháng nguyên lõi
HBcAg. Bên trong lõi có chứa bộ gen HBV gồm 2 sợi DNA đóng vòng
không kín, enzyme DNA phiên mã ngược- polymerase và protein kinase
(A) (B)
9
-
Hình 1.1. (A) HBV nhìn dưới kính hiển vi điện tử (ABock CT &
Zentgraf, 1992) và (B) mô hình hóa cấu trúc (BLee, 1997), Tiểu thể Dane
(C)
10
-
1.1.3.2. Cấu trúc bộ gen của HBV
Bộ gen (Genome) của HBV là một phân tử DNA đóng vòng không kín
gồm 2 sợi có kích thước khác nhau. Sợi ngoài nằm bên ngoài mang cực tính
âm tạo nên một vòng tròn liên tục có chiều dài cố định là 3200 cặp base và mã
hóa cho toàn bộ thông tin di truyền của HBV. Sợi ngắn nằm bên trong cực
tính dương có chiều dài thay đổi bằng 50 - 80% so với sợi âm [2], [11],

hóa tổng hợp phân tửprotein kháng nguyên bề mặt của HBV hay HBsAg
(Hepatitis B surface Antigen) bao gồm HBsAg nhỏ, HBsAg trung bình và
HBsAg lớn.
- Đoạn gen S tổng hợp nên protein S (Small) có chiều dài 34 kD gồm
226 acid amin (aa). Protein này gồm 2 thành phần là p24 và gp27 (gp:
Glycoprotein). Đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số. Người ta phát hiện ở
vùng S có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) của
HBsAg. Tùy theo sự phân bố của các quyết định kháng nguyên mà người ta
phân ra các phân type khác nhau. Mỗi phân type đều có chung quyết định
kháng nguyên “a” và khác nhau tùy theo sự ghép cặp của các quyết định
12
-
kháng nguyên “d” hoặc “y” ghép với “w” hoặc “r” để tạo nên các phân type
như adw, ayw, adr, ayr. Chính vùng “a” có liên quan đến tính miễn dịch vì nó
quyết định cho sự tổng hợp anti - HBs.
- Đoạn gen S và preS2 tổng hợp nên protein M (Medium) có chiều dài
33 kD gồm 281 aa. Protein này gồm 2 loại gp33 và gp36. Người ta cho rằng
vùng preS2 có vai trò giúp cho HBV bám dính và xâm nhập vào trong tế bào
gan nhờ nó liên kết với 1 loại albumin được trùng hợp trong huyết thanh
người (pSHA: polymerised Human Serum Albumin), đồng thời trên các tế
bào gan cũng có các thụ thể để gắn với pHSA. Nếu trên tế bào gan thiếu các
thụ thể này thì có thể làm cho tế bào gan có khả năng kháng với sự nhiễm
HBV.
- Đoạn gen S, preS1 và preS2 tổng hợp nên protein L (Large) có chiều
dài 39 kD gồm 2 loại p39 và gp42. Chuỗi protein pre S1 có chiều dài thay đổi
tùy theo phân type khác nhau. Đây là vùng chủ yếu mà các thụ thể trên bề mặt
của tế bào gan sẽ liên kết với HBV, giúp HBV xâm nhập vào trong tế bào
gan. Kháng thể anti - preS1 có thể trung hòa và ức chế HBV kết dính ở tế bào
gan. Cả 3 loại protein này hiện diện với số lượng khác nhau trên bề mặt của
virion, trong đó protein S chiếm đa số. Protein M chiếm khoảng 5 - 10% trong

transcriptiont - polymerase). Enzyme này vừa có hoạt tính DNA polymerase
phụ thuộc RNA lại vừa có hoạt tính DNA polymerase phụ thuộc DNA.
Enzyme DNA polymerase được dùng để tổng hợp một DNA mới từ RNA tiền
genome (pregenome) mà sợi RNA tiền genome này lại được tạo ra từ khuôn
mẫu là DNA của HBV dưới tác dụng của enzyme RNA polymerase của tế
bào gan. Sản phẩm enzyme P không chỉ liên quan đến cơ chế phiên mã ngược
mà còn tham gia vào việc tạo ra phần capside bao bọc bên ngoài cấu trúc
RNA tiền genome.
14
-
* Gen X mã hóa HBx protein có kích thước 154 aa, trọng lượng phân
tử 17 kD (Diao và CS, 2001) [3437] là một protein nhỏ nhất trong các protein
của HBV. Trong các protein của HBV, HBx được cho là một protein có vai
trò trung tâm trong quá trình nhiễm virus và bệnh sinh ung thư tế bào
ganUTTBG (Paterlini P và CS, 1999) [7781]. Đây là một protein điều hoà đa
chức năng; có thể truyền đạt thông tin trực tiếp hoặc gián tiếp cho nhiều gene
đích của tế bào; làm trung gian, hoặc đối lập với nhiều chức năng khác nhau
của tế bào, bao gồm điều hoà chu trình tế bào, quá trình sao chép, dẫn truyền
tín hiệu, mã hoá tổng hợp các phân tử kết dính, hoạt hoá các gene sinh ung
thư hoặc gene ức chế ung thư của tế bào (Pang R, và CS, 2006; Peng Z, và CS
2005) [740], [751]. Nhiều nghiên cứu cho thấy HBx có những vai trò chính
sau:
- HBx hoạt hoá sao chép (Transcriptional transactivation): Người ta đã
chứng minh rằng HBx-protein hoạt hoá biểu hiện các gen thông qua tác động
trên các con đường điều hoà biệt hoá tế bào. Tác động này phụ thuộc vào sự
phân bố của HBx ở các khu vực khác nhau trong tế bào. Các nghiên cứu theo
hướng này cho thấy HBx - protein phân bố chủ yếu ở bào tương, một số ít ở
trong nhân và màng nhân tế bào. Vì thế, HBx tác động tăng cường điều hoà
các dòng tín hiệu chủ yếu ở bào tương như MAPK/ERK (Mitogen Activated
Protein Kinasse/Extracellular-respone kinase), hoạt hoá các genegen tiền ung

- HBx điều hoà chu kỳ tế bào: Có rất nhiều yếu tố tham gia điều hoà chu
kỳ phát triển tế bào như hoạt hoá cyclin, cyclin dependent kinase (CDKs) và
CDK inhibitors (CDKIs) HBx làm tăng tỷ lệ và mức độ hoạt hoá CDK2 và
các cyclin E, A hoặc B (Bouchard và CS, 2001) [297] và gây biểu hiện quá
mức cyclin D1 (Klein và CS, 2003) [551]. GeneGen Rb là một genegen ức chế
16
-
quá trình tăng trưởng tế bào và có vai trò nhất định trong điều khiển sự nhân
lên của tế bào.
1.1.4. Sự nhân lên của HBV trong tế bào gan
Trong chu trình nhân lên của HBV có giai đoạn sao chép ngược từ RNA
để tạo nên một DNA mới nhờ enzyme sao chép ngược (reverse transcriptase).
HBV có tỷ lệ đột biến rất cao vì enzyme này hay bị sai sót trong khâu sao
chép. Quá trình nhân lên của HBV gồm nhiều giai đoạn [11], [462].
* Giai đoạn tạo ra một DNA dạng siêu xoắn (supercoiled DNA): Sau khi
xâm nhập vào trong tế bào gan nhờ cơ chế xâm nhập tế bào (endocytosis),
HBV đã phóng thích phần vỏ chỉ còn phần lõi có chứa phân tử DNA để đi
vào trong nhân tế bào. Ban đầu phân tử DNA vòng có chuỗi trong ngắn hơn
chuỗi ngoài nhưng khi vào trong nhân tế bào gan nhờ enzyme DNA
polymerase sẽ bổ sung cho chiều dài của chuỗi trong tạo nên một DNA vòng
khép kín với hai chuỗi dài bằng nhau và bị xoắn cuộn lại nhờ các liên kết
đồng hóa trị. DNA này viết tắt là cccDNA (covalently closed circular DNA).
Sự xuất hiện của cccDNA trong tế bào gan bị nhiễm giữ vai trò quan trọng
trong việc duy trì tình trạng mạn tính của nhiễm HBV hay sự tái phát của
bệnh.
* Giai đoạn tổng hợp sợi RNA tiền genome.
Sợi RNA tiền genome được tổng hợp từ sợi âm của cccDNA dưới tác
dụng xúc tác của enzyme RNA polymerase II ở tế bào. Sợi RNA tiền genome
này có chiều dài 3,5kb và bị dư ở hai đầu của một đoạn thừa R (R: redundant)
từ 150 - 200 Nu. và bao gồm cả trình tự DR1. Sợi RNA tiền genome chứa

của sợi RNA tiền genome và bao gồm cả trình tự DR1. Quá trình nhân lên
được tiếp tục nhờ sự khép vòng (circulation) của sợi DNA thông qua hiện
tượng lai ghép (hybridation) giữa chuỗi dài với chuỗi ngắn.
18
-
Trong lúc này phần lõi của HBV sẽ được lắp ghép thêm phần vỏ bọc rồi
được bài tiết qua hệ thống lưới nội bào thương để phóng thích ra khỏi tế bào
gan đi vào tuần hoàn hoặc để vào lại một tế bào gan khác để hình thành một
chu trình nhân lên mới. Mặt khác, sợi RNA tiền genomic ở trong bào tương
có thể vào lại nhân tế bào để hình thành một chu trình nhân lên mới chính trên
tế bào gan đó (Hình 1.3). Chính sự vào lại chu trình nhân lên này sẽ góp phần
duy trì sự tồn tại của dạng cccDNA trong tế bào gan. Khi phần capside được
bao bọc sẽ làm gián đoạn hoạt động của enzyme DNA polymerase, cho nên
sự tổng hợp của sợi DNA mang cực tính dương thường không hoàn toàn, do
đó chuỗi trong thường ngắn hơn chuỗi ngoài.

Hì×nh 1.3. Chu trì×nh nhâ©n lêªn củña HBV ([Ganem vൠPrince, 2004)]
19
-

Hình 1.3. Quá trình xâm nhập và nhân lên của HBV
1.1.5. Sinh lý bệnh trong nhiễm HBV
1.1.5.1. Đáp ứng miễn dịch trong nhiễm HBV
* Đáp ứng miễn dịch tế bào: Đây là cơ chế chính gây tổn thương tế bào
gan và thải trừ HBV ra khỏi cơ thể [8], [11], [14], [462].
+ Đại thực bào: lưu hành trong máu và tổ chức, ở các cơ quan khác
nhau có tên gọi khác nhau như đại thực bào phế nang ở phổi, tế bào Kuffer ở
gan, tế bào thần kinh đệm ở tổ chức thần kinh, tế bào có tua (dendritic cell) ở
tổ chức hạch lympho. Đại thực bào có nhiệm vụ bắt, tiêu diệt các tế bào
nhiễm HBV và trình diện kháng nguyên HBV lên bề mặt ngay cạnh phân tử

+ Tế bào giết tự nhiên NK (Natural Killer): Các tế bào này trực tiếp phá
hủy tế bào gan bị nhiễm HBV không thông qua quá trình mẫn cảm đặc hiệu
nào. Trong bệnh nhân VGVR B cấp, Choong và cs thấy tỷ lệ tế bào NK ở
nhóm bệnh nhân có HBsAg (+) cao hơn nhóm HBsAg (-).
21
-
* Đáp ứng miễn dịch dịch thể:
Các kháng thể đặc hiệu là: các kháng thể kháng HBV có vai trò khác
nhau trong thải trừ virus ra khỏi cơ thể.
+ Anti - HBs: Là kháng thể kháng lại kháng nguyên HBsAg. Đây là
kháng thể có khả năng giúp cơ thể bảo vệ chống lại HBV, chính nhờ có đặc
tính này vaccine dự phòng viêm gan B ra đời, trên cơ sở tạo miễn dịch chủ
động từ kháng nguyên HBsAg. Hoàng Vũ Hùng khi nNghiên cứu sự biến
động các marker dấu ấn của HBV trên bệnh nhân VGVR B cấp chođã nhận
thấy: 8,2% bệnh nhân xuất hiện anti - HBs (+) sau khi ra viện, 37,3% sau 1
tháng và 85,7% sau 3 tháng. Tất cả bệnh nhân mang HBsAg mạn tính đều
không xuất hiện Anti - HBs [13].

+ Anti – PreS1q, anti - PreS2 chỉ có vai trò tiên lượng trong VGVR B
cấp mà không có vai trò gì trong cơ chế bệnh sinh. Trong khi đó
+ A anti - HBc (anti - HBc-IgM và -–IgG) có vai trò chỉ điểm trong chẩn
đoán xác định giai đoạn của bệnh như nhiễm HBV cấp, hay mạn hay bán cấp.
+ Anti - HBe có giá trị tiên lượng bệnh, khi bệnh nhân chuyển từ
HBeAg(+) sang HBeAg(-) và anti - HBe (+) thì người bệnh đã có chuyển đảo
huyết thanh (seroconversion) tức là quá trìnhsự nhân lên của virus HBV đã bị
khống chế.
+ Các cytokine: Cytokine được sinh ra trong quá trình đáp ứng miễn dịch
với HBV rất phong phú và đa dạng. Mỗi cytokine có một chức năng khác
nhau:
- IL1 - IL13 có chức năng điều hòa miễn dịch.

• Giai đoạn dung nạp miễn dịch (immuno - tolerance)
Tạo điều kiện cho HBV được nhân lên rất nhiều nhưng các tổn
thương tế bào gan lại rất ít. Trong giai đoạn này đáp ứng miễn dịch của
CTL (Cytotoxic T Lympho) bị suy giảm, có thể do giảm hoạt động của
lympho bào TCD4+, do giảm sự biểu thị kháng nguyên của

hòa hợp tổ
chức

MHC (Major Histocapatibility Complex) lớp I trên bề mặt tế bào
gan bị nhiễm, hoặc do giảm khả năng nhận diện kháng nguyên vì bị các
anti - HBc cản trở.
• Giai đoạn thanh thải miễn dịch (clearance)
Biểu hiện bằng những đợt bùng phát của viêm gan và xuất hiện các tổn
thương viêm gan mạn hoạt động do hoạt tính của CTL và lympho TCD4+
được khôi phục để ức chế sự nhân lên của HBV và làm xuất hiện sự chuyển
đảo huyết thanh từ anti - HBe (-) sang (+).
• Giai đoạn hòa nhập (intergration)
Khi HBV hòa nhập chất liệu di truyền vào DNA của tế bào gan, lúc đó
HBsAg vẫn được sản xuất mặc dù HBV không còn hoạt động nhân lên. Trong
giai đoạn này, tổn thương của viêm gan hoạt động rất hạn chế, enzyme ALT
và AST không tăng tuy nhiên trên mô học có thể đã xuất hiện xơ gan.
+ Người lành mang HBsAg không triệu chứng (healthy carriers)
Đây là một tình trạng khá đặc biệt, trong đó vật chủngười mang HBsAg
HBV mạn tính nhưng không có các biểu hiện triệu chứng trên lâm sàng và
không có các tổn thương gan tiến triển, enzyme ALT và AST hoàn toàn bình
thường. Cơ chế của hiện tượng này hiện nay chưa thật rõ ràng. Tuy nhiên,
người ta thấy rằng Ssự nhân lên của virus thường rất thấp biểu hiện bằng nồng
độ HBV - DNA nhỏ hơn 2000 IU/ml, HBeAg (-), anti - HBe (+). Tình trạng
này có thể được giải thích là do có sự dung nạp tương đối về miễn dịch giữa