BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, em xin được bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc đến cô
giáo ThS. Lưu Thúy Hòa, Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng và
Ban lãnh đạo Viện Sinh – Nông, trường Đại học Hải Phòng đã nhiệt tình chỉ
bảo, giúp đỡ em rất nhiều và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong quá trình thực
tập.
Đồng thời em cũng xin được trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo và
các cộng tác viên hiện đang công tác tại Bộ môn thực vật, Bộ môn Hóa phân
tích của Trường đại học Dược Hà Nội và Bộ môn Kỹ thuật di truyền của Viện
Di truyền nông nghiệp (thuộc Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam) đã tạo
mọi điều kiện thuận lợi cho em thực hiện những công việc liên quan trong quá
trình thực tập.
Cuối cùng, tôi cảm ơn sâu sắc đến gia đình, bạn bè, đặc biệt là ba mẹ đã
luôn ở bên động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình thực tập này.

Hải Phòng, ngày 2 tháng 6 năm 2016
Sinh viên

Nguyễn Hùng Cường


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường


Amplified Fragment Length Polymorphism (Tính đa hình chiều

dài các phân đoạn được nhân bản)
cs

Cộng sự

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotit triphotphat

EDTA

Ethylene Diamin Tetraaxetic Acid

Kb

Kilobase

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

RAPD

Random Amplified Polymorphism DNA (Phân tích ADN đa


CTAB

Cetyl trimethylammonium bromide

EtBr

Ethidium bromide

ISSRs

Inter Simple Sequence Repeats

rDNA

Ribosomal DNA

HPLC

High Performance Liquid Chromatography


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

PHẦN 1. MỞ ĐẦU
1.Đặt vấn đề


Ranunculaceae,

Rutaceae


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Papaveraceae ( Nguyễn Kim Cẩn, 2002). Trong đó, các cây thuộc họ
Berberidaceae bị khai thác triệt để để làm thuốc và buôn bán ở thị trường trong
nước để làm thuốc (Hoàng liên, Hoàng liên ô rô,…) và xuất khẩu qua Trung Quốc.
Điều này dẫn đã dẫn đến sự cạn kiệt nguồn tài nguyên các loài cho berberin ở Việt
Nam và trở thành những cây thuốc quý hiếm được ghi trong sách đỏ (Nguyễn Tiến
Bân, 2007).
Việc phân loại các loài trong chi Berberis, Mahonia, Podophyllum trong họ
Berberidaceae rất phức tạp với những đặc điểm hình thái giống nhau giữa các loài
trong cùng chi. Sự phân biệt giữa các loài khó khăn do phần trăm đa bội cao và do
lai tạo (Cadic và Decourtye 1987). Điều này đã dẫn đến nhầm lẫn trong việc xác
định loài trong thu hái, sử dụng.
Trên thế giới đã có những nghiên cứu phân biệt các loài trong chi ở mức độ
phân tử đối với một số loài B. asiatica Roxb, B. aristata DC., B. lycium Royle
(Subramani Paranthaman Balasubramani và cs, 2011; Vivek Tripathi và cs,
2013,... ), loài Podophyllum hexandrum (Md. Afroz và cs, 2009, Pradeep Kumar
Naik và cs, 2010; Akshay Nag và cs, 2013) hoặc so sánh các loài trong họ
Berberidaceae (C. Roß và W. Durka, 2006, Mehdi Rezaei và cs, 2011) nhưng ở
Việt Nam vẫn chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu đánh giá, tư liệu hoá


Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

PHẦN 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.Vị trí phân loại khoa học
Họ Hoàng mộc, còn gọi là họ Hoàng liên gai (Berberidaceae), là một họ
của khoảng 14-15 chi thực vật có hoa. Họ này thuộc bộ Mao lương
(Ranunculales). Họ chứa khoảng 570-700 loài, trong đó phần lớn (khoảng 450-600
loài) thuộc về chi Berberis. Các loài trong họ là các loại cây thân gỗ, cây bụi hoặc
cây thân thảo chủ yếu là thường xanh.
Phân loại khoa học của họ Berberidaceae trong hệ thống phân loại thực
vật như sau (Lê Đình Bích và Trần Văn Ơn, 2007):
Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Hoàng liên (Ranunculidae)
Liên bộ Hoàng liên (Ranunculanae)
Bộ Hoàng liên (Ranunculales)
Họ Hoàng liên gai (Berberidaceae)
Các chi
Achlys
Berberis - hoàng liên gai (hoàng mù), hoàng mộc, tiểu bá, nghêu hoa
Bongardia
Caulophyllum - hồng mao thất
Diphylleia - sơn hà diệp
Dysosma - bát giác liên
Epimedium - dâm dương hoắc
Gymnospermium
Jeffersonia - tiên hoàng liên

măng, có rãnh hoặc không, có gai hoặc không, gai đơn hoặc chia làm 3-5 nhánh.
Lá đơn, mọc so le, mép có gai, nguyên hay cuốn ngoài.
Hoa đơn độc hay mọc thành cụm, dạng chùm, tán hoặc chùy. Hoa màu
vàng bóng, da cam, vàng đo đỏ, hay vàng nhạt, có khi vàng lục. Hoa mẫu 3; lá bắc
con thường 3, sớm rụng, dạng vảy. Đài 6, hiếm khi 3 hoặc 9, màu vàng. Tràng 6,
10


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

màu vàng, móng có mật. Nhị đối diện tràng; bao phấn mở bằng van. Bầu nhụy đối
xứng dạng chùy; noãn 1-12, hiếm khi 15; vòi nhụy rất ngắn. Quả mọng, thường
màu đỏ, đỏ sẫm hoặc đen; hình cầu, hình elip, thuôn dài, hình trứng hoặc trứng
ngƣợc; kích thước 6-20mm; vòi nhụy tồn tại hoặc không. Hạt 1-10, màu nâu đến
nâu đỏ hoặc đen, không có áo hạt (Võ Văn Chi, 2003; Ying Tsunshen, 2011)

Hình 2.1. Chi Berberis
Ở nước ta loài Berberis phân bố chủ yếu ở Sapa, trên núi Phan-xi-păng vùng
Bắc Hà thuộc tỉnh Lào Cai. Cây mọc trong rừng kín thường xanh mưa mùa ẩm,
rừng núi đá, ở độ cao khoảng 1000-1600m. Mùa hoa tháng 5-6, mùa quả tháng 610 (Võ Văn Chi, 2003).
2.3. Đặc điểm thực vật của chi Mahonia
Cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ, thường xanh, cao 0,3 – 8 m. Không gai. Lá
kép hình lông chim lẻ, mọc so le, không cuống hoặc có cuống; lá chét 3 -4; lá chét
bên thường không cuống, lá chét tận cùng có cuống hoặc không cuống; mép lá
nguyên hay có khía răng thô hay đẹp. Cụm hoa mọc ở tận cùng, (1-) 3 – 18 chùm
11

Lớp: Công nghệ sinh học K13

2.4. Đặc điểm thực vật chi Podophyllum
Podophyllum là một chi của các loài cây lâu năm thân thảo trong họ
Berberidaceae có nguồn gốc Đông Á và Đông Bắc Mỹ
Cây thảo sống nhiều năm, cao 30 - 50cm, thân rễ thô to, mọc ngang. Thân
thường mang một đến hai lá, đính lá dạng ngù. Phiến lá rộng đến 30cm, có 4 - 9
thùy nông, thùy dạng tam giác rộng hoặc hình tròn dài dạng trứng, đỉnh nhọn sắc,
mép lá có răng nhỏ. Hoa màu hồng đậm, gồm 5 - 8 hoa mọc tập trung ở gốc lá, hoa
rủ xuống, cuống hoa nhỏ, dài, cong. Lá đài 6, mặt ngoài có ít lông dài. Cánh hoa 6
dài 2cm. Nhị 6. Bầu thượng, đầu nhụy to, quả mọng hình bầu dục hoặc hình trứng.
Hạt nhiều.
Mùa hoa tháng 3 - 5, mùa quả chín tháng 7 - 9. Cây tái sinh bằng chồi từ
thân rễ vào vụ xuân hè. Cây sống dưới tán rừng ẩm trên núi, ở độ cao 800 - 900 m.
Mọc rải rác trên đất rừng nhiều mùn, ẩm, độ chiếu sáng yếu.
Ở Việt Nam các loài Podophyllum phân bố chủ yếu ở Hoà Bình (Đà bắc:
Chợ Bờ), Hà Tây (Ba Vì), Lạng Sơn (núi Khau Khú)

Hình 2.3. Chi Podophyllum
13


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

3. Công dụng và tình hình khai thác sử dụng của các loài chứa berberin
Berberin là alcaloid có nhân isoquilolin, có trong khoảng 150 loài thực vật

BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Gen - thể hiện bản chất di truyền, thường thể hiện một hay nhiều tính trạng có thể
đo đếm được – gen đó xem như gen chỉ thị. Chỉ thị hình thái là một trong những
phương pháp sơ khai trong việc đánh giá sự đa dạng di truyền.
Tuy nhiên, số chỉ thị hình thái hiện diện trong tự nhiên cũng rất ít, không thỏa
mãn yêu cầu của nhiều chương trình chọn giống và chỉ có quy mô hình thái (cơ 19
quan) hoặc ở giai đoạn phát triển đặc biệt của cá thể. Sự thể hiện các chỉ thị hình
thái bị ảnh hưởng bởi điều kiện môi trường, điều này làm cho chỉ thị hình thái kém
thu hút trong cải tiến giống cây trồng.
4.2. Chỉ thị dựa trên cơ sở lai ADN
RFLP - Restriction Fragment Length Polymorphism, Đa hình chiều dài các
mảnh phân cắt giới hạn. Các đa hình RFLP sinh ra bởi những đột biến tự nhiên ở
những điểm cắt enzym giới hạn trong ADN bộ gen. Mỗi loài sinh vật có một bộ
ADN genom đặc hiệu trong cấu trúc, vì vậy khi sử dụng những enzym giới hạn để
cắt phân tử ADN của hệ gen, người ta có thể nhận biết được những đoạn ADN có
chiều dài khác nhau bằng kỹ thuật lai ADN với những mẫu dò (probe). Đây là
nguyên lý kỹ thuật RFLP.
Chỉ thị RFLP là chỉ thị đồng trội, nghĩa là có khả năng biểu hiện tất cả các
alen của cùng một locus. Do vậy, có thể phân biệt được các cá thể đồng hợp tử
(AA hoặc aa) và các cá thể dị hợp tử (Aa). Đây là đặc điểm ưu việt của loại chỉ thị
này. Hạn chế của phương pháp này là tiêu tốn nhiều thời gian và sức lực, đòi hỏi
nhiều trang thiết bị phòng thí nghiệm, đặc biệt là tiêu hao một lượng lớn ADN mà
số lượng đa hình thu được rất ít ỏi, thậm chí ở một số loài khó nhận được đa hình.
4.3. Chỉ thị phân tử dựa trên kỹ thuật PCR
Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction - PCR) được Kary

gen, sử dụng những đoạn mồi đơn lẻ, ngẫu nhiên (random primer) dài khoảng 9-10
nucleotit dưới nhiệt độ kết cặp thấp (khoảng 370C) (Williams và cs., 1990). Sản
phẩm của phản ứng được phân tách bằng điện di trên gel agarose, nhuộm trong
ethidium bromide và quan sát dưới tia cực tím. RAPD sinh ra những chỉ thị trội bởi
sự có mặt hay vắng mặt những alen ADN đặc trưng. Hạn chế của loại chỉ thị này
so với chỉ thị đồng trội RFLP là không phân biệt được thể dị hợp tử. Mặc dù vậy,
chỉ thị này vẫn là một công cụ hữu hiệu trong việc lập bản đồ ở những dòng nhị
16


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

bội, những dòng cận phối hay các quần thể lai trở lại. Lợi thế của loại chỉ thị này là
không cần biết những thông tin về trình tự (William và cs., 1993). Chỉ thị RAPD
còn có thể sử dụng trong việc điền vào những chỗ trống trên bản đồ phân tử RFLP
(Chang và Meyerowitz, 1991), lập bản đồ gen kháng đạo ôn ở lúa (Naqvi và cs.,
1995).
- Những ưu điểm của kỹ thuật RAPD
Về mặt kỹ thuật: Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không
cần biết trước trình tự bộ gene của đối tượng cần nghiên cứu, thao tác đơn giản,
chất lượng.
ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao. Thời gian thực hiện nhanh, khả
năng nhân bản cao.
Về mặt kinh tế: Chi phí thực hiện thấp. Kỹ thuật RAPD thường được sử
dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác để đánh giá đa dạng di truyền và
nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao.

giống lúa ở Việt Nam (Nguyễn Thị Lang, 2002). Ngoài ra kỹ thuật RAPD còn
được áp dụng xây dựng bản đồ gen (Nguyễn Thị Lang, 2002).
-

Những cải tiến của kỹ thuật RAPD
Đã có vài cải tiến của kỹ thuật RAPD được mô tả. Kỹ thuật thứ nhất là sử

dụng cùng lúc 2 primer khác nhau thay vì sử dụng 1 primer như kỹ thuật RAPD
thông thường. Phương pháp này có thể làm tăng hoặc giảm đi số alen so với khi sử
dụng một primer. Việc lựa chọn, sử dụng cùng lúc 2 primer khác nhau một cách
phù hợp cũng có thể làm tăng tính đa hình của những primer cho sản phẩm ít đa
hình. Cải tiến thứ 2 là cắt ADN bằng các enzyme giới hạn trước hoặc sau khi thực
hiện phản ứng PCR. Sự cắt này cũng có thể tạo ra hai kết quả. Một là có thể làm
giảm số lượng các alen khó xác định (complex band), điều đó làm dễ dàng hơn cho
việc đánh giá đa dạng di truyền. Hai là tạo ra sự đa hình ở các mẫu có hạn chế về
sự đa hình. Tuy nhiên việc sử dụng những cải tiến tuỳ thuộc vào chiến lược nhằm
làm tăng số chỉ thị đa hình có thể hoặc đạt được các chỉ thị đồng trội. Những cải
tiến này có hạn chế là làm giảm đi lợi thế của kỹ thuật RAPD cụ thể là tốc độ, giá
thành và sử dụng phức tạp hơn (Kurt Weising và cs, 1995).

18


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Hình 2.4. Nguyên lí của phản ứng RAPD

enzym EcoRI và MseI, sẽ có 3 loại mảnh cắt gồm: mảnh có hai đầu cắt bởi MseI,
mảnh có hai đầu cắt bởi EcoRI, mảnh cắt có một đầu là EcoRI và một đầu là MseI.
+ Bước 2: Nhân bội những mảnh cắt giới hạn sử dụng mồi đặc hiệu bổ sung
với trình tự của bộ thích ứng và trình tự giới hạn của enzym. Bước này được thực
hiện nhằm giảm bớt số lượng quá lớn của các mảnh ADN sau khi cắt và gắn bộ
thích ứng. Sự nhận bội chọn lọc đạt được bởi sử dụng những mồi được kéo dài
phía điểm cắt giới hạn bằng cách thêm các nucleotid vào vị trí cắt. Do vậy mà chỉ
có những mảnh ADN có trình tự bổ trợ với các base thêm vào mới được nhân bội.
Phản ứng thứ nhất gọi là nhân bội sơ bộ (pre-amplification) hay tiền nhân bội.
Phản ứng thứ hai gọi là nhân bội chọn lọc (selective PCR). Các mồi AFLP gồm có
ba phần: Chuỗi cốt lõi (CORE), chuỗi đặc hiệu enzym (ENZ) và phần thêm vào
các nucleotit chọn lọc (EXT).
Sử dụng phương pháp này có thể tạo ra một bộ tập hợp những mảnh cắt giới
hạn nhờ PCR mà không cần biết trình tự của chúng, cho phép nhân đặc hiệu một số
lượng lớn những mảnh cắt giới hạn. Một bộ gồm tập hợp lượng lớn những mảnh
cắt ADN có thể phân tích đồng thời, phụ thuộc vào độ phân giải của hệ thống phát
hiện.
+ Bước 3: Điện di các sản phẩm của phản ứng PCR nhờ hệ thống chạy điện
di trên gel polyacrylamit. Thường là từ 50-100 mảnh cắt giới hạn được nhân lên và
20


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

phát hiện trên gel polyacrylamit biến tính nhờ sử dụng đồng vị phóng xạ hoặc
nhuộm bạc. Kỹ thuật AFLP cung cấp khả năng nhận dạng ADN lý tưởng từ ADN

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

truyền trội, do đó không thể phân biệt giữa thể đồng hợp tử và dị hợp tử, và giá
thành cho nghiên cứu là tương đối cao.

Hình 2.4. Nguyên lí của phản ứng AFLP
4.7. Chỉ thị vi vệ tinh (SSR)
22


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Chỉ thị vi vệ tinh, là những đoạn ADN lặp lại một cách có trật tự, gồm
những đơn vị lặp lại gồm từ 1 đến 6 nucleotit, theo kiểu lặp lại ngắn. SSR đã được
nghiên cứu lần đầu tiên trên người (Hamada và Kakunaga, 1982; Weber và cs.,
1989), và cho đến nay nó được tìm thấy trong các hệ gen của một số cơ thể
Eukaryot khác như các gia cầm, động vật có vú (Cheng và cs., 1994; Love và cs.,
1990; Moran, 1993; Serikawa và cs., 1992), cá và trên vài loài cây một lá mầm và
hai lá mầm (Morgante và cs., 1993; Wang và cs., 1994). Bản chất đa hình của SSR
có thể được sinh ra do sự nhân bội từ ADN tổng số của hệ gen nhờ sử dụng 2 đoạn
mồi bổ trợ với trình tự gần kề hai đầu của vùng lặp lại. Giá trị của SSR là ở chỗ nó
sinh ra đa hình từ rất nhiều vùng tương ứng, bao phủ rộng khắp hệ gen và có bản
chất đồng trội, dễ dàng phát hiện bằng PCR. Những chuỗi đa hình đơn giản này đã
được ứng dụng trong việc lập bản đồ ở cả hai đối tượng động vật và thực vật

•
•
•
•
•

protein, polycharide.
Bước 3: tủa axit nucleic.
Bước 4: hòa tan cặn DNA .
Yêu cầu:
DNA đảm bảo độ tinh khiết.
Đảm bảo nguyên vẹn về cấu trúc để thực hiện các bước nghiên cứu tiếp.
Tách chiết DNA mô thực vật bằng phương pháp cơ học
Bước 1: phá vỡ màng tế bào và màng nhân bằng cách cho dung dịch phá tế
bào và protenase K.

24


BÁO CÁO ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP

•

Nguyễn Hùng Cường

Lớp: Công nghệ sinh học K13

Bước 2: loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, như các
protein, polycharide. Mẫu được bổ sung hỗn hợp dung dịch(phenol:
chloroform: isoamylalcohol), lắc mạnh cho đến khi dung dịch có màu trắng


•

muối dư và nước được gạn bỏ.
Phương pháp tiến hành:
Thêm 1/10 lần thể tích dung dịch muối natri acetate(NaOAc) và 2 lần thể

•

tích cồn tuyệt đối vào dung dịch axit nucleic để tủa
Ủ 30 phút ở nhiệt độ -70 oC hoặc qua đêm ở nhiệt độ -20 oC.
25