VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài: NGHIÊN CỨU SÀNG LỌC VÀ THU NHẬN APTAMER ĐẶC HIỆU
KHÁNG SINH PENICILLIN

Giáo viên hướng dẫn:
PGS.TS. LÊ QUANG HUẤN
TS. LÃ THỊ HUYỀN
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NHƯ HOA
Lớp: 11- 04

Hà Nội – 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, con xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc nhất từ trái tim con đến bố
mẹ thân yêu đã nuôi lớn, dạy dỗ và luôn bên cạnh động viên con. Con hiểu rằng,
bao nhiêu khó khăn, vất vả, mồ hôi và nước mắt mà bố mẹ đã chịu đựng để cho con
cuộc sống tốt đẹp nhất. Con yêu và cảm ơn bố mẹ rất nhiều.
Và để hoàn thành khóa luận này, lời đầu tiên em muốn gửi lời cảm ơn sâu sắc
đến PGS.TS. Lê Quang Huấn, TS. Lã Thị Huyền đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ em
trong suốt quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Em xin bày tỏ lời cảm ơn đến quý Thầy, Cô giáo trong khoa Công nghệ sinh
học - Viện Đại Học Mở Hà Nội đã giảng dạy, chỉ bảo tận tình em trong suốt bốn
năm qua, những kiến thức mà em nhận được trên giảng đường đại học vừa là nền
tảng cho quá trình nghiên cứu khóa luận và vừa là hành trang qúy báu giúp em
vững bước trong tương lai.
Em muốn gửi lời cảm ơn đến các anh chị phòng Công nghệ Tế bào động vật –
Viện Công nghệ Sinh học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã

gia ........................................................................................................................... 8
1.1.7. Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm và một số phương pháp
xác định dư lượng kháng sinh ................................................................................... 9
1.1.7.1. Dư lượng kháng sinh trong các mẫu thực phẩm ..................................... 10
1.1.7.2. Quy định về tồn dư kháng sinh nhóm β-Lactam trong thực phẩm ........ 10
1.1.7.3. Một số phương pháp xác định dư lượng kháng sinh .............................. 11
1.2. Tổng quan về aptamer ......................................................................................... 13
1.2.1. Khái niệm ...................................................................................................... 13
ii


1.2.2. Đặc trưng của aptamer .................................................................................. 13
1.2.3. Ưu điểm của aptamer so với kháng thể ......................................................... 14
1.2.4. Phương pháp thu nhận aptamer – phương pháp SELEX .............................. 14
1.2.5. Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nước ..................................... 17
CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 18
2.1. Vật liệu ................................................................................................................. 18
2.1.1. Sinh phẩm ...................................................................................................... 18
2.1.2. Hóa chất ......................................................................................................... 18
2.1.3. Trang thiết bị ................................................................................................. 19
2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 20
2.2.1. Chuẩn bị thư viện .......................................................................................... 20
2.2.1.1. PCR làm giàu thư viện ............................................................................ 20
2.2.1.2. Cắt DNA sợi đôi thành sợi đơn ............................................................... 21
2.2.2. Phương pháp SELEX sàng lọc aptamer đặc hiệu penicillin ......................... 22
2.2.3. Phương pháp tách dòng và giải trình tự ........................................................ 24
2.2.3.1. Nhân bản aptamer liên kết với penicillin bằng kỹ thuật PCR ................ 24
2.2.3.2. Phân tích điện di trên gel agarose ........................................................... 26
2.2.3.3. Phương pháp tinh sạch sản phẩm phản ứng PCR ................................... 26
2.2.3.4. Phản ứng gắn gen vào vector tách dòng ................................................. 27


Axit ethyenediaminetetraacetic

E.coli

Vi khuẩn Escherichia coli

LB

Môi trường Luria Bertani

PCR

Phản ứng chuỗi trùng hợp

RNA

Axit Ribonucleic

ssDNA

Sợi đơn DNA

dsDNA

Sợi đôi DNA

TAE

Tris – acetate – EDTA


Tween + Phosphate buffer saline

X-gal

5-bromo-4-chloro-3-indodyl-β-galactosidase

EtBr

Ethidium bromide

v


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1: Cấu trúc chung của các penicillin .................................................................... 6
Hình 1.2: Các kháng sinh ức chế tổng hợp vách tế bào vi khuẩn .................................... 7
Hình 1.3:Một trong các dạng cấu trúc của aptamer ....................................................... 14
Hình 1.4: Quy trình phương pháp Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichment (SELEX). .................................................................................................... 15
Hình 1.5: Sơ đồ các phân tử DNA sợi đơn trong thư viện aptamer ............................... 16
Hình 2.1: Sơ đồ cấu tạo vector pCR2.1-TOPO (Invitrogen) ......................................... 27
Hình 2.2 : Hình ảnh minh họa kỹ thuật ELISA trực tiếp ............................................... 31
Hình 3.1: Kết quả phản ứng PCR làm giàu thư viện ..................................................... 33
Hình 3.2: Kết quả PCR với khuôn là ssDNA sau vòng sàng lọc thứ nhất ..................... 35
Hình 3.3: Kết quả PCR làm giàu sau vòng sàng lọc 3, 4 ............................................... 36
Hình 3.4: Kết quả PCR làm giàu sau vòng sàng lọc 6 ................................................... 37
Hình 3.5: Kết quả PCR làm giàu sau vòng sàng lọc 7 ................................................... 37
Hình 3.6: Kết quả PCR vòng sàng lọc loại trừ ............................................................... 38
Hình 3.7: Kết quả biến nạp vector pCR2.1 mang sản phẩm PCR vào tế bào ................ 39

lĩnh vực chăn nuôi gia súc, gia cầmhiện nay việc hướng dẫn và quản lý sử dụng thuốc
kháng sinh còn lỏng lẻo do đó tình trạng sử dụng các chất kháng sinh trong thức ăn
chăn nuôi khá tùy tiện. Từ đó đã để lại tồn dư các kháng sinh trong sản phẩm thực
phẩm ( thịt, cá, trứng, sữa,…) gây nguy hại nghiêm trọng đến sức khỏe người tiêu dùng
và uy tín hàng xuất khẩu của nước ta.
Kháng sinh penicillin là “thần dược” thế hệ đầu tiên có tính kháng khuẩn rất
mạnh đối với nhiều loại vi khuẩn. Penicillin đóng một vai trò hết sức quan trọng trong
việc chống lại nhiều bệnh tật cho con người và các loài động vật. Bên cạnh đó, nó được
xem là “vũ khí mạnh mẽ” đối với các nhà chăn nuôi trong việc kích thích tăng trưởng
động vật, nâng cao năng suất. Vì mục đích lợi nhuận mà sức khỏe của người tiêu dùng
bị nguy hại do không may sử dụng những sản phẩm thực phẩm có tồn dư kháng sinh.
Theo các báo cáo về y tế, penicillin là kháng sinh thường gây dị ứng nhất. Đã có
trường hợp người bị nổi mần da trầm trọng vì uống sữa có dư lượng penicillin (
có xuất hiện hiện tượng vòng vi khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm(cụ thể là nấm
xuất hiện trên đĩa và phát triển thành các tảng nấm; xung quanh tảng nấm, những mảng
vi khuẩn đã bị phá hủy). Ông kết luận rằng, nấm này đã tạo 1 chất giết chết các vi
khuẩn. Chất này giống enzyme là lysozym mà ông đã phát hiện ra vài năm trước. Chất
này có thể giết vi khuẩn gây bệnh tên Staphylcooccus[24].
Ông đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất có khả năng
tiêu diệt vi khuẩn này (1929) [24].
Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt
(1931). Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nỗ lực nhằm tách và tinh chế
3


penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của
chế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên [24].
Năm 1938 ở Oxford, khi tìm lại các tài liệu khoa học đã được công bố, Ernst
Boris Chain quan tâm đến phát minh của Fleming và ông đã đề nghị Howara Walter
Florey cho tiếp tục triển khai nghiên cứu này. Ngày 25/05/1940, penicillin đã được thử
nghiệm rất thành công trên chuột [17].
Tuy nhiên, trước khi thử nghiệm trên người, các nhà khoa học phải tạo được
penicillin nguyên chất. Đây là vấn đề then chốt. Công việc này giao cho Edward
Abraham đảm nhiệm.Edward Abraham nghiên cứu tìm ra được kỹ thuật tách sau này
gọi là sắc ký hấp phụ (adsorption chromatography). Dung dịch nuôi cấy nấm có chứa
penicillin được đưa qua các ống chứa đầy các chất hấp phụ; chúng sẽ tách penicillin
khỏi các tạp chất.
Phòng thí nghiệm của Florey nhanh chóng chuyển thành một nhà máy nhỏ, các
ống nghiệm chứa đầy penicillin được theo dõi tỉ mỉ. Tuy nhiên, sản lượng của nhà máy
vẫn còn thấp, 500 lít chất lỏng nuôi cấy chỉ sản xuất ra lượng penicillin đủ chữa cho 4
hoặc 5 người.
Sau đó, công trình được chuyển sang Mỹ, lúc này, mục đích của các nhà khoa học
là chế tạo penicillin trên quy mô công nghiệp. Nhiều kỹ thuật như dùng tia cực tím, tia

Penicillin nhóm III:
• Gồm các penicillin bán tổng hợp phổ rộng, không kháng được
penicilinase nhưng tác dụng với cả vi khuẩn gram (-) mà các penicillin
nhóm II ít tác dụng, bền vững trong môi trường acid dịch vị nên có thể
uống được như Ampicillin, Amoxycilin.
1.1.4. Cấu trúc hóa học và một số tính chất của các penicillin
Theo cấu trúc hóa học, các chất kháng sinh penicillin được phân loại vào nhóm βlactam.
5


Cấu tạo: Khung cơ bản của các penicillin là 6-APA (6-aminopenixilanic axit), có
nhân thiazolidine và vòng β-lactam [18]. Các penicillin có công thức chung:
R-C9H11N2O4S.

Hình 1.1: Cấu trúc chung của các penicillin
Trong số các penicillin kể trên, penicillin G là kháng sinh tiêu biểu nhất trong
nhóm β-lactam.
Tính chất:
• Vòng β-lactam là yếu tố quyết định hoạt tính của các kháng sinh penicillin.
• Do có nhóm carboxyl (-COOH) nên các kháng sinhnhóm β-lactam này có
tính acid. Khi thay thế -H của nhóm carboxyl bằng kim loại kiềm thì được
các penicillin dễ tan trong nước và tạo muối ít tan với các amin.
• Penicillin là bột màu trắng, không mùi, vị đắng, tan nhiều trong nước, rất
hút nước. Các penicillin đều có vòng beta-lactamin không bền vững dễ bị
phân hủy khi gặp ẩm và môi trường kiềm, acid (pH tối ưu từ 6-6,5); các
tác nhân oxy hóa, khử (KMnO4). Sự hư hỏng cũng gia tăng theo nhiệt

6



thay đổi bất thường về cơ cấu và chủng loại nguyên liệu trong khẩu phần ăn.
-Nâng cao chất lượng sản phẩm (giảm tỷ lệ thịt mỡ, tăng tỷ lệ thịt nạc, làm cho
thịt trở nên mềm hơn và không nhiễm mầm bệnh).
-Phòng các bệnh mạn tính và ngăn chặn xảy ra những dịch bệnh do vi trùng.
-Tăng hiệu quả kinh tế trong chăn nuôi.
1.1.6.2. Tình hình sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi ở một số quốc gia
• Trên thế giới:
Ở Mỹ hàng năm khoảng 6 triệu pao (xấp xỉ 2730 tấn) kháng sinh được dùng trong
chăn nuôi. Xấp xỉ 80% gia cầm, 70% lợn, 70% bò sữa và 60% bò thịt ở Mỹ được nuôi
8


dưỡng bằng thức ăn có bổ sung kháng sinh và cứ mỗi một USD chi phí cho kháng sinh
dùng trong thức ăn, người chăn nuôi thu được lợi tức 2- 4 USD.
Theo số liệu của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong
chăn nuôi ở Mỹ năm 1999 là khoảng 20,42 triệu pao (9270 tấn), trong đó kháng sinh
nhóm Ionophore và arsen chiếm nhiều nhất (47,5%), tetracycline (15,67%), penicillin
(4,26%) và các loại khác (32,57%). Trong số 20,42 triệu pao, có khoảng 2,8 triệu pao
(13,7%) được dùng như chất kích thích sinh trưởng.
Theo số liệu của Ghislain Follet, trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng
trong nhân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10.500 tấn (quy theo mức 100% tinh
khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52% sử dụng trong nhân y, 33% trong
điều trị thú y và 15% như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi [26].
• Tại Việt Nam:
Theo điều tra của PGS.TS Lã Văn Kính (2007) về thực trạng sản xuất thức ăn
chăn nuôi ở hai khu vực Hà Nội và TP. Hồ Chí Minh với tổng số 20 nhà máy. Kết quả
điều tra cho thấy 100% các nhà máy vẫn thường xuyên sử dụng kháng sinh làm chất
kích thích sinh trưởng và phòng bệnh bổ sung vào thức ăn cho lợn, đặc biệt là lợn con
và lợn choai. Tỷ lệ sử dụng kháng sinh trong thức ăn cao: 100% có oxytetracycline,
67% có cloramphenicol, 30% có olaqundox, 7% có dexamethasol [19].

Trâu, bò

Lợn

Thịt Gan Thận Sữa(µg/l) Thịt
MRL(µg/kg)

50

50

50

4

50

Gà

Gan Thận Thịt
50

50

50*

Gan Thận
50*

50*

và được cố định trên các bản kính hoặc bản kim loại. Pha động là một hệ dung môi đơn
hoặc đa thành phần được trộn với nhau theo tỷ lệ quy định trong từng mục đích cụ thể.
Trong quá trình di chuyển qua lớp hấp phụ, các cấu tử trong hỗn hợp mẫu thử được di
11


chuyển trên lớp mỏng, theo hướng pha động, với những tốc độ khác nhau. Kết quả, ta
thu được một sắc ký đồ trên lớp mỏng. Các mẫu được áp dụng chủ yếu là dược phẩm
và một số loại thực phẩm như sữa, mật ong, thịt, cá…Phương pháp này chủ yếu có vai
trò định tính, thử tinh khiết và đôi khi để bán định lượng hoạt chất của thuốc, khó xác
định được chính xác hàm lượng kháng sinh tồn dư trong mẫu.
• Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (High-Performance Liquid
Chromatography, HPLC):
Là một phương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa
trong cột là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên
một chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến đổi bằng liên kết hóa học với các
nhóm chức hữu cơ. Qúa trình sắc ký lỏng dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố, trao đổi
ion hay sàng lọc theo kích cỡ. Phạm vi ứng dụng của HPLC rất rộng, như phân tích các
hợp chất protein, axit nucleic, sắc tố thực vật, chất màu, dược phẩm, chất kháng sinh,
chất an thần, ….
So với sắc ký lỏng cổ điển, ưu điểm của hệ thống HPLC là thời gian chạy nhanh, độ
tách tốt, độ nhạy caonhưng nhược điểm là đắt tiền nên khó áp dụng trên quy mô lớn.
• Phương pháp dựa trên phản ứng giữa kháng nguyên - kháng thể (EnzymeLinked ImmunoSorbent Assay):
Là một kỹ thuật sinh hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét
nghiệm. Hiện nay, ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như
y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các
sản phẩm sinh học.
Phương pháp này có lợi thế hơn các phương pháp sắc ký do thời gian thực hiện
nhanh hơn và rẻ hơn. Tuy nhiên, chúng chỉ có thể xác định sự có mặt hay không có mặt
cũng như lượng kháng sinh có trong mẫu nghiên cứu mà không thể phân tích từng loại

Hình 1.3: Một trong các dạng cấu trúc của aptamer
1.2.3. Ưu điểm của aptamer so với kháng thể
Độ tinh khiết của aptamer cao hơn được tổng hợp và tinh sạch trong khi đó sản
xuất kháng thể phải sử dụng các hệ thống sinh học, các cơ thể sống và quá trình
tinh sạch khó khăn hơn.
Giá thành sản xuất aptamer thấp hơn, thời gian sàng lọc ngắn hơn so với việc
sản xuất các kháng thể.
Phổ đích của aptamer rất rộng so với kháng thể từ những phân tử nhỏ như ion
kim loại Na+, Zn2+… đến những đại phân tử, thậm chí tế bào [5] [6].
Aptamer nhân tạo ổn định hơn trong hầu hết các điều kiện môi trường so với
kháng thể.
Aptamer có hạn sử dụng dài hơn và có thể biến tính thuận nghịch mà không mất
đặc tính so với kháng thể.
Aptamer có khả năng cải biến hóa học linh hoạt để ứng dụng vào nhiều chức
năng, mục đích sử dụng khác nhau.
1.2.4. Phương pháp thu nhận aptamer – phương pháp SELEX
Khái niệm:

14


Phương pháp SELEX (Systematic Evolution of Ligands by Exponential
Enrichement) là phương pháp sử dụng một nhóm các kỹ thuật sinh học phân tử để tổng
hợp in vitro oligonucleotide có khả năng liên kết với phân tử đích [7]. Trong quá trình
sàng lọc aptamer theo một quy trình SELEX gồm nhiều vòng sàng lọc với 3 quá trình:
chọn lọc những trình tự oligonucleotide (aptamer) gắn với phân tử đích từ thưviện
oligonucletide ngẫu nhiên, thu nhận và khuếch đại những aptamer có khả năng liên kết
đặc hiệu với phân tử đích [3] [7].

Hình 1.4: Quy trình phương pháp Systematic Evolution of Ligands by Exponential

đến khi sàng lọc được aptamer có ái lực cao nhất với phân tử đích. Phân tửaptamer
được lựa chọn sẽ được chuyển sang quá trình tách dòng và giải trình tự [3] [7] [8].

16


1.2.5. Tình hình nghiên cứu aptamer trong và ngoài nước
Với những ưu việt vượt trột của mình, aptamer đã và đang trở thành nhóm chất có
nhiều tiềm năng, hy vọng trong nhiều lĩnh vực: vận chuyển các phân tử, chẩn đoán các
mối nguy, tạo cảm biến sinh học, điều trị ung thư, y dược, thuốc phân tử, điều trị lâm
sàng, thực phẩm, ….
Trong lĩnh vực chế tạo cảm biến sinh học: aptamer được sử dụng để phát
hiện kháng sinh tồn dư trong thực phẩm như streptomycin, tetracyclin,
penicillin, neomycin. Aptamer cũng được sử dụng để phát hiện độc tố nấm
ở nồng độ nano gram: mycotoxin[11], ochratoxin A (OTA), fumonsin B1
(FB1), nephrotoxin[11] [12].
Ở Việt Nam hiện nay, aptamer là lĩnh vực nghiên cứu mới và đã có một số
nghiên cứu, ứng dụng: Nghiên cứu tổng hợp các aptamer ức chế protease
HIV của Đại học Khoa học Tự nhiên. Trường Đại học Nông nghiệp Hà
Nội cũng đang tiến hành các nghiên cứu ứng dụng aptamer và vật liệu
nano trong: phát hiện tồn dư của thuốc bảo vệ thực vật, chất bảo quản, các
ion kim loại nặng…trong sản phẩm nông nghiệp và môi trường. Phòng
công nghệ tế bào động vật_Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa
học và Công nghệ Việt Nam đang tiến hành đề tài nghiên cứu sản xuất chế
tạo và sử dụng bộ KIT phát hiện kháng sinh trong sữa bằng kỹ thuật nano
(sử dụng aptamer).Phòng đã có bài báo về aptamer được đăng trên Tạp chí
Y học Việt Nam: “Sử dụng quy trình Selex sàng lọc aptamer nhận biết đặc
hiệu vi khuẩn Escherichia Coli O157:H7”.

17