Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-----------

Formatted: Left: 1.38", Right: 0.79", Top:
0.98", Bottom: 0.98"
Formatted: Justified, Space Before: 0.9 pt,
After: 0.9 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Font: 5 pt

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:

Nghiên cứu vai trò của thuốc bắc trong sự hình thành
hệ vi sinh vật của bánh men truyền thống Việt Nam
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Người hướng dẫn

: PGS.TS. VŨ NGUYÊN THÀNH

Sinh viên

: NGUYỄN THỊ THU


i


LỜI CẢM ƠN

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu, em đã luôn nhận được rất nhiều
sự giúp đỡ, chỉ bảo, động viên của thầy cô, gia đình và bạn bè.
Lời đầu tiên em xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Vũ Nguyên Thành,
người đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo, tạo mọi điều kiện giúp em thực hiện khóa
luận này.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới tập thể cán bộ Trung tâm Vi sinh vật
Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm đã luôn nhiệt tình giúp đỡ, tạo mọi điều
kiện để em hoàn thành tốt công việc.
Qua đây, em xin gửi lời cảm ơn đến các thầy cô khoa công nghệ sinh học, Viện
Đại Học Mở Hà Nội đã tận tình dạy dỗ chúng em trong suốt 4 năm học qua.
Cuối cùng, em xin dành lời cảm ơn chân thành đến gia đình, người thân, bạn
bè những người luôn động viên, khích lệ em trên con đường học tập, làm quen với
công tác nghiên cứu khoa học.
Hà Nội, Ngày 20 tháng 5 năm 2015.
Sinh viên

Nguyễn Thị Thu
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

ii

PCR

Polymerase Chain Reaction

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

rDNA

Ribosomal Deoxyribonucleic Acid

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

iii

2

Bảng 1.2

Thuốc bắc, thảo dược sử dụng cho men khởi động của các
quốc gia Châu Á

3

Bảng 3.1

Thành phần bánh men

2019

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

4

Bảng 3.2

Tổng số các nhóm vi sinh vật trong bánh men

223

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

5

Kết quả phân tích một số chỉ tiêu dịch lên men

40

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

Hình 2.11

Quy trình làm bánh men

168

3

Hình 2.21

Quy trình lên men

179

4

Hình 3.1

Hình ảnh bánh men

212

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li

5

Hình 3.2

Hình ảnh phân lập bánh men trên môi trường Malt 2Bx có


7

Hình 3.4

Hình thái khuẩn lạc và tế bào nấm mốc nuôi cấy trên môi
trường MT3

278

8

Hình 3.5

Phổ fingerprinting của 7 chủng nấm mốc

278

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

9

Hình 3.6

Hình thái khuẩn lạc, tế bào nấm men nuôi cấy trên môi
trường MT3

2930


12

Hình 3.9

Phổ fingerprinting của 9 chủng giả men.

323

13

Hình 3.10

Hình thái khuẩn lạc và vi khuẩn trên môi trường MT4

345

14

Hình 3.11

Phổ fingerprinting của 9 chủng vi khuẩn

345

15

Hình 3.12

Hình ảnh khuẩn lạc nấm mốc trên môi trường có thuốc bắc
và không có thuốc bắc

Formatted

... [2]

Formatted

... [3]

Formatted

... [4]


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .....................................................................................................i
LỜI CẢM ƠN .........................................................................................................ii
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN .......................................... iii
DANH MỤC BẢNG .............................................................................................. iv
DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ v
MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 2
1.1. Bánh men rượu và quá trình sản xuất rượu truyền thống Việt Nam ............... 2
1.1.1. Bánh men rượu ở Việt Nam .................................................................... 2
1.1.2. Vai trò của bánh men trong quá trình lên men rượu ............................. 222
1.1.3. Quy trình sản xuất bánh men thuốc bắc ................................................... 4
1.2. Hệ vi sinh vật trong bánh men ....................................................................... 5
1.2.1. Nấm mốc............................................................................................. 666
1.2.2. Nấm men............................................................................................. 666
1.2.3. Vi khuẩn ............................................................................................. 777
1.3. Thuốc bắc trong sản xuất bánh men rượu ...................................................... 8

3.2.1. Ảnh hưởng của thuốc bắc tới nấm mốc ......................................... 353536
3.2.2. Ảnh hưởng của thuốc bắc tới nấm men ......................................... 373738
3.2.3. Ảnh hưởng của thuốc bắc tới giả nấm men .................................... 383839
3.2.4. Ảnh hưởng của thuốc bắc tới vi khuẩn .......................................... 393939
3.3. Kết quả lên men từ bánh men .............................................................. 393940
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................................... 424243
Kết luận: .................................................................................................... 424243
Kiến nghị: .................................................................................................. 424243
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................. 434344

vii


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

MỞ ĐẦU
Từ rất lâu đồ uống có cồn đã gắn liền với đời sống của con người. Có rất nhiều
loại đồ uống có cồn được sản xuất và tiêu thụ trên toàn thế giới như rượu, rượu
vang, bia và một số đồ uống có nồng độ cồn thấp khác. Trong đó mỗi sản phẩm đều
mang đậm tính đặc trưng đóng vai trò to lớn trong đời sống văn hóa và tinh thần của
con người.
Ở Việt Nam thưởng thức rượu là một nét văn hóa mang đậm bản sắc riêng của
từng vùng, từng dân tộc. Rượu được sản xuất ở hầu hết các nơi ở nước ta với nhiều

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

1


Formatted: Font: 4 pt

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Bánh men rượu và quá trình sản xuất rượu truyền thống Việt Nam
1.1.1. Bánh men rượu ở Việt Nam
Một số quốc gia Châu Á và Việt Nam có nhiều thế kỷ sản xuất rượu truyền
thống từ ngũ cốc. Quá trình lên men được thực hiện bởi các giống khởi động với
nhiều tên gọi khác nhau như Bukhar, Murcha (Ấn Độ), Ragi (Indonesia), Budbod
(Philippines), Look-pang (Thái Lan). Các giống khởi động được chuẩn bị theo
nhiều cách khác nhau nhưng bản chất đó chính là quá trình nuôi cấy và bảo quản vi

2

Formatted: Font: 6 pt, English (United States)
Formatted: Normal, Space Before: 0.9 pt,
After: 0.9 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Indent: First line: 0", Space
Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Indent: First line: 0", Right: 0",
Space Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Normal, None, Space Before: 0.9
pt, After: 0.9 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black


thời gian lên men dài.
Quá trình chưng cất: Hiện nay việc chưng cất rượu truyền thống đang tồn tại
hai công nghệ chưng cất đó là: Cất “ruột gà” và cất “thượng thủy”. Rượu chưng cất
bằng công nghệ thượng thủy thường có chất lượng tốt hơn rượu chưng cất ruột gà.
Sau quá trình chưng cất nồng độ cồn có thể đạt tới 50% v/v (khoảng 40%
w/v). Năng suất, hương vị và các thành phần chứa trong sản phẩm lên men tự nhiên
này dường như khó có thể dự đoán trước. Điều này, tạo ra nét đặc trưng riêng mang
đậm tính thủ công truyền thống cho từng loại rượu khác nhau [24].
1.1.2.2. Vai trò của bánh men trong lên men rượu
Bánh men thực chất là một hỗn hợp các giống khởi động (Starter culture),
dùng cho quá trình sản xuất rượu. Vai trò của bánh men trong quá trình lên men
chính là nhờ hệ vi sinh vật trong bánh men. Trong đó nhóm nấm mốc và vi sinh vật
sinh ra enzyme amylase chuyển hóa tinh bột thành đường, nấm men biến đổi các
đường này thành rượu [20, 21, 23].

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

3

khi thấy bánh men phồng nở đều và xung quanh bánh men mọc lông tơ, xốp, nhẹ thì
để ra chỗ thoáng, mát. Tiếp theo men được sấy tới độ ẩm khoảng 10-12%. Men
thành phẩm được sâu thành chuỗi và bảo quản trên gác bếp. Qua quá trình sấy, vi
sinh vật trong bánh men chuyển từ trạng thái hoạt động sang trạng thái nghỉ. Chúng
sẽ nhanh chóng hoạt động trở lại trong điều kiện môi trường, nhiệt độ và độ ẩm
thích hợp, hệ nấm mốc và nấm men sẽ sinh tổng hợp enzyme đường hóa và rượu
hóa [4, 9].

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

4


Formatted: Font: 4 pt

Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Left, Space Before: 0.9 pt, After:
0.9 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Tên gọi

Tên nước

Hệ vi sinh vật

Bakhar

Ân Độ

Mucor spp., Rhizopus spp., Amylomyces spp.

Bubud

Philippines

Mucor spp., Rhizopus spp., Amylomyces spp., Candida
spp., Saccharomyces spp., Saccharomycopsis spp.,
Torulopsis spp.

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt


Mucor spp., Rhizopus spp., Saccharomyces cerevisiae,
Saccharomycopsis fibuligera

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)

Nurook

Hàn Quốc

Aspergillus oryzae, A. niger, Rhizopus spp., Penicillium

Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Font color: Black

Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

pt

Hệ vi sinh vật trong bánh men là sự kết hợp đa dạng của nấm và vi khuẩn.
Thành phần nấm trong bánh men rất ít thay đổi. Nó bao gồm các loài sinh amylase
(Rhizopus oryzae, R. microsporus, Mucor spp., Saccharomycopsis fibuligera), các
loài sản sinh ethanol (Saccharomyces cerevisiae, Issatchenkia orientalis., Pichia
anomala, Candida tropicalis, P. ranongensis, Clavispora lusitaniae) và các sinh vật
(cơ hội) tạp nhiễm (Xeromyces bisporus, Botryobasidium subcoronatum). Trong
bánh men các vi khuẩn thay đổi rất lớn về thành phần loài và bị chi phối bởi các vi
khuẩn lactic (LAB). Các LAB thường gặp nhất là Pediococcus pentosaceus,
Lactobacillus plantarum, L. Brevis, Weissella confusa, và W. paramesenteroides.
Loài vi khuẩn Bacillus sản sinh amylase (Bacillus subtilis, B. circulans, B.
amyloliquefaciens, B. sporothermodurans), vi khuẩn sinh acetic acid (Acetobacter
orientalis, A. pasteurianus), và các vi khuẩn tạp nhiễm (Burkholderia ubonensis,
Ralstonia solanacearum, Pelomonas puraquae) [30] Theo A.C. Lee và Y. Fujio
[19] thì hệ vi sinh vật trong bánh men Việt Nam ngoài những loài trên còn có:
Mucor indicus, Mucor circinilloides và Hyphopichia burtonii, v.v.
1.2.1. Nấm mốc
Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loại nấm mốc phát triển thuộc nhóm
Rhizopus oryzae, R. microsporus, Mucor spp. Số loại nấm mốc phụ thuộc vào các
yếu tố như: nhiệt độ, nơi sản xuất bánh men….Nhưng trong đó Rhizopus và Mucor
thấy phát triển nhiều hơn cả [7].
1.2.1.1. Rhizopus
Rhizopus spp. có màu trắng xám, rễ giả màu vàng, bọc bào tử hình cầu, bào
tử kín, phân nhánh. Chúng phân bố rộng rãi trong đất, ngũ cốc, rau quả...và có khả
năng sinh enzyme amylase, protease...
1.2.1.2. Mucor
Mucor là loại nấm màu trắng, bọc bào tử hình cầu màu trắng hoặc nhạt màu,
có hệ sợi hình ống, dạng nhung hoặc len, không có thân bò (Stolon) cuống bọc bào
tử dựng đứng, luôn luôn tận cùng bằng bọc bào tử, đơn độc hoặc phân nhánh.

phức hệ các enzyme. Đây là một trong những đặc trưng quan trọng của nấm men đã
được nhân dân ta ứng dụng từ lâu đời để sản xuất rượu bằng bánh men thuốc bắc.
Trong mỗi gam bánh men có từ vài chục triệu đến vài trăm triệu tế bào nấm men.
Gồm 2 chi khác nhau: Saccharomyces (chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae) và
Saccharomycopsis (chủ yếu là Saccharomycopsis fibuligera) [2].
1.2.2.1. Saccharomyces cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae có tế bào hình tròn hoặc ovan, kích thước khoảng 3
– 10 × 5 - 12 µl. Là loài nấm men lên men nổi, kị khí không bắt buộc. Sinh sản vô
tính theo kiểu nẩy chồi, phân đôi bào tử. Trong điều kiện đầy đủ oxy, nấm men sinh
trưởng làm tăng sinh khối. Trong điều kiện kị khí, chúng tiến hành lên men rượu
thu năng lượng, chuyển đường thành rượu. Vì vậy trong giai đoạn đầu của quá trình
lên men người ta thường bổ sung oxy vào môi trường lên men để thúc đẩy sự sinh
trưởng của nấm men, tạo sinh khối. Sacchromyces cerevisiae có khả năng lên men
nhiều loại đường khác nhau như glucose, saccharose, fructose, maltose... Nhiệt độ
tối ưu cho chúng phát triển là 25 - 30˚C, nhiệt độ tối thiểu 2 - 3˚C. Ở 40˚C thì
ngừng sinh trưởng và chết.
1.2.2.2. Saccharomycopsis fibuligera
Saccharomycopsis là loại giả nấm men có khả năng sinh tổng hợp enzyme
amylase và glucoamylase. Có tính chất tương tự như S. cerevisiae, sinh sản dinh
dưỡng bằng nẩy chồi. Tế bào có hình bầu dục nối tiếp nhau thành những dạng sợi
gọi là khuẩn ty.
Theo những nghiên cứu gần đây, nấm men trong bánh men rượu gạo của Việt
Nam có thể phát triển trên môi trường có hàm lượng glucose tương đối cao, đặc biệt
các chủng nấm men trong bánh men thuốc bắc có khả năng chịu được thuốc sát
trùng Na2SiF6 với nồng độ 0,02 – 0,025%. Đặc điểm này rất thuận lợi cho lên men
khi cần sử dụng thuốc sát trùng. Quan trọng hơn hết là loài nấm men này có khả
năng lên men các loại nguyên liệu khác nhau như gạo, ngô, khoai, sắn. Nồng độ
rượu trong dịch lên men là 10 -12%. Nhiệt độ lên men thích hợp là từ 28 - 32ºC.
1.2.3. Vi khuẩn
Trong bánh men thuốc bắc có nhiều loại vi khuẩn phát triển. Nhưng chủ yếu là


Khoa Công nghệ sinh học

khả năng thủy phân tinh bột mạnh. Trong một số nghiên cứu, người ta bổ sung vào
chế phẩm bánh men nhiều chủng giống vi khuẩn có khả năng chuyển hóa tinh bột
thành đường: B. subtillis, B. diastaticus…
1.3. Thuốc bắc trong sản xuất bánh men rượu
1.3.1. Các vị thuốc bắc thường sử dụng trong sản xuất bánh men
Việc sử dụng thuốc bắc cũng như các loại thảo dược khá phổ biến trong quá
trình sản xuất giống khởi động ở các nước châu Á (Bảng 1.2) [1, 13, 14, 16, 17, 18,
25, 26, 31, 32].

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

Bảng 1.2: Thuốc bắc, thảo dược sử dụng cho men khởi động của các quốc gia Châu Á.
Tên nước

Cây hoặc vị thuốc

Trung Quốc
Việt Nam
Lào

Phụ tử, Đỗ quyên, Hoàng cầm,…

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Ở Việt Nam, với kinh nghiệm gia truyền, ở mỗi địa phương khác nhau, thậm
chí ở từng gia đình nhất định, số vị thuốc bắc trong một bài thuốc được dùng là rất
khác nhau. Công thức nhiều vị nhất có tới 38 vị, công thức ít chỉ có 4 vị [9]. Trong
quá trình làm bánh men các vị thuốc bắc được nghiền nhỏ trộn với bột gạo và men
cái. Tỷ lệ thuốc bắc với bột gạo khá khác nhau giữa các bài thuốc. Tỷ lệ thuốc bắc
thường sử dụng là 5 – 10% so với bột gạo, có bài thuốc tỷ lệ thuốc bắc vào khoảng 2 %.
Một số bài thuốc bắc được sử dụng phổ biến trong sản xuất bánh men thuốc
bắc như sau [6, 9]
•
Công thức bài thuốc 10 vị:

•

Formatted: Font: 6 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Condensed by 0.3 pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9


1,5 g

Formatted: Font color: Black

Cam thảo

3,5 g

Tiểu hồi

1,5 g

Thảo quả

3,5 g

Sa nhân

5,5 g

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar

Công thức bài thuốc 8 vị:

Formatted: Font color: Black

Quế chi

3,5 g

Tế tân

1,0 g

Bạch truật

1,0 g

Liên kiều

1,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Cam thảo

3,5 g

Tiểu hồi

1,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Công thức bài thuốc 4 vị:
Nhục đậu khấu

4,5 g

Thảo quả

3,5 g

Quế chi

3,5 g

Bạch truật

1,0 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Công thức bài thuốc 5 vị
Đại hồi


Theo nghiên cứu của Nguyễn Văn Hiệu (1993) cho thấy trong bánh men thuốc
bắc nhờ có các vị thuốc với thành phần hợp lý mà chúng có hai vai trò chính là kích
thích sự phát triển của nấm men và ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây hại
[9]. Theo nghiên cứu Ngô Thị Phương Dung (2004) “Tiểu Hồi” và “Đinh Hương”
là có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của nấm mốc và nấm men [24]. Mặt khác
các vị thuốc bắc đều có mùi thơm. Các hợp chất thơm này có thể phản ứng với nhau
và với những hợp chất khác, tạo ra những hợp chất mới. Kết quả tạo ra mùi vị đặc
trưng cho rượu cổ truyền.

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Indent: First line: 0", Space
Before: 0.9 pt, After: 0.9 pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

3,5 g

Tiểu hồi

1,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Thảo quả

3,5 g

Sa nhân

5,5 g

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

+ Bài thuốc 5 vị (CT4):
Đại hồi

6g

Thảo quả


Điển, Việt Nam, Trung Quốc.

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Tab stops: 0", Right,Leader: … + Not at 1"
+ 2" + 2.18"
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

10



Chuẩn bị: Cân các thành phần với tỷ lệ như trên. Cho hỗn hợp vào bình
Schott sau đó đem khử trùng ở 121°C trong 15 phút để môi trường nguội xuống 5060°C, bổ sung dịch Amphotericin B 5 mg/1ml với tỷ lệ 1 ml Amphotericin B /1000
ml môi trường, lắc đều và đổ ra đĩa Petri trong điều kiện vô trùng. Bảo quản ở tủ
mát sau khi môi trường khô.
2.4.1.2. Môi trường làm sạch và giữ giống
- Môi trường Matl 2°Bx không có Chloramphenicol (MT3)
Thành phần: Malt 2%, Agar 1,5%, nước.
Chuẩn bị:
- Cân các thành phần, cho hỗn hợp vào bình Schoot rồi hấp khử trùng ở
121°C trong 15 phút sau đó để nguội môi trường xuống 70-80°C đổ ra đĩa Petri
trong điều kiện vô trùng.

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling

trường MT1, MT2 để xác định số lượng vi vi sinh vật có trong bánh men.
- Tiến hành: Bánh men được nghiền nhỏ mịn sau đó lấy 3 g bánh men cho vào
27 ml dung dịch pha loãng NaCl 0,89%, vortex đều rồi pha loãng về các nồng độ
10-2, 10-3, 10-4, 10-5,10-6… Hút 0,1 ml dịch pha loãng rồi phân lập trên môi trường
MT1 đối với nấm men, giả men và nấm mốc, ủ ở 30°C, trên môi trường MT2 đối
với vi khuẩn, ủ vi hiếu khí ở 37°C.
- Đếm số lượng khuẩn lạc vi sinh vật phát triển trong đĩa petri theo thời gian
(ngày thứ nhất có thể đếm được nấm mốc và giả men; ngày thứ 2 đếm nấm men và
vi khuẩn; ngày thứ 3 có thể phân biệt rõ các khuẩn lạc khác nhau và đếm lại) từ đó
tính ra số lượng tế bào trong 1 g mẫu bánh men theo công thức:

Trong đó:
- N: là tổng số CFU trong 1 g (ml) mẫu
- ∑C: là tổng khuẩn lạc đếm được trên 2 đĩa giữ lại từ 2 độ pha loãng liên
tiếp và trong đó ít nhất một đĩa có chứa tối thiểu 10 khuẩn lạc
- V: thể tích dịch nuôi cấy trên mỗi đĩa, tính bằng ml
- n1: số đĩa giữ lại ở nồng độ thứ nhất
- n2: số đĩa giữ lịa ở nồng độ thứ hai
Nguyễn Thị Thu

12

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt, Line spacing: Multiple 1.2 li
Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9

Quy trình nhuộm:
- Làm tiêu bản vết bôi. Nhỏ một giọt nước lên trên lam kính, dùng đầu que cấy
lấy một ít sinh khối vi khuẩn, làm tan đều vào giọt nước.
- Để khô tiêu bản tự nhiên hoặc hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn
- Nhỏ 1 giọt dung dịch tím violet lên vết bôi. Để trong 1 phút.
- Rửa nhẹ lam kính cho đến khi sạch tím violet.
- Nhỏ 1 giọt dung dịch Iodine lên và để trong 1 phút.
- Rửa lam kính cho sạch bằng nước, làm khô.
- Nhỏ dung dịch tẩy lên vết bôi trong khoảng 15 – 30 giây.
- Nhỏ dung dịch Fuchsin lên tiêu bản để 30 giây – 1 phút.
- Rửa sạch lam kính và lau khô.
- Soi kính ở độ phóng đại 100, có dầu.
Kết quả:
- Vi khuẩn Gram dương: Nhuộm mầu tím, xanh tím
- Vi khuẩn Gram âm: Nhuộm mầu đỏ hoặc hồng
2.2.2. Phương pháp phân tích
2.2.2.1. Phương pháp xác định nồng độ cồn
Dịch sau lên men được ly tâm và đem cất cồn. Sử dụng bộ cất cồn phòng thí
nghiệm Salleron Dujardin của Pháp. Thiết bị này cho phép ta biết được độ cồn thu
được trong dịch sau quá trình lên men qua nhiệt độ sôi của dịch.
Quá trình cất cồn được thực hiện như sau:
- Làm sạch bình bằng nước cất.
Nguyễn Thị Thu

13

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black

- Cho vào các eppendorf 0,3 ml đương chuẩn, sử dụng nước cất làm mẫu
blank.
- Bổ sung vào các eppendorf 0,6 ml DNS, mix đều. Phản ứng màu ở 100°C
trong 5 phút, làm lạnh nhanh bằng nước đá.
- Lấy 0,4 ml dịch phản ứng + 1,8 ml nước cất, mix đều.
- Đo OD 540 nm
Xây dựng đường chuẩn glucose:
- Chuẩn bị dung dịch glucoza: đường D-glucose (EU-G7) được sấy 105°C
trong 2 h. Cân 0,5 g glucose hoà với 40 ml nước cất trong cốc thuỷ tinh, sau đó định
mức đến 50 ml thu được dung dịch stock 10 mg/ml (bảo quản -20°C).
- Chuẩn bị dãy pha loãng: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0; 1,2
Nồng độ glucose (mg/ml)
OD 540nm

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

0,138

0,345



Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

14


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

- Tách chiết DNA: Tế bào được nuôi trong MT3 đối với nấm mốc, nấm men
và giả nấm men, nuôi trong môi trường MT4 đối với vi khuẩn. Lấy tất cả sinh khối
tế bào cho vào Eppendorf vô trùng và thêm 750 µl SSC 2× vào mỗi ống. Lắc đều và
đun ở 100°C trong 10 phút. Ly tâm 12000 rpm trong 1 phút. Hút bỏ phần dịch và
tiến hành rửa tế bào 2 lần bằng nước cất vô trùng. Qua mỗi lần rửa ly tâm 12000
rpm trong 1 phút, loại bỏ dịch nổi. Thêm 100 µl nước cất vô trùng, 100 µl hạt thủy
tinh, 150 µl dung dịch phenol/chlorofom (tỷ lệ 1:1), đặt vào máy phá tế bào trong 1
phút. Đem ly tâm ở 12000 rpm trong 10 phút. Lấy phần dịch trong phía trên có
chứa DNA, sau đó DNA được giữ ở -20°C.
- Tinh chế DNA: Do DNA còn chứa nhiều chất ức chế PCR nên trước khi
dùng DNA làm khuôn cho phản ứng PCR, chúng tôi tiến hành tinh chế DNA bằng
Silica bead DNA Gel extraction Kit. Hút 50 µl dịch trong chứa DNA cho vào

dịch đệm là 0,5 × TAE. Để chuẩn bị gel điện di, agarose 1 % được làm tan trong đệm
TAE. Đợi nhiệt độ gel hạ xuống 60 - 70°C, đổ gel vào phiến nhựa điện di (kích
thước tùy theo số lượng mẫu cần điện di) được đặt thăng bằng trên mặt phẳng nằm

Formatted: Border: Bottom: (Double solid
lines, Auto, 0.5 pt Line width)
Formatted: Font: 4 pt
Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt

Formatted: Condensed by 0.2 pt

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar
Formatted: Font color: Black

Nguyễn Thị Thu

15


Viện Đại học Mở Hà Nội

Khoa Công nghệ sinh học

ngang đã đặt sẵn lược. Để gel đông lại ở nhiệt độ phòng, gỡ bỏ lược, đặt bản gel vào

pt

Gạo ngâm nước 8h
Xay nước
Lọc bột
Phối trộn thành phần
Th
Ủ bột nhào (30’)
Nặn bánh, xếp khay

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt
Formatted: Font: 12 pt

Đậy kín, ủ men (30˚, 40h)

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)

Phơi men

Formatted: Font color: Black, Check spelling
and grammar

Bảo quản nhiệt độ thường

Nguyễn Thị Thu



Để nguội, đánh tơi

Phối trộn với men thuốc bắc
(tỉ lệ 2%/gạo)
Ủ cơm (30°C, 48h)

Pha nước (tỉ lệ 1:1)

Lên men (30°C, 4ngày)

Ly tâm tách dịch

Bã

Dịch sau lên men

Formatted: Space Before: 0.9 pt, After: 0.9
pt

Hình 2.2: Quy trình lên men
2.2.2.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của thuốc bắc tới chủng vi sinh vật
Chuẩn bị: Sử dụng hai công thức thuốc bắc CT1 bổ sung bài thuốc bắc này
vào trong môi trường MT3, MT4 với tỉ lệ 5% thuốc bắc, để trong các bình riêng,

Formatted: Font color: Black
Formatted: Space Before: 0 pt, After: 8 pt,
Border: Top: (Double solid lines, Auto, 0.5 pt
Line width)
Formatted: Font color: Black, Check spelling