ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ HỒNG PHÚ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM
VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME
PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO
PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

TP.HCM - 2012


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LÊ HỒNG PHÚ

NGHIÊN CỨU THU NHẬN CHẾ PHẨM
VI SINH VẬT TỔNG HỢP ENZYME
PECTINASE, CELLULASE VÀ ỨNG DỤNG
TRONG SẢN XUẤT CÀ PHÊ NHÂN THEO
PHƢƠNG PHÁP LÊN MEN
Chuyên ngành: Hóa Sinh
Mã số:
1.05.10

LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

7.

Nguyễn Thảo Nguyên
Đỗ Đại Nghĩa
Nguyễn Thị Minh Trinh
Nguyễn Hữu Thái
Ngô Tiến Hiễn Vinh
Lê Thị Lệ
Phạm Mỹ Vẹn

8. Nguyễn Thị Kim Châu
9. Nguyễn Thị Ngà
10. Cao Hoàng Tấn
11. Nguyễn Văn Hân
12. Nguyễn Thị Bảo Anh
13. Nguyễn Thị Cẩm Vân
14. Võ Ngọc Thanh

Đã nỗ lực cùng tôi vƣợt qua nhiều khó khăn và hỗ trợ tôi hoàn tất những nội dung
nghiên cứu của luận án.
Và cuối cùng cho tôi đƣợc cảm ơn Ban chủ nhiệm khoa và đồng nghiệp tại Khoa
CNSH ĐH Quốc Tế nơi tôi đang công tác đã giúp đỡ và tạo điều kiện để tôi hoàn
thành luận án.
Tác giả luận án
Lê Hồng Phú


I

LỜI CAM ĐOAN

1.3.1 Thành phần hóa học của nhân cà phê ............................................................ 12
1.3.1.1 Carbohydrates ........................................................................................ 13
1.3.1.2 Hợp chất chứa nitơ ................................................................................. 14
1.3.1.3 Acid chlorogenic .................................................................................... 17
1.3.1.4 Hương thơm cà phê ................................................................................. 18
1.3.1.5 Acid carboxylic ....................................................................................... 19
1.3.1.6 Các chất khoáng...................................................................................... 20
1.3.2. Tính chất vật lý ............................................................................................ 20
1.4 PECTIN ................................................................................................................ 21
1.4.1 Cấu tạo pectin ................................................................................................ 21
1.4.2 Tính chất của pectin ....................................................................................... 22
1.4.2.1 Tính chất làm đông đặc ........................................................................... 22
1.4.2.2 Tính tạo gel của pectin ............................................................................ 22
1.4.2.3 Tính nhớt của dung dịch pectin............................................................... 22
1.4.2.4 Pectin ở trái cà phê ................................................................................. 23
1.4.3 Ứng dụng ....................................................................................................... 23
1.5 CELLULOSE ....................................................................................................... 23
1.5.1 Cấu tạo ....................................................................................................... 23
1.5.2 Tính chất ................................................................................................... 24
1.5.3 Ứng dụng .................................................................................................... 25
1.5.4 Cellulose ở trái cà phê ................................................................................ 25
1.6 GIỚI THIỆU CHUNG ENZYME PECTINASE VÀ CELLULASE ................. 25


III

1.6.1 Pectinase ....................................................................................................... 26
1.6.1.1 Phân loại và cơ chế tác động .................................................................. 26
1.6.1.2 Ứng dụng ................................................................................................. 27
1.6.1.3 Hệ vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme pectinase .......................... 27

2.1.3.1 Môi trường phân lập và nuôi cấy nấm sợi, nấm men và vi khuẩn .......... 41
2.1.3.2 Môi trường nhân giống ........................................................................... 42
2.1.3.3 Môi trường giữ giống .............................................................................. 42
2.1.4 Hóa chất ........................................................................................................ 42
2.1.4.1 Hóa chất sử dụng cho môi trường .......................................................... 42
2.1.4.2 Hóa chất sử dụng cho phương pháp xác định hoạt tính enzyme ............ 42
2.1.4.3 Hóa chất sử dụng cho các phương pháp xác định thành phần .............. 43
2.1.5 Thiết bị - dụng cụ ........................................................................................... 43
2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................................... 44
2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh vật ................................................................................ 44


IV

2.2.1.1 Phương pháp phân lập giống vi sinh vật từ nhân cà phê ....................... 44
2.2.1.2 Phương pháp cấy chuyền và giữ giống (trong điều kiện vô trùng) ........ 44
2.2.1.3 Phương pháp nhân giống ........................................................................ 44
2.2.1.4 Phương pháp lên men ............................................................................. 44
2.2.1.5 Phương pháp đếm tế bào vi sinh vật trong chế phẩm ............................. 45
2.2.2 Phƣơng pháp hóa lý ....................................................................................... 45
2.2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm ................................................................. 45
2.2.2.2 Phương pháp trích chất hòa tan ............................................................. 46
2.2.2.3 Phương pháp nghiền ............................................................................... 46
2.2.2.4 Phương pháp rây..................................................................................... 46
2.2.2.5 Phương pháp ngâm ................................................................................. 46
2.2.3 Phƣơng pháp hóa sinh .................................................................................... 47
2.2.3.1 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme cellulase, pectinase......... 47
2.2.3.2 Các phương pháp xác định thành phần chủ yếu trong cà phê ............... 52
2.2.4 Phƣơng pháp định danh vi sinh vật................................................................ 60
2.2.4.1 Phương pháp định danh nấm sợi ............................................................ 60

V

3.3.1 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao .................... 89
3.3.1.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase .......... 89
3.3.1.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase .................. 94
3.3.1.3 Xác định thời gian tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme pectinase
của các chủng nấm sợi ............................................................................ 96
3.3.1.4 Xác định nồng độ đường ( oBrix ) của dung dịch malt đến
sự sinh tổng hợp enzyme pectinase ....................................................... 101
3.3.1.5 Xác định pH ban đầu dung dịch malt đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme pectinase .................................................................................... 103
43.3.1.6 Ảnh hưởng của lượng muối (NH4)2SO4 bổ sung đến khả năng
sinh tổng hợp enzyme pectinase ........................................................... 105
3.3.1.7 Xác định nhiệt độ nuôi đến khả năng sinh tổng hợp
enzyme pectinase .................................................................................... 107
3.3.1.8 Tổng kết quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính pectinase cao .............. 109
3.3.2 Nghiên cứu điều kiện tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao ................... 110
3.3.2.1 Xác định môi trường tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase ........ 110
3.3.2.2 Xác định độ ẩm tối ưu cho sinh tổng hợp enzyme cellulase ................ 114
3.3.2.3 Xác định ảnh hưởng của thời gian nuôi đến quá trình sinh tổng hợp
cellulase của các chủng vi sinh vật ........................................................ 116
3.3.2.4 Tổng kết quy trình tạo chế phẩm có hoạt tính cellulase cao ................... 120
3.4 KHẢO SÁT CHẤT LƢỢNG CHẾ PHẨM THEO THỜI GIAN BẢO QUẢN .... 121
3.4.1 Số lƣợng tế bào vsv thay đổi theo thời gian bảo quản ................................. 122
3.4.2 Khảo sát hoạt tính enzyme pectinase thay đổi theo thời gian bảo quản ...... 123
3.4.3 Khảo sát hoạt tính enzyme cellulase thay đổi theo thời gian bảo quản ...... 124
3.4.4 Tổng kết khảo sát chất lƣợng chế phẩm theo thời gian bảo quản
và sơ bộ hạch toán kinh tế ........................................................................... 125
3.5 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TÁCH VỎ CÀ PHÊ ......................................... 125
3.5.1 Khảo sát ảnh hƣởng lƣợng chế phẩm vsv đến khả năng tách vỏ

trong Coffea C. C. robusta của các CPVSV từ nấm sợi ............................. 141
3.6.4.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến khả năng chiết chất hòa tan
trong Coffea chari của các CPVSV từ nấm sợi ......................................... 143
3.6.5 Tổng kết nghiên cứu lên men nhân cà phê và quy trình lên men .................... 145
3.6.6 Nghiên cứu đánh giá cảm quan cà phê ........................................................ 145
3.6.6.1 Đánh giá cảm quan cà phê C. arabica ................................................. 146
3.6.6.2 Đánh giá cảm quan cà phê C. robusta ................................................. 147
3.6.6.3 Đánh giá cảm quan cà phê C. chari ..................................................... 147
3.6.7 Thử nghiệm lên men kết hợp các chế phẩm tốt nhất từ nấm sợi, nấm men
và vi khuẩn ....................................................................................................... 148
3.6.7.1 Khảo sát nồng độ chất tan bởi lên men kết hợp ...................................... 149
3.6.7.2 Khảo sát hàm lượng caffeine giải phóng bởi lên men kết hợp ................. 151
3.6.8 Quy trình tách vỏ và lên men cà phê bởi chế phẩm ........................................ 153
3.6.8.1 Quy trình tách vỏ bởi chế phẩm vsv ........................................................ 153
3.6.8.2 Quy trình lên men cà phê bởi chế phẩm vsv ............................................ 154

CHƢƠNG 4 - KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .........................................157
DANH MỤC CÔNG TRÌNH .....................................................................159
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................161
PHỤ LỤC ....................................................................................................170


VII

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ tắt

Chữ nguyên

Ý nghĩa


Chế phẩm vi sinh vật
Hợp chất thơm trong cà
phê
Canh trƣờng
Canh trƣờng
3,5 - dinitrosalicylic acid Một chất thử cho xác định
đƣờng khử
Đối chứng
Đối chứng
Môi trƣờng
Môi trƣờng
Nguyên liệu
Nguyên liệu
Potato glucose agar
Môi trƣờng giữ giống gồm
khoai tây, glucose và thạch
Phòng thí nghiệm
Phòng thí nghiệm
Tiêu chuẩn Việt Nam
Tiêu chuẩn Việt Nam
Thí nghiệm
Thí nghiệm
Vi sinh vật
Vi sinh vật