1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Ung thư dạ dày là bệnh lý tiêu hóa thường gặp, là nguyên nhân thứ 3
gây tử vong trong các bệnh ung thư, tăng 7% ca ung thư mới mắc và 10% ca
tử vong do ung thư mỗi năm [2]. Trước những năm 1930, hầu hết các nước
trên thế giới, bao gồm cả các nước châu Âu, ung thư dạ dày là nguyên nhân
gây nên tử vong chính do ung thư. Dần dần sau đó, tỷ lệ này được giảm xuống ở
nhiều vùng. Tuy nhiên, ở khu vực châu Á, châu Phi – nơi có chất lượng đời sống
còn thấp – thì tỉ lệ mới mắc và tỷ lệ tử vong vẫn còn ở mức cao. Trong đó, theo
thống kê của Tổ chức ghi nhận ung thư toàn cầu (IARC), mỗi năm, ở nước ta, có
từ 11.000 – 12.000 người mắc mới ung thư dạ dày và hơn 8.000 người tử vong
[5]. Con số này được đánh giá là khá cao, vì thế sự hiểu biết về căn bệnh này để
có các biện pháp phòng tránh, chữa trị kịp thời là rất cần thiết.
Sinh học phân tử là môn khoa học về giới sinh vật ở cấp độ phân tử,
chủ yếu tập trung nghiên cứu mối tương tác giữa các hệ thống cấu trúc khác
nhau trong tế bào, bao gồm mối quan hệ qua lại giữa quá trình tổng hợp của
DNA, RNA và protein; và tìm hiểu cách thức điều hòa các mối tương tác này.
Trên thế giới, sinh học phân tử đã có những bước nghiên cứu phát triển vượt
bậc và áp dụng rỗng rãi không chỉ trong nghiên cứu mà còn cả trong điều trị
lâm sàng. Ở Việt Nam, các đề cương, chính sách, đề án nghiên cứu về sinh
học phân tử trong y tế đã và đang được xây dựng và triển khai thực hiện. Bên
cạnh đó, cơ sở hạ tầng phục vụ cho nghiên cứu và đào tạo nguồn nhân lực về
sinh học phân tử cũng nhận được nhiều ưu tiên. Trình độ nghiên cứu và ứng
dụng công nghệ sinh học phân tử được đẩy mạnh, góp phần đáng kể trong
việc điều trị và tiên lượng nhiều chứng bệnh khác nhau, đặc biệt là ung thư. Ở
Việt Nam, trong những năm gần đây, nhiều công trình nghiên cứu khoa học


2


về mô bệnh học bao gồm: ung thư tế bào tuyến vẩy, các u nội tiết, u mô đệm
đường tiêu hóa và lymphoma [3].
1.1.1. Dịch tễ học
Theo tổ chức Y tế thế giới (WHO), năm 2012, trên thế giới có 950.000
người mắc ung thư dạ dày và gây ra 723.000 ca tử vong [2]. Trong các loại ung
thư theo giới, ung thư dạ dày đứng thứ 3 ở nam và xếp thứ 5 đối với nữ [4].
Các nước có tỷ lệ mắc ung thư dạ dày cao thuộc vùng Đông Á (Nhật
Bản, Trung Quốc, Hàn Quốc), Liên Xô cũ, Nam Mỹ, châu Phi, vùng Caribe
và Nam Âu. Các nước có tỷ lệ mắc bệnh thấp thuộc vùng Nam Á (Ấn Độ,
Pakistan, Thái Lan), Bắc Mỹ, Úc[4].
Ở Việt Nam, tỷ lệ mắc ung thư dạ dày khá cao, đứng thứ 2 sau ung thư
phổi ở nam giới và ung thư vú ở nữ [5]. Theo Bùi Xuân Trường và cs, ghi
nhận ung thư dạ dày có sự khác nhau giữa hai giới và hai miền Nam Bắc [3].


4

Bảng 1.1. Tỷ lệ mắc ung thư dạ dày theo giới ở một số tỉnh ở Việt Nam
Nguồn: Ung thư dạ dày, Trần Thiện Trung (2014)
Hà Nội
Tỷ lệ mắc chuẩn theo
tuổi (ASR)/100.000 dân Nam Nữ
Giai đoạn 2001-2004
30,3 15,0
Giai đoạn 2005-2008
30,1 14,9

Hải Phòng
Nam Nữ
16,0 8,1


có báo cáo đến 4/1 [3].
Yếu tố gia đình hoặc di truyền là các yếu tố nguy cơ cao có thể mắc
ung thư dạ dày. Một số báo cáo cho rằng, tỷ lệ bệnh nhân có nhóm
máu A gặp nhiều hơn nhóm máu khác đến 15-20% và khi bố mẹ
hoặc anh chị em ruột bị ung thư dạ dày thì nguy cơ bị ung thư dạ

•

dày cũng cao hơn hẳn [2],[3].
Chế độ ăn có nhiều nitrate ở trong các thức ăn như thịt hun khói, thịt
cá ướp muối, thịt nướng cháy, dầu mỡ rán lại nhiều lần làm tăng

•

nguy cơ bị mắc ung thư dạ dày.
Người có bệnh viêm dạ dày mạn tính, viêm dạ dày kèm dị sản ruột,
loạn sản hoặc có hiện tượng trào ngược tá tràng dạ dày có thể được

•

coi là thương tổn tiền ung thư dạ dày.
Loét dạ dày không làm tăng nguy cơ mắc ung thư dạ dày. Tuy
nhiên, Helicobacter Pylory, nguyên nhân hàng đầu của viêm và loét
dạ dày lại là một yếu tố nguy cơ quan trọng đối với ung thư dạ dày.


5

1.1.3. Chẩn đoán lâm sàng

1.1.4.3. Các xét nghiệm khác
•

Siêu âm ổ bụng: là phương tiện chẩn đoán hình ảnh được sử dụng
thường quy trong kiểm soát và chẩn đoán các bệnh khác trong ổ
bụng. Do đó, nó giúp tìm di căn và đánh giá giai đoạn ung thư dạ

•

dày.
Chụp cắt lớp vi tính CT: với độ chính xác về vị trí cao, chụp cắt lớp

•

CT giúp phát hiện chính xác vị trí của khối u và tình trạng di căn.
Các xét nghiệm cơ bản: các dấu ấn ung thư tăng cao như CEA, CA
19-9, CA 72-4. Tuy nhiên, các dấu ấn này chỉ tăng cao rõ rệt khi
ung thư dạ dày ở giai đoạn muộn và có giá trị cao trong điều trị,
theo dõi ung thư dạ dày [6],[7].

1.2. TỔNG QUAN VỀ LncRNA GAS5

1.2.1. Cấu trúc và chức năng của gen
Năm 1953, Watson – Crick phát hiện ra cấu trúc xoắn kép của DNA
đánh dấu bước phát triển của sinh học phân tử vào giai đoạn mới [8]. Đỉnh
cao nghiên cứu gần đây là vào năm 2003, công bố phiên bản thô của bộ gen
người hoàn chỉnh [8]. Gen là một đoạn phân tử DNA mang thông tin mã hóa
một sản phẩm xác định (một chuỗi polypeptid hay một phân tử RNA) [9].

Hình 1.1. Cấu trúc chung của gen

mRNA và dịch mã [11].
LncRNA là nhóm ncRNA lớn nhất và đang được các nhà khoa học trên
thế giới hết sức quan tâm. Chúng là các RNA không mã hóa protein và có


8

chiều dài tối thiểu là 200 nucleotid, cũng có thể là các mRNA giống ncRNA.
Từ năm 1961, Jacob và Monod đã bắt đầu suy luận về sự tồn tại của mRNA
và giảng giải về mô hình điều hòa gen, và họ suy đoán rằng sự ức chế có thể
là do một phân tử RNA [13]. Nhưng mãi đến tận năm đầu thập kỉ 90 của thế
kỉ trước, các nhà khoa học mới tìm ra được LncRNA đầu tiên – đó là Xist
[14]. Sau đó, làng loạt LncRNA đã được báo cáo là phát hiện ra ở các động
vật có vú khác.
1.2.3. GAS5 (Growtharrest-specific5)
GAS5 là một LncRNA, được Smith và Steits thuộc đại học Yale Hoa
Kỳ phát hiện năm 1998 và được định danh bởi Ủy ban danh mục gen HUGO
– HGNC (HUGO Gene Nomenclature Committee) [18]. GAS5 thuộc họ 5’Terminal Oligopyrimidine (5’ TOP), gen gồm 12 exon, các exon này kết hợp
lại tạo thành hai LncRNA là GAS5a và GAS5b khi có sự thay đổi vị trí 5’ tại
exon 7 [18],[19]. Người ta cho rằng, một phần cấu trúc của GAS5 giống với
các yếu tố phản ứng glucocorticoid. Do đó, nó có thể gắn vào DNA ở vị trí
của vùng liên kết receptor glucocorticoid. Từ đó, ngăn chặn sự hoạt động của
receptor glucocorticoid và điều hòa quá trình phiên mã.
Trong các nghiên cứu gần đây cho thấy, LncRNA GAS5 có mức độ
biểu hiện thấp trong các tế bào ung thư, như ung thư cổ tử cung, ung thư tế
bào biểu mô gan, ung thư tế bào biểu mô thận và nhiều loại ung thư khác
[15],[20],[21]. Mức độ biểu hiện này có liên quan đến đặc điểm bệnh lí, giai
đoạn bệnh và có giá trị trong tiên lượng [18].
Năm 2014, Ming Sun và cộng sự đã nghiên cứu trên 89 bệnh nhân ung
thư dạ dày nhận thấy sự biểu hiện của GAS5 trong mô ung thư dạ dày là thấp.

+ Chiều dài: 20-30 nucleotid
+ Có số lượng tương đương nucleotid
+ Tránh lặp lại trình tự nucleotid
+ Tránh có 3 G hoặc C ở đầu 3’
+ Tránh hình thành cấu trúc bậc 2


10

+ Trình tự nucleotid ở đầu 3’ không được liên kết bổ sung với nhau
hoặc với các mồi khác để hình thành nên phức hợp 2 mồi.
- DNA polymerase: là enzym kéo dài chuỗi theo nguyên tắc bổ sung.
Khi cân nhắc lựa chọn DNA polymerase cho PCR, người ta thường cân nhắc
tới 2 yếu tố: sự chính xác và hiệu suất phản ứng. Để đảm bảo được 2 điều
trên, DNA polymerase phải chịu được nhiệt độ cao, cho phép việc lặp lại
nhiều lần chu kỳ của PCR mà chỉ cần bổ sung một lần duy nhất enzym này
vào thời điểm bắt đầu phản ứng. Ngày nay, người ta thường sử dụng Taq
DNA polymerase. Enzym này có nhiệt độ tối ưu vào khoảng 72-75ºC [17].
Tuy nhiên, Taq DNA polymerase không có hoạt tính sửa chữa nên các sai sót
trong quá trình kéo dài sẽ không được khắc phục.
- Acid nucleic khuôn là DNA, RNA hoặc cDNA được tách chiết, tổng
hợp từ máu, mô hoặc dịch cơ thể,…
Dung dịch được trộn đều và cho vào chu trình nhiệt thích hợp để bắt
đầu quá trình sao chép, khếch đại gen. Quá trình PCR gồm 3 giai đoạn chính
khác nhau và được điều hòa bởi nhiệt độ:
Giai đoạn 1 (biến tính): DNA khuôn sẽ được biến tính ở nhiệt độ cao
mà tại đó cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA bị phá vỡ. Phân tử DNA từ dạng
sợi kép tách thành 2 sợi đơn (ở 94ºC - 95ºC trong vòng 30-60 giây). Trước
chu kỳ 1, DNA thường được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo
mẫu DNA và mồi được phân tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn.


1.3.2. Phương pháp điện di
Kỹ thuật điện di là kỹ thuật cơ bản nhất để kiểm tra kết quả của các phản
ứng sinh học phân tử. Điện di cho phép chúng ta quan sát được sự có mặt của
các phân tử DNA đã được nhân lên trong phản ứng PCR.
Sự điện di là sự chuyển động của các phân tử huyền phù hoặc keo, trong
điện trường [29]. Có nhiều phương pháp điện di: điện di dưới kính hiển vi,
điện di trong dung dịch tự do, điện di trên chất giá. Trong nghiên cứu này,
chúng tôi sử dụng phương pháp điện di trên chất giá, với chất giá là agarose
1,5%.
Bản chất của sự điện di là sự di chuyển của các hạt mang điện tích từ cực
này đến cực kia của dòng điện. DNA có bản chất là 1 acid, do đó, DNA mang
điện tích âm. Khi có dòng điện 1 chiều chạy qua thì DNA có xu hướng chạy
từ cực dương về cực âm của dòng điện.
Tốc độ chạy của DNA phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Yếu tố ảnh hưởng
đầu tiên là bản chất của DNA. DNA có trọng lượng phân tử nhỏ hơn thì di
chuyển nhanh, và ngược lại, DNA có trọng lượng phân tử lớn thì di chuyển
chậm. Trong điện di, chất giá được coi như là tấm lưới lọc DNA. Tấm lưới
lọc quá dày (nồng độ chất giá quá lớn) thì làm giảm tốc độ hoặc có thể làm
cho DNA không thể chạy được; còn nếu tấm lưới lọc quá thưa (nồng độ chất
giá quá bé) thì làm tốc độ chạy DNA quá nhanh. Dòng điện tuy rằng không
ảnh hưởng trực tiếp đến quá trình chạy của DNA. Nhưng nếu để hiệu điện thế
và cường độ dòng điện quá cao làm tăng nhiệt độ và làm bay hơi nước ở trong
dung dịch điện di. Điều này mới ảnh hưởng đến quá trình chạy của DNA.
1.3.3. Phương pháp RT-PCR (Reverser Transcription PCR)
RT-PCR là kỹ thuật sử dụng enzym phiên mã ngược để tổng hợp
cDNA từ đoạn RNA thu được sau khi tách chiết. Và cDNA mới tổng hợp
được này là nguyên liệu khuôn cho phản ứng PCR khuếch đại.



14

Có nhiều loại đầu dò như Taqman, SYBR Green, Molecular Beacon, Eclipse,
Ampliflour, Scorpion…
Taqman là loại đầu dò oligonucleotid có khả năng lai với một vị trí nội
phân tử của gen đích. Sự phát quang của đầu dò được điều hòa bởi 2 chất là chất
phát quang (gắn ở vị trí 5’) và chất dập tắt (gắn ở vị trí 3’). Ban đầu, khi đoạn
Oligonucleotid này được gắn vào gen thì chất huỳnh quang không thể phát tín
hiệu được do có chất dập tắt. Khi Taq polymerase di chuyển đến vị trí 5’ (vị trí
có chứa chất huỳnh quang), Taq polymerase thủy phân đầu 5’ của đầu dò và giải
phóng ra chất huỳnh quang làm xuất hiện tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh
quang này được thu bởi bộ phẩn cảm biến của máy Realtime PCR.
Do đó, nồng độ chất huỳnh quang được phát ra chính là nồng độ bản sao
được khuếch đại lên trong quá trình Realtime PCR.
Taqman là loại đầu do có độ đặc hiệu và độ nhạy cao, tuy nhiên, trong
nghiên cứu này của chúng tôi chỉ đánh giá về mức độ biểu hiện gen và để tiết
kiệm chi phí nên chúng tôi sử dụng đầu dò SYBR Green.

Hình 1.3: Nguyên lý phát tín hiệu huỳnh quang của Taqman
trong phản ứng Realtime PCR
(Nguồn: )


15

SYBR Green là 1 loại chất đánh dấu được chèn vào sợi đôi DNA và có
khả năng phát ra ánh sáng huỳnh quang khi nhận được nguồn sáng kích thích.
Khi không có sự hiện diện các sợi đôi DNA, chất huỳnh quang bị phân
tán trong dung dịch PCR mix, do vậy tín hiệu huỳnh quang phát ra yếu. gần
như không thu được. Nhưng khi có sự hiện diện sản phẩm khuếch đại của

Biểu hiện gen là quá trình mà thông tin từ gen được sử dụng trong sự
tổng hợp của một sản phẩm gen chức năng. Những sản phẩm này thường là


17

các protein, nhưng trong các gen không mã hóa protein như tRNA, snRNA thì
sản phẩm ở đây là các chuồi polypeptid.
Để đánh giá mức độ biểu hiện gen, trong nghiên cứu này, chúng tôi sử
dụng phương pháp Delta delta Ct của Livak [25]. Công thức được tính như sau:
Mức độ biểu hiện của gen nghiên cứu trong mẫu mô bệnh so với mô
lành giảm 2ΔΔCt lần.
Trong đó:
ΔCt1 = Ct(gen nghiên cứu ở mô lành) – Ct(gen tham chiếu mô lành)
ΔCt2 = Ct(gen nghiên cứu ở mô bệnh) – Ct(gen tham chiếu ở mô bệnh)
=> ΔΔCt = ΔCt1 – ΔCt2


18

Chương 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU

2.1.1. Thời gian và địa điểm
Đề tài nghiên cứu này được thực hiện tại Trung tâm nghiên cứu GeneProtein trường đại học Y Hà Nội, trong thời gian từ 17/10/2015 đến
20/05/2016.
2.1.2. Lựa chọn đối tượng
Đối tượng của đề tài nghiên cứu này là bệnh nhân đã được chẩn đoán là
ung thư biểu mô dạ dày được nhập viện và điều trị tại khoa U bướu, Bệnh

- Máy PCR Eppendorf
- Máy Realtime PCR Eppendorf Realplex4
2.2.2. Hóa chất
- Hóa chất tách chiết RNA
Sử dụng kit tách RNA: RNeasy Minikit QIAGEN
+ β Mercaptoethanol (tránh ánh sáng)
+ RLT
+ RW1
+ RPE ( 1 thể tích RPE và 4 thể tích cồn tuyệt đối)
+ Water free-RNAase
Bảo quản ở nhiệt độ 22-25ºC
- Hóa chất tổng hợp cDNA: qScript cDNA Synthesis Kit của
QuantaBio
+ Nuclease-free water
+ qScript Reaction Mix (5X): dung dịch đệm, Mg2+, Oligo (dT),
mồi ngẫu nhiên và các dNTP.
+ qScript RT
Bảo quản ở nhiệt độ -20ºC


20

- Hóa chất chạy PCR
+ Go Taq: dNTPs, Taq Polymerase, dung dịch đệm.
+ Nước cất 2 lần dH2O
+ Primers: Mồi xuôi, mồi ngược của gen GAS5 và gen GADPH.
Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong nghiên cứu
Tên

Trình tự mồi

+ Primers: mồi xuôi và mồi ngược của gen GAS5 và GAPDH
+ Nước cất 2 lần
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Nghiên cứu mô tả tiến cứu
2.4. QUY TRÌNH KỸ THUẬT


21

2.4.1. Cách tiến hành lấy bệnh phẩm
- Cách lấy bệnh phẩm: Bệnh phẩm được lấy bởi bác sĩ lâm sàng gồm 2
mảnh dạ dày gồm 1 mảnh ở vùng mô bệnh và 1 mảnh ở vùng mô lành cách
mô bệnh 5cm. Mảnh mô bệnh của bệnh nhân được Giải phẫu bệnh chuẩn
đoán xác định là mô ung thư biểu mô dạ dày.
- Bệnh phẩm lấy xong được cho vào ống nghiệm và được bảo quản
trong đá lạnh rồi chuyển về phòng xét nghiệm của Trung tâm nghiên cứu
Gen-Protein Trường Đại học Y Hà Nội. Sau đó, mẫu bệnh phẩm được bảo
quản ở tủ lạnh âm sâu -80ºC.
- Mã hóa mẫu bệnh phẩm: mẫu mô lành là A, mẫu mô bệnh là B.
2.4.2. Quy trình tách chiết RNA
Quy trình tách chiết RNA từ mô dạ dày được thực hiện theo kit Rneasy
Minikit QIAGEN. Quy trình cụ thể như sau:
Bước 1: Chuẩn bị dung dịch
Thêm đủ 4 thể tích cồn tuyệt đối vào 1 thể tích RPE
Thêm 10µl β-ME vào 1ml RLT
Bước 2: Lấy 30mg mẫu mô dạ dày dùng cối và chày đã được hấp sấy
vô trùng nghiền nhỏ ra.



Bước 3: Lau sạch cuvet, nhỏ 1µl RNA vào cuvet và khởi động máy chạy.
2.4.4. Quy trình tổng hợp cDNA
Tổng hợp cDNA là chu trình sử dụng nguyên lý của bước 1 trong quá
trình RT-PCR hai bước. Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng qScript
cDNA Synthesis Kit của QuantaBio.
Bước 1: Rã đông và trộn đều hóa chất trước khi sử dụng.
Bước 2: Trộn dung dịch vào ống Eppendorf 0.2ml trên đá lạnh. Dung
dịch bao gồm:
Bảng 2.2. Tỷ lệ mix trong tổng hợp cDNA
Nguyên liệu

Định lượng

RNA (10pg - 1µg)

2µl

Nước

13µl

qScript Reaction Mix (5X)

4µl

qScript RT

1µl

Tổng

3µl
0,5µl
0,5µl
4µl
16µl

Bước 3: Đặt ống Eppendorf vào chu trình nhiệt như sau:
95ºC trong 2 phút
Biến tính: 95ºC trong 30 giây
Gắn mồi: 55ºC-60ºC trong 30 giây
Kéo dài: 72ºC trong 30 giây
72ºC trong 2 phút
Giữ 15ºC.
2.4.6. Quy trình kiểm tra kết quả PCR

lặp lại 35 chu kỳ


25

2.4.6.1. Đổ gel agarose
Nồng độ gel cần đổ 1,2-1,5% do chiều dài đoạn gen GAS5 cần
khuếch đại là 137 bp, của GAPDH là 307 bp.
Bước 1: Hòa tan 0,375g agarose bởi 25ml TBE 10X
Bước 2: Đun sôi trong lò vi sóng 1’30” (mở hé nắp bình đựng).
Bước 3: Rửa nước cho nguội bớt
Bước 4: Đổ ra khuôn và để 30-45 phút để thạch đông lại.
2.4.6.2. Điện di kiểm tra
Bản gel sau khi được đông lại thì chuyển vào máy điện di có chứa
sẵn dung dịch TBE 10X, xoay hướng giếng về phía cực âm của nguồn điện.