ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

PHẠM LÊ BỬU TRÚC

NGHIÊN CỨU ĐIỀU TRỊ THỰC NGHIỆM BỆNH TIM
THIẾU MÁU CỤC BỘ BẰNG LIỆU PHÁP TẾ BÀO GỐC
TRÊN CHUỘT
Chuyên ngành: Sinh lí học Người và Động vật
Mã số chuyên ngành: 62 42 30 01

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC

 
Tp. Hồ Chí Minh – 2015


Công trình được hoàn thành tại:
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
(ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM)
Địa chỉ: 227 Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, TP. HCM

Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS. PHẠM THÀNH HỔ

Phản biện 1: PGS.TS. Trương Quang Bình
Phản biện 2: GS.TS. Nguyễn Văn Thuận
Phản biện 3: PGS.TS. Lê Văn Đông
Phản biện độc lập 1: TS.BS. Hoàng Văn Sỹ
Phản biện độc lập 2: TS. Nguyễn Lê Xuân Trường

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại

vành xơ vữa làm giảm lưu lượng máu đến nuôi cơ tim, về lâu dài dẫn đến
suy tim. Do lượng máu giảm nên tế bào bị thiếu oxy và dinh dưỡng, nếu tình
trạng kéo dài một phần tế bào sẽ bị chết. Các biện pháp điều trị thường quy
đã được sử dụng như điều chỉnh lối sống, dùng thuốc, can thiệp động mạch
vành qua da hay mổ bắc cầu nối động mạch vành. Tuy nhiên, cho đến nay, y
học vẫn chưa có biện pháp giúp hồi phục phần tế bào chết và đây là vấn đề
mà các nhà y học tái tạo hiện đang rất quan tâm.
Phương pháp trị liệu cấy ghép tế bào gốc trên các bệnh nhân bệnh tim
thiếu máu cục bộ nhằm cải thiện sức khoẻ đang được nhiều quốc gia trên thế
giới như Mỹ, Pháp, Áo, Đức, Hàn Quốc, Trung Quốc… tiến hành nghiên
cứu. Những kết quả ban đầu cho thấy nhiều triển vọng của phương pháp này
trong chữa bệnh tim do thiếu máu cục bộ. Lần đầu tiên ở Việt Nam, trường
Đại học Y Hà Nội phối hợp cùng Viện Tim mạch Quốc gia Việt Nam đã tiến


 

1
 


hành nghiên cứu và triển khai ứng dụng điều trị cấy ghép tế bào gốc để điều
trị cho các bệnh nhân suy tim sau nhồi máu.
Để việc điều trị bằng tế bào gốc được tiến hành có hệ thống và căn cơ,
các nghiên cứu cần phải tiến hành từ bước cơ bản trên mô hình chuột. Do đó,
đề tài “Nghiên cứu điều trị thực nghiệm bệnh tim thiếu máu cục bộ bằng
liệu pháp tế bào gốc trên chuột” được đặt ra.
2.   Mục đích nghiên cứu
Thử nghiệm ghép tế bào gốc trên mô hình chuột tổn thương cơ tim do
thiếu máu cục bộ nhằm bước đầu đánh giá độ an toàn và hiệu quả của liệu

hay tế bào cảm ứng đa tiềm năng (iPSCs). Tế bào gốc có nguồn gốc từ máu
cuống rốn (UCB-MSCs) với các đặc tính như trẻ, khỏe, dễ thu nhận, và có
khả năng điều biến miễn dịch được cho là nguồn tế bào tiềm năng để biệt hóa
thành tế bào cơ tim hướng đến ứng dụng điều trị các bệnh tim mạch.
1.4. Tình hình nghiên cứu liệu pháp tế bào trong chữa trị bệnh tim thiếu
máu cục bộ trên thế giới
Đã hơn 20 năm kể từ ngày công trình đầu tiên về cấy ghép tế bào
điều trị tổn thương tim được công bố, đến nay liệu pháp tế bào trong điều trị
bệnh tim đã có những bước tiến đáng kể. Đầu tiên các công trình tập trung
vào việc sử dụng tế bào cơ xương và tế bào vệ tinh của nó vì khả năng thu
nhận từ nguồn tự thân cao, khả năng tăng sinh mạnh và khả năng chịu được
thiếu máu cục bộ tốt. Tuy nhiên, nguồn tế bào này sau đó được chứng minh
là không chuyển biệt hóa thành tế bào cơ tim và khả năng kết nối với tế bào
cơ tim trong cơ thể chủ sau khi cấy ghép rất thấp. Các nghiên cứu sau đó tiếp
tục tìm kiếm nguồn tế bào thích hợp và tế bào gốc trung mô tủy xương là một
trong số đó. ESCs có thể biệt hóa thành các loại tế bào trưởng thành và đã
được chứng minh là có khả năng tái tạo tế bào mô tim trên các mô hình động
vật. Tuy nhiên, vấn đề đạo đức sinh học, pháp lý và miễn dịch đã cản trở việc
sử dụng chúng trong các thử nghiệm trên người. ESCs được thay thế bằng
các tế bào gốc đa tiềm năng cảm ứng tái lập trình từ tế bào soma hay các tế
bào cơ tim được cảm ứng. Hiện nay, các tế bào cơ tim có nguồn gốc từ tế
bào gốc trưởng thành, bao gồm cả tế bào đơn nhân từ tủy xương, các tế bào
gốc trung mô, tế bào gốc mô mỡ, và các tế bào gốc có nguồn gốc từ tim đang
được ưu tiên thử nghiệm và đánh giá lâm sàng.
Kết quả thử nghiệm lâm sàng gần đây ủng hộ quan điểm cho rằng
liệu pháp tế bào gốc là an toàn và có khả năng sửa chữa các cấu trúc tim cũng

 

3

trước trái ở vị trí 1/3 từ cuống tim nhằm gây tắc nghẽn mạch vành, dẫn đến
tình trạng thiếu máu tim cục bộ.

 

4
 


- Phương pháp thu nhận tế bào tiền thân nội mô từ máu cuống rốn người: Tế
bào đơn nhân được huyền phù trong 3 môi trường khảo sát:
(1)-MT1 (M199 + 20% FBS, 1% antibiotic-mycobiotic, 0,4% ECGF/heparin
và 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, 5 ng/ml bFGF, 5 ng/ml VEGF, 5 ng/ml
hIGF); (2)-MT2 (MCDB131 + 20% FBS, 1% antibiotic-mycobiotic, 0,4%
ECGF/heparin và 12 µg/ml BBE, 10 ng/ml hEGF, 5 ng/ml bFGF, 5 ng/ml
VEGF, 5 ng/ml hIGF); (3)-MT3 (EGM + SingleQuots: 12 µg/ml BBE, 10
ng/ml hEGF, 1 µg/ml hydrocortison và antibiotics, 5% FBS (Sigma) + 50
ng/ml VEGF, 50 ng/ml hIGF, 50 ng/ml hEGF)
với 2 phương pháp:
(1)-PP1 (Thay mới môi trường sau 72 giờ nuôi cấy tế bào)
(2)-PP2 (Chuyển dịch nổi tế bào sau 24 giờ nuôi cấy)
Tế bào tiền thân nội mô ứng viên được đánh giá dựa vào hình thái, sự bám
dính và tăng sinh trong thời gian khảo sát 7, 14, 21 và 28 ngày.
Bảng 2.1. Tóm tắt cách bố trí các nghiệm thức thí nghiệm
STT
1

Tên nghiệm thức
Nghiệm thức A



MT3 + PP2

- Phương pháp biệt hoá tế bào gốc trung mô từ máu cuống rốn người (hUCBMSCs) thành tế bào tiền thân cơ tim (CPs): hUBC-MSCs nuôi trong môi
trường DMEM bổ sung 15% FBS và 1% Penicillin/Streptomycin được dùng
làm mẫu đối chứng. Xử lí với 5-AZC: Các tế bào được cảm ứng trong môi
trường DMEM bổ sung 10% FBS; 1% Penicillin/Streptomycin; 10 µM 5azacytidine; 50 ng/ml activin A; 0,1mM acid ascorbic trong 24 giờ. Sau đó,
các tế bào được rửa qua PBS 2 lần và nuôi trong môi trường DMEM bổ sung
15% FBS, 1% Penicillin/Streptomycin; bổ sung 50 ng/ml activin A; 0,1mM

 

5
 


acid ascorbic không có 5-AZC để tránh gây chết tế bào do phơi nhiễm với 5AZC trong một thời gian dài. Môi trường được thay mỗi 3 ngày cho đến khi
thí nghiệm kết thúc sau 36 ngày. Xử lí 5-AZC + HE: các tế bào được cảm
ứng tương tự như phương pháp biệt hóa bằng 5-AZC thông thường nhưng
lượng 5-AZC được giảm còn 5µM và môi trường biệt hóa được bổ sung thêm
36 µg/ml dịch chiết tim thai chuột E.18.5.
- Phương pháp ghép tế bào: chuột được chia làm 5 nhóm. Nhóm chuột bình
thường, nhóm chuột mô hình được tiêm giả dược, nhóm chuột mô hình được
ghép EPCs, nhóm chuột mô hình được ghép CPs, và nhóm chuột mô hình
được ghép EPCs + CPs. Chuột được gây mê, trợ thở, mở lồng ngực, thắt
LAD và tiến hành tiêm tế bào hay giả dược. Sử dụng thiết bị vi tiêm
Ugobasile, số lượng tế bào được tiêm là 106 tế bào/30µl/con. Thể tích tiêm
là 30µl/con được chia làm 5 lần tiêm xung quanh vị trí nhồi máu (sau khi thắt
mạch vành từ 3-5 phút có thể dễ dàng quan sát vùng tim thiếu máu bị tái đi
so với vùng tim xung quanh). Tốc độ tiêm tế bào là 8,55ml/h. Hiệu quả ghép

Hình 3.1. Biểu đồ sự thay đổi
trọng lượng chuột (p
(E )

(F )

Hình 4. 10. Kết qu ả nhu ộm Trichrome m ẫ u lát c ắ t tim chu ột. (A) Tim chuột ĐC; (B) Tim
chuột mô hình ngày N70; (C) Phần mô tim khỏe mạnh( 40X); (D) Phần mô tim được xác
định nhồi máu (40X); (E) Thành tim chuột ngày N21(10X); (F) Thành tim chuột ngày N70.
Tế bào chất được nhuộm đỏ, nhân được nhuộm xanh đen, Collagen được nhuộm xanh nhạt.

3.1.6. Kết quả nhuộm hóa mô miễn dịch huỳnh quang
Hình 3. 7. So sánh thành
tim chuột đối chứng (A)
và chuột mô hình sau 42
ngày thắt mạch vành (B).
Thành tim chuột mô hình ở vùng thiếu máu do mạch vành bị thắt mỏng hơn
rất nhiều so với thành tim chuột đối chứng (82,3%).

 

8
 


Hình 3. 8. Mô tim chuột được
nhuộm hóa mô miễn dịch
huỳnh quang.

Số tế bào chết khi xét trên tổng diện tích thành tim ở chuột mô hình là rất lớn
so với chuột đối chứng (37,86% so với 0,86%).
BÀN LUẬN

Nhằm tìm được môi trường và phương pháp thu nhận, nuôi cấy EPCs
thích hợp, thí nghiệm được bố trí thành 6 nghiệm thức như Bảng 2.1. Nghiệm
thức F cho kết quả tốt nhất so với các nghiệm thức còn lại. (hình 3.9, 3.10).

Hình 3. 9. Biểu đồ trung bình
số tế bào bám dính qua thời
gian khảo sát ở 6 nghiệm thức

Hình 3. 10. Biểu đồ so
sánh trung bình tế bào
bám dính ở 6 nghiệm thức

3.2.2. Nuôi cấy tăng sinh tế bào tiền thân nội mô ứng viên
Quần thể tế bào tiền thân nội mô ứng viên trong nghiệm thức F được
sử dụng để nuôi cấy tăng sinh, phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Tốc độ
tăng sinh của tế bào ứng viên trong nuôi cấy thứ cấp là tương đối giống nhau
giữa các lần cấy chuyền và nhanh hơn so với quá trình nuôi cấy sơ cấp (sau
6 – 12 giờ cấy chuyền, tế bào đã bám lại), đồng thời, tốc độ tăng trưởng của
tế bào cũng nhanh hơn (có thể cấy chuyền lần tiếp theo sau 5 – 7 ngày).
3.2.3. Xác định đặc tính tế bào tiền thân nội mô

 

10
 


Theo kết quả nghiên cứu tế bào tiền thân nội mô ứng viên sau 3 lần
cấy chuyền biểu hiện âm tính với 2 marker CD45 (3,09%) và CD73 (6,47%),
âm tính hoàn toàn với 2 marker CD14 (1,06%) và CD90 (0,58%), đồng thời

 


Các tế bào hUCB-MSCs từ máu cuống rốn được thu nhận thành công
bằng phương pháp ly tâm đẳng tỷ trọng, chọn lọc qua kiểu hình, sự biểu hiện
các marker đặc trưng cho tế bào gốc trung mô và khả năng biệt hóa thành các
tế bào mỡ (hình 3.11, hình 3.12, hình 3.13).


 

Hình 3. 11. Quần thể tế bào gốc trung

Hình 3.13. Tế bào đối chứng

mô ứng viên sau 21 ngày nuôi cấy (a)

(a) và tế bào tạo mỡ sau 21

và sau 3 lần cấy chuyền (b)

ngày cảm ứng (b)

Hình 3. 12. Kết quả phân tích

Hình 3.14. Sự thay đổi kiểu hình

sự biểu hiện một số marker

của hUCB-MSCs khi được cảm


13
 


kháng thể kháng α-actin bằng kỹ thuật hóa tế bào miễn dịch huỳnh quang
(Immunocytochemistry_ICC) ở các ngày 0, 9, 18, 27 và 36 sau khi cảm ứng
biệt hóa (hình 3.16).
3.3.5. Khả năng co đập của các tế bào được cảm ứng biệt hóa
Tuy các tế bào được biệt hóa biểu hiện các gen và protein chuyên
biệt cho tế bào cơ tim nhưng chúng không co đập một cách ngẫu nhiên.
Hình 3.16. Sự biểu hiện αactin theo thời gian cảm ứng
biệt hóa. Kết quả nhuộm miễn
dịch huỳnh quang các tế bào
cảm ứng biểu hiện marker cơ
tim đặc trưng α-actin, vào ngày
18 ở nhóm 5-AZC+HE và vào
ngày 27 ở nhóm 5-AZC (màu
đỏ). Nhân được nhuộm màu với
Hoechst 33342 (màu xanh).
Nhóm đối chứng không biểu
hiện α-actin. Thước đo 50 µm.
BÀN LUẬN
Kết quả cho thấy UCB-MSCs có thể được biệt hóa thành các tế bào
giống cơ tim bằng cách chỉ bổ sung 5-AZC hay kết hợp 5-AZC với dịch chiết
tim thai chuột (HE). Tuy nhiên, sự biệt hóa tế bào xảy ra sớm hơn ở nhóm 5AZC+HE. Cụ thể, sau khi cảm ứng chỉ bởi 5-AZC, các tế bào bắt đầu biểu
hiện gen và protein đặc hiệu cho cơ tim vào ngày 27 so với ngày 18 ở nhóm
5-AZC + HE. Như đã biết, các tế bào gốc trưởng thành được duy trì ở trạng
thái không hoạt động. Chúng tham gia vào quá trình tự làm mới và chỉ biệt
hóa khi được cảm ứng bởi các tác nhân thích hợp. Việc giảm quá trình acetyl

Các tế bào gốc trung mô được biệt hóa trong môi trường có chứa 5AZC theo phương pháp biệt hóa đã đề cập ở chương 2. Các tế bào cảm ứng
sau biệt hóa đều biểu hiện 2 marker đặc hiệu cho tế bào cơ tim như α-actin
và Troponin T (Hình 3.17).


 

15
 


Hình 3. 17. Kết quả nhuộm hóa
tế bào miễn dịch huỳnh quang
các tế bào được cảm ứng biệt
hóa
3.4.2. Tỉ lệ sống
Sau 14 ngày theo dõi, tất cả chuột ở các nhóm đều còn sống. Tỉ lệ
sống được ghi nhận 100%. Tuy nhiên, các con chuột ở nhóm tiêm PBS có
biểu hiện xù lông, gập người lại và suy yếu dần theo thời gian. Ngày 19 sau
ghép, 2 con ở nhóm PBS chết. Không có trường hợp chuột chết ở các nhóm
được ghép tế bào vào ngày 19. Các con chuột này biểu hiện linh hoạt như
chuột nhóm bình thường và không bị xù lông.
3.4.3. Huyết áp trung bình (MAP)
Bảng 3.5. Huyết áp trung bình (MAP) của các nhóm chuột
Nhóm
Bình thường
Tiêm PBS
Ghép EPCs
Ghép CPCs
Ghép EPCs + CPCs

Nhóm

Tuần 0

Tuần 1

Tuần 2

Bình thường

0,0050

0,0057

0,0057

Tiêm PBS

0,0060

0,0077

0,0103

Ghép EPCs

0,0047

0,0057


Bình thường
Tiêm PBS
Ghép EPCs
Ghép CPs
Ghép EPCs + CPs

1 tuần sau thời điểm ghép
(tuần 1 – tuần 0)
0,0007
0,0017
0,001
0,0004
0,0007

2 tuần sau thời điểm ghép
(tuần 2 – tuần 0)
0,0007
0,150043
0,002
0,001
0,001

3.4.4. Kết quả phân tích mô học
Kết quả nhuộm H&E và kết quả nhuộm Trichrome
Kết quả nhuộm H&E và Trichrome cho thấy mô cơ tim chuột bình thường
không bị viêm, không tổn thương đứt gãy và không có vùng nào bị xơ hóa
(Hình 3.19) trong khi mô cơ tim chuột tiêm PBS bị tổn thương đứt gãy, thành
tim mỏng hơn so với chuột bình thường và hình thành vùng xơ hóa rộng
(Hình 3.20). Sau 14 ngày ghép, mô tim chuột được ghép tế bào không có
hiện tượng bị đứt gãy, mức độ xơ hoá thấp hơn so với mô tim chuột tiêm

thành một vùng nhiều tế bào có thể quan sát thấy qua hình 3.27. Các tế bào
CPs sau khi tiêm tồn tại trong mô ghép và bắt màu với cả Troponin T (xanh
lá) và alpha-actinin (đỏ) khi chồng lớp có màu vàng (Hình 3.28; 3.29). Các
tế bào này không hình thành mô sẹo mà cùng với các tế bào cơ tim địa
phương ngăn ngừa các tổn thương và đứt gãy mô tim.

 

18
 


Hình 3.24. Nhóm bình thường

Hình 3.25. Nhóm tiêm PBS

Hình 3.26. Nhóm ghép EPCs

Hình 3.27. Nhóm ghép CPs

Hình 3.28. Nhóm ghép EPCs+CPs Hình 3.29. CPs không biểu hiện
gen sinh u trong in vitro và in vivo


 

19
 



tiêm giả dược cho thấy được CDCs có tác động ngăn ngừa sự huỷ hoại cơ
tim tiếp tục ở tim bị nhồi máu.
Kết quả lượng Troponin I thấp ở các nhóm chuột được ghép tế bào
so với nhóm tiêm giả dược phù hợp với kết quả nhuộm H&E và nhuộm
Trichrome. Kết quả thu nhận được cho thấy sau 14 ngày cấy ghép, mô tim

 

20
 


của chuột được ghép tế bào không bị mỏng đi do mất tế bào như ở mô tim
chuột nhóm PBS. Kết quả nhuộm Trichrome cũng không phát hiện thấy sự
hình thành sẹo ở mô tim nhóm ghép CPs, vùng sẹo rất nhỏ ở nhóm ghép
EPCs và nhóm ghép EPC + CPs trong khi một vùng sẹo lớn được hình thành
ở mô tim nhóm PBS. Kết quả này có thể do tác động của EPCs thông qua
con đường tín hiệu VEGF-PI3K/Akt-eNOS làm tăng mật độ mao mạch và
giảm sự hình thành xơ hay EPCs giúp giảm sự hình thành mạch bạch huyết
trong vùng nhồi máu dẫn đến giảm viêm, giảm tổn thương tế bào cơ tim và
EPCs được ghép có thể góp phần huy động EPCs nội sinh. Thêm vào đó, vai
trò của CPs cũng rất quan trọng trong việc phục hồi cấu trúc và chức năng
tim bị tổn thương do thiếu máu. Chúng có thể tiết ra các yếu tố tạo mạch như
VEGF, HGF, FGF và yếu tố huy động tế bào gốc nội sinh như SDF-1, SCF
[10], hay tiết các phân tử giảm sự hoạt hoá bạch cầu trung tính như JAM-A
(Junction Adhension Molecule-A), tiết Exosomes ức chế quá trình apoptosis,
thúc đẩy sự tạo mới các tế bào cơ tim, tăng cường sự hình thành mạch. Các
tế bào tiền thân cơ tim cũng có khả năng biệt hoá thành các tế bào cơ tim và
hình thành mối nối điện giữa tế bào ghép với tế bào địa phương tương tự như
nghiên cứu ghép tế bào cơ tim được biệt hoá từ tế bào gốc phôi người trên

được ghép. Điều này có thể do sự biểu hiện gen của chúng đã bị biến đổi
trong quá trình biệt hóa theo hướng không sinh ung. Kết quả này tương tự
như kết quả trước đó của Huber và cộng sự khi ghép hESC-CMs vào mô tim
chuột nhồi máu. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của Huber việc ghép hESCCM vào tim bị tổn thương sau nhồi máu đã không dẫn đến việc tạo ra các u
quái, chứ không phải các tế bào ghép sống sót, tăng sinh, và tích hợp với mô
tim ghép trong khi việc ghép CPs cho thấy các tế bào này tồn tại và có xu
hướng tích hợp với các tế bào ở mô tim ghép. Điều này có thể do nguồn gốc
tế bào được biệt hóa khác nhau, thời gian theo dõi đánh giá khác nhau và quá
trình biệt hóa tế bào khác nhau. Qua đó có thể thấy các tế bào tiền thân cơ
tim sau khi được ghép không những tác động tích cực đến hiệu quả điều trị
thông qua việc tồn tại, cùng tích hợp với các tế bào cơ tim nội tại để hoạt
động mà chúng còn có thể thông qua các cơ chế khác như tiết ra các yếu tố
cận tiết, huy động các tế bào gốc nội tại hoạt động. Như vậy, việc ghép tế
bào EPCs, CPs cho thấy là một phương pháp tốt trong việc giảm khả năng
tạo sẹo và giúp cải thiện mô tim bị nhồi máu.
Hạn chế của đề tài nghiên cứu
Do điều kiện hiện tại của Phòng thí nghiệm chưa có thiết bị chuyên
dụng để đo điện tâm đồ, siêu âm tim chuột nên các kết quả đánh giá về mặt
chức năng tim bị hạn chế. Giới hạn về mặt thời gian khi thực hiện đề tài làm
cho việc đánh giá sau ghép tế bào chỉ được trong khoảng 14 ngày, thời gian
theo dõi này nên được kéo dài hơn để có thể quan sát rõ hơn tác động của tế
bào cấy ghép. Ngoài ra, các nghiên cứu sâu hơn về vai trò cũng như số phận
các tế bào sau cấy ghép do điều kiện khách quan nên cũng chưa được thực
hiện như khả năng hình thành mạch của EPCs, khả năng cận tiết của CPs,

 

22
 


và ở nhóm 5-AZC vào ngày 27. Các tế bào được biệt hoá không co đập một
cách tự phát.
5. Sau 14 ngày, 3 nhóm chuột EPCs, CPs và EPCs+CPs được ghép tế bào
lần lượt có mức độ giảm huyết áp thấp hơn so với chuột mô hình được tiêm
giả dược là 2,6 mmHg, 2,07 mmHg và 2,1 mmHg so với 7,6 mmHg.

 

23