Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
GVHD: Lại Đình Biên
BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐH CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TPHCM
KHOA CNSH & KTMT
BỘ MÔN : SINH HỌC PHÂN TỬ
ĐỀ TÀI: ỨNG DỤNG KỸ THUẬT PCR TRONG
CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN GÂY BỆNH LAO
(MYCOBACTERIUM TUBERCULOSIS)
GVHD: LẠI ĐÌNH BIÊN
LỚP:13CDSH
TỔ: 15
SVTH:
1.Nguyễn Thị Trúc Lan
2.Võ Thị Hồng Nhung
3 Nguyễn Lê Anh Thư
4.Nguyễn Thị Thúy Vi
5. Biện Như Phương Nam
6. Lê Lý Bảo Trân
MSSV
3008130050
3008130064
3008130118
3008130080
3008130122
3008140443
1.1.Giới thiệu về vi khuẩn lao....................................................................................2
1.2. Hình thể, cấu tạo và kích thước..........................................................................2
1.3.Phân loại...............................................................................................................3
1.4. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn lao........................................................4
1.4.1. Vi khuẩn lao có khả năng tồn tại lâu ở môi trường bên ngoài.......................4
1.4.2. Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí và đòi hỏi mức độ cao của oxi..........4
1.4.3. Vi khuẩn lao sinh sản chậm............................................................................5
1.4.4. Vi khuẩn lao có nhiều quần thể chuyển hóa khác nhau ở tổn thương...........5
1.4.5. Các chất độc liên quan đến tính độc của vi khuẩn lao...................................5
1.5. Sức đề kháng của vi khuẩn.................................................................................5
PHẦN 2. BỆNH LAO................................................................................................6
2.1.Đặc điểm của bệnh lao.........................................................................................6
2.2.Triệu chứng của bệnh lao.....................................................................................7
2.3. Phương thức lây truyền.......................................................................................7
PHẦN 3. PHƯƠNG PHÁP PCR...............................................................................8
3.1.Khái niệm.............................................................................................................8
3.2. Nguyên tắc của phương pháp PCR.....................................................................8
3.3.Thưc nghiệm.........................................................................................................8
3.4.Các điều kiện của phản ứng PCR........................................................................10
3.4.1.DNA khuôn (templat)......................................................................................10
3.4.2.Enzyme.............................................................................................................10
3.4.3. Mồi và nhiệt độ lai..........................................................................................11
3.4.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR........................................................11
3.4.5 Số lượng của chu kì phản ứng PCR.................................................................12
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
Hình 1. Vi khuẩn mycobarterium tuberculosis ..........................................................2
Hình 2. Vách tế bào vi khuẩn lao................................................................................3
Hình 3.thống kê các quốc gia có tỉ lệ người mắc lao cao...........................................6
Hình 4. Nguyên tắc của phương pháp PCR ...............................................................9
Hình 5. Máy nhân gen PCR.........................................................................................12
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
GVHD: Lại Đình Biên
ĐẶT VẤN ĐỀ
Lao là một bệnh nhiễm khuẩn do vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis gây
nên. Bệnh lao tồn tại cùng loài người hơn sáu ngàn năm. Trên thế giới, không một quốc
gia nào, một dân tộc nào mà không có người bị nhiễm vi khuẩn lao, bị mắc bệnh lao và
chết vì lao.
Ngày nay, bệnh lao trở lại cùng với đại dịch HIV/AIDS, nó trở thành một trong những
căn nguyên gây bệnh và gây tử vong lớn nhất ở người. Hiện nay lao là bệnh nhiễm khuẩn
chính và thường gặp nhất, ảnh hưởng đến 2 tỉ người tức 1/3 dân số, với 9 triệu ca mới mỗi
năm, gây 2 triệu người tử vong, hầu hết ở các nước đang phát triển.
Ở Việt Nam, bệnh lao vẫn là một bệnh truyền nhiễm nặng nề, Việt Nam đứng thứ
12 trong số 22 nước có số người mắc lao cao nhất thế giới. Hàng năm ước tính có thêm
180.000 bệnh nhân lao, trong đó có khoảng 6000 bệnh nhân lao đa kháng thuốc và
khoảng 7400 bệnh nhân lao/HIV.
Để bệnh lao dần được kiểm soát điều quan trọng là phát hiện được nhiều nhất số
người mắc lao trong cộng đồng và điều trị khỏi cho họ để giảm dần nguồn lây nhiễm..
Hiện nay, vi khuẩn lao được phát hiện bằng nhiều phương pháp khác nhau như xét
nghiệm đờm (nhuộm Ziehl-Neelsen), xét nghiệm hình ảnh (X-quang), phản ứng
tuberculin hay soi phế quản. Tuy nhiên, những phương pháp này vẫn tồn tại một số mặt
vẫn giữ màu nhuộm sau khi bị xử lý với dung dịch acid, vì vậy nó được phân loại là "trực
khuẩn kháng acid"
1.2.
Hình 1. Vi khuẩn Mycobacterium tuberculosis
Hình thể, cấu tạo và kích thước
Tế bào vi khuẩn lao có hình que, thẳng hoặc hơi cong, mảnh, nhỏ, chiều dài từ 3µm
đến 5µm, rộng 0,3µm – 0,5µm. Vi khuẩn không có lông, nha bào và vỏ.
Vi khuẩn có hai đầu tròn, thân có hạt, đứng thành từng đám lớn rất khó phân biệt
từng con vi khuẩn.
Sinh viên thực hiện: Tổ 15
Trang 8
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
-
GVHD: Lại Đình Biên
Cấu tạo vi khuẩn lao gồm:
Lipit (lớp sáp): Chiếm 40% trọng lượng khô, các chất lipit có mối liên hệ chặt chẽ với cấu
trúc vách tế bào làm cho vi khuẩn có tính kháng acid. Đây là đặc điểm cấu tạo của trực
khuẩn lao khác với các vi khuẩn khác. Lớp sáp đã được phân tích có nhiều yếu tố, có yếu
-
Nhiệt độ
Thời gian
Khả năng
khuẩn lạc
phát triển
mọc khuẩn
gây bệnh
thích hợp
lạc
Xù xì, màu kem
37 oC
30 ngày
Lao người
Xù xì, mỏng,
37 oC
800C; với cồn 900 vi khuẩn tồn tại được ba phút, trong acid phenic 5% vi khuẩn chỉ sống
được một phút.
1.4.2. Vi khuẩn lao là loại vi khuẩn hiếu khí và đòi hỏi mức độ cao của oxy
Khi phát triển vi khuẩn cần đủ oxy, vì vậy giải thích tại sao lao phổi là thể bệnh
gặp nhiều nhất và số lượng vi khuẩn nhiều nhất trong các hang lao có phế quản thông.
1.4.3. Vi khuẩn lao sinh sản chậm
Sinh viên thực hiện: Tổ 15
Trang 10
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
GVHD: Lại Đình Biên
Trong điều kiện bình thường, trung bình 20 – 24 giờ/1lần, nhưng có khi hàng
tháng, thậm chí “nằm vùng” ở tổn thương rất lâu, khi gặp điều kiện thuận lợi chúng có thể
tái lại.
Ngoài ra còn có hình thức sinh sản giống nấm: 2 vi khuẩn tạo ra cầu khuẩn để tạo vi
khuẩn mới.
1.4.4. Vi khuẩn lao có nhiều quần thể chuyển hoá khác nhau ở tổn thương
Có những quần thể vi khuẩn phát triển mạnh, nằm ngoài tế bào, có những quần thể
vi khuẩn phát triển chậm, từng đợt, có những vi khuẩn nằm trong tế bào. Những quần thể
vi khuẩn này chịu tác dụng khác nhau tuỳ từng thuốc chống lao.
1.4.5. Các chất liên quan đến tính độc của vi khuẩn lao
Mặc dù đã biết vi khuẩn lao hàng trăm năm, nhưng tính chất gây độc của M.
tuberculosis còn nhiều điều chưa được sáng tỏ, chúng không có các độc tố chủ yếu gây
bệnh như nhiều vi khuẩn khác. Nhiều chất từ M. tuberculosis đã được chứng minh là
tham gia vào độc tính vi khuẩn, nhưng không thật sự có yếu tố nào là chủ yếu hay quyết
Bệnh lao phổi là một bệnh truyền nhiễm, do vi khuẩn lao (Mycobacterium
tuberculosis). Ngoài ra còn phân lập được một số Mycobacteria khác như M. bovis…
Lao phổi là bệnh lao thường gặp nhất, chiếm tới 80% trong tổng số bệnh lao. Lao phổi là
thể lao gây lây nhiễm cho người khác.
Bệnh rất dễ lây từ người sang người do lây bằng đường hô hấp. Khả năng lây mạnh
trong thời gian chưa được điều trị. Cứ 1 người bị lao phổi có ho khạc ra vi khuẩn có thể
lây cho 10-15 người khác, nhất là trong các quần thể dân cư nhỏ như gia đình, lớp học,...
trước khi người bệnh được điều trị. Khi đã được điều trị bằng thuốc chống lao, khả năng
lây bệnh rất thấp.
Bệnh lao là một bệnh xã hội: Nhiều người mắc, tỷ lệ tử vong cao có ở mọi nơi trên
thế giới. Bệnh lao tăng hay giảm phụ thuộc vào nền kinh tế xã hội, chế độ xã hội, mức
sống, các hiện tượng xã hội như thiên tai, chiến tranh, những nước có nhiều người nhiễm
HIV…
Hình 3. Thống kê các quốc gia có tỉ lệ người mắc lao cao
Bệnh lao là một bệnh diễn biến qua 2 giai đoạn:
Sinh viên thực hiện: Tổ 15
Trang 12
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
•
GVHD: Lại Đình Biên
Giai đoạn lao nhiễm: Là lần đầu tiên vi khuẩn lao xâm nhập vào cơ thể chủ yếu theo
đường hô hấp vào tận phế nang gây tổn thương viêm phế nang. Sau khoảng 3 tuần đến
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
GVHD: Lại Đình Biên
PHẦN 3. PHƯƠNG PHÁP PCR
3.1. Khái niệm chung:
Kỹ thuật PCR (phản ứng chuỗi trùng hợp- polymerase Chain Reaction) là phương
pháp in vitro để nhân bản nhanh một đoạn DNA nào đó, có độ nhạy rất cao, mà chỉ cần
một khối lượng mẫu ban đầu hạn chế.
3.2. Nguyên tắc của phương pháp PCR
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch DNA mới từ mạch
khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn DNA ngắn,
có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn, và DNA polymerase sẽ nối dài
mồi để hình thành mạch mới. Phương pháp PCR đã được hình thành dựa vào đặc tính đó
của các DNA polymerase. Thật vậy, nếu ta cung cấp hai mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung
với hai đầu của một trình tự DNA, ta sẽ chỉ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi. Điều
đó có nghĩa là để khuếch đại một trình tự DNA xác định, ta phải có thông tin tối thiểu về
trình tự đó đủ để tạo các mồi bổ sung chuyên biệt; các mồi này gồm một mồi xuôi (sens
primer) và một mồi ngược (anti sens primer). Từ “xuôi” và “ngược” phải hiểu là “xuôi”
và “ngược” so với chiều phiên mã của gen.
3.3. Thực nghiệm
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ (cycle) nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3
bước:
Bước 1: Trong một dung dịch phản ứng bao gồm các thành phần cần thiết cho sự sao
chép, phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn Tm của phân tử, thường là ở 94-
Trang 15
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
GVHD: Lại Đình Biên
Muốn tiến hành phản ứng PCR cần có các thành phần sau:
-
DNA khuôn.
Mồi.
DNA polymerase.
Các deoxyribonucleotide triphosphat (dNTP ).
Dung dịch đệm (buffer).
3.4.1. DNA khuôn (template)
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kỹ thuật
chuẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào.
Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có khuynh hướng giảm ( 1micro gam xuống còn 100 ng)
với việc sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao. Hơn nữa, việc giảm lượng mẫu ban
đầu còn hạn chế được các khuếch đại “ ký sinh” tạo những sản phẩm phụ không mong
muốn. Một ưu điểm lớn khác của phương pháp PCR là cho phép khuếch đại cả những
mẫu DNA không được bảo quản tốt, đã bị phân hủy từng phần như trong các vết máu để
lâu ngày, tinh dịch đã khô, hóa thạch, tóc , móng tay của người đã chết…
3.4.2. Enzyme
Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase1. Vì đây là
enzyme không chịu nhiệt nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp ( phải them enzyme mới
vào phản ứng sau mỗi lần biến tính vì enzyme cũ đã bị nhiệt phân hủy, nhiệt độ lại thấp
sự hiện diện của DNA khuôn và ion Mg++ , Tth pol lại xúc tác phản ứng khuếch đại DNA.
Enzyme này cho phép khuếch đại bản mẫu là RNA thông qua sự hình thành cDNA.
3.4.3. Mồi và nhiệt độ lai
Mồi là chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được một sự khuếch đại đặc trưng và có hiệu
quả cao. Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phương pháp PCR, và phải tuân thủ
một số nguyên tắc:
-
Trình tự của mồi được chọn sau cho không thể có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi “ xuôi” và
mồi “ ngược”, và cũng không có những cấu trúc “kẹp tóc” do sự bắt cặp bổ sung giữa các
-
phần khác nhau của một mồi.
Tm của mồi xuôi và mồi ngược không cách biệt quá xa. Thành phần nucleotide của các
-
mồi cân bằng tránh các cặp GC lặp đi lặp lại nhiều lần.
Các mồi chọn phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình
tự lặp lại trên gen.
3.4.4. Các thành phần khác của phản ứng PCR
Bốn loại nucleotide thường được sử dụng ở nồng độ là 20-200 micro mol / mỗi loại
nucleotide. Nông độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại “ký sinh”. Sự mất cân bằng trong
thành phần các nucleotide lại làm tăng các lỗi sao chép của polymerase.
Nồng độ ion Mg++ cũng là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến hiệu quả và tính đặc
hiệu của quá trình PCR. Không có một quy luật chung cho vấn đề này. Nồng độ tối ưu
phải được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nhưng thông thường, nồng
Sinh viên thực hiện: Tổ 15
Sinh viên thực hiện: Tổ 15
Trang 18
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
GVHD: Lại Đình Biên
Ống nghiệm dùng của một nghiên cứu phải cùng một kiểu vì đặc tính truyền nhiệt
của các ống cũng như nhiệt độ tiếp xúc giữa các ống và bộ phận tỏa nhiệt của thiết bị có
ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại.
3.6. Ưu điểm và hạn chế của kỹ thuất PCR
3.6.1. Ưu điểm
•
Thời gian thực hiện cực nhanh: chỉ cần mất 3 giờ để khuếch đại 1 trình tự DNA được
quan tâm, so với phương pháp tạo dòng của kỹ thuậ tái tổ hợp DNA phải mất cả tuần
hoặc lâu hơn.
• Đơn giản và ít tốn kém :Nó được thực hiện trong ống nghiệm plastic nhỏ gồm các thành
phần tối thiểu được sử dụng đồng thời .
• Độ tin sạch của mẫu không cần cao: PCR có thể thực hiện với các mẫu nucleic acid thô.
• PCR có thể giúp phân biệt được gen đột biến do mất đoạn, them đoạn hay đột biến điểm.
• Dùng để định lương so sánh bằng cách cho tiến hành khuếch đại đồng thời trình tự đích
và một trình tự chứng có nồng độ đã biết.
Nhờ các ưu thế trên, PCR đã hấp dẫn các nhà nghiên cứu ngay từ lúc ra đời trong
việc khuếch đại các trình tự nucleic acid đặc hiệu và chẩn đoán phân tử.
cho đủ với 1, 2 làn thao tác.
Ngoài ra, các hang sản xuất còn tung ra thị trường nhiều hệ thống cho phép loại bỏ
hoàn toàn sự ngoại nhiễm.
-
Sự nhân bản không đặc hiệu: xảy ra khi mồi bắt cặp không đặc hiệu với những trình tự
khác với trình tự đích.Một số phương pháp được sử dụng để hạn chế vấn đề này:
Phương pháp “ hot start” với đặc điểm chủ yếu là tránh sự tiếp xúc của các thành phần
quan trọng trong phản ứng trước khi trình tự đích được biến tính hoàn toàn.
Phương pháp nested PCR ( PCR “tổ” ) sử dụng them một cặp mồi thứ hai được thiết kế để
bắt cặp trên sản phẩm nhân bản từ cặp mồi thứ nhất. Phương pháp này tăng độ nhạy và độ
đặc hiệu nhưng đồng thời cũng làm tăng khả năng ngoại nhiễm của phản ứng.
-
Các sai sót gây ra do Taq polymerase: sự sao chép bởi Taq polymerase cho tỷ lệ sai khá
cao ( 10-4, nghĩa là cứ 10000 nucleotide thì enzyme gắn sai một nucleotide). Đặc tính này
không quan trọng nếu ta chỉ cần xem xét kích thướt hay sự có mặt một sản phẩm khuếch
đại nhưng có ý nghĩa lớn nếu cần xác định chính xác trình tự nucleotide DNA. Ta không
thể loại bỏ hoàn toàn các sai sót này mà chỉ có thể giảm bớt.
3.7. Ứng dụng của phương pháp PCR
•
•
Việc sản xuất mẫu dò dùng trong các phương pháp lai phân tử.
Khuếch đại số lượng các RNA thông qua kỹ thuật RT-PCR ( phiên mã ngược tạo cDNA
với muối phosphate-buffered (10 mM phosphate buffer [pH 7.2], 150 mM NaCl). Tế bào,
106, được ly tâm 9000 vòng trong 15 phút, và được ủ trong 100 µl buffer phân giải
(50mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM KCl, 2.5 mM MgCl 2, 0.45% Tween 20, 0.45% Nonidet
P-40) có chứa 100µg enzyme proteinase K trên mỗi ml ở 56 oC trong 3h và sau đó nâng
nhiệt độ biến tính ở 95oC trong 10 phút.
Tất cả các mẫu được phân tích với 1 cặp primer (PCO4-GH20) khuếch đại 1 vùng
của gene β-globin, với sự biến đổi như sau: các phản ứng PCR được thực hiện với thể tích
cuối là 25 µl chứa 1.5 mM MgCl2 và 12.5 µl dung dịch dung giải mẫu. Tiến trình này cho
phép sự định lượng toàn bộ DNA tế bào và sự có mặt của tác nhân ức chế của Taq
polymerase. Sự khuếch đại được tiến hành như đã được mô tả, sử dụng kỹ thuật khởi
động nóng. Phản ứng phát hiện 1 vùng 123-bp từ trình tự chèn IS 6110 là phức hợp
chuyên biệt của M. tuberculosis. PCR được thực hiện trong 1 chu kỳ nhiệt DNA ( PerkinElmer Cetus, Norwalk, Conn). Phản ứng khuếch đại được thực hiện với thể tích 25 µl
Sinh viên thực hiện: Tổ 15
Trang 21
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
GVHD: Lại Đình Biên
chứa 10 mM Tris-HCl (pH 8.3), 50 mM KCl, 1.5 mM MgCl 2, 0.01% gelatin, 0.2 mM mỗi
deoxynucleoside triphosphate, primers (1mM mỗi loại), và 100000 PBMC.
Sau khi hỗn hợp phản ứng đạt 82oC, 0.625 unit Taq pol được thêm vào. Sau đó
mẫu được biến tính ở 94oC trong khoảng 5 phút, và thực hiện 30 chu kỳ khuếch đại với
quy trình như sau: biến tính ở 94oC trong 2 phút, bắt cặp ở 68oC trong 2 phút, và kéo dài
với mồi ở 72oC trong 2 phút. Thời gian kéo dài được tăng thêm 5s với mỗi chu kỳ tiếp
theo.
Sau khi khuếch đại, 10µl hỗn hợp phản ứng được điện di trong ethidium bromidecó chứa 2% gel agarose và quan sát bằng tia UV. DNA được chuyển qua màng nylon
Do những ưu điểm tuyệt đối trong nghiên cứu sinh học phân tử, kỹ thuật PCR được
nhanh chóng áp dụng rộng rãi để chuẩn đoán các bệnh về virus, vi khuẩn, các bệnh ký
sinh trùng và cho kết quả rất chính xác.
Việc sử dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn lao Mycobacterium
tuberculosis sẽ nhanh và chính xác hơn so với các phương pháp khác đưa ra hướng điều
trị bệnh thích hợp góp phần làm giảm sự lây lan của vi khuẩn lao. Phát hiện và điều trị
sớm sẽ giảm tỉ lệ tử vong ở các nước.
Sinh viên thực hiện: Tổ 15
Trang 23
Ứng dụng kỹ thuật PCR trong chẩn đoán vi khuẩn
gây bệnh lao (Mycobacterium tuberculosis)
GVHD: Lại Đình Biên
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1.
2.
3.
4.
5.
Hồ Huỳnh Thùy Dương, Sinh học phân tử, Nhà xuất bản giáo dục
/> /> /> />
Sinh viên thực hiện: Tổ 15
Trang 24
Copyright: Tài liệu đại học ©