Kỹ thuật PCR trong chẩn đoán lao
KỸ THUẬT PHẢN ỨNG CHUỖI POLYMERASE (PCR)
PHÁT HIỆN M. TUBERCULOSIS TRỰC TIẾP TRONG MẪU BỆNH PHẨM
Kỹ thuật PCR cho phép xác định tác nhân gây bệnh trực tiếp trong bệnh phẩm nhờ khả năng nhận biết và
sao chép để khuyếch đại về mặt số lượng đoạn trình tự đặc hiệu trên genom của vi khuẩn. Đối với
M.tuberculosis, kỹ thuật PCR phát hiện trình tự 249 đôi bazơ nằm trên đoạn IS 6110, là trình tự gắn (IS-
insert sequence) đặc hiệu và có khả năng tự sao chép với số lượng lớn (1-25 lần) trong genome vi khuẩn
thuộc nhóm M.tuberculosis (M.tuberculosis, M.microti, M.bovis và M.africanum).
Quá trình sao chép được thực hiện trong một chu trình nhiệt lặp lại với sự tham gia của enzyme chịu nhiệu
Taq polymerase có bản chất là ADN polymeraza, các deoxynucleotide triphosphat tự do (dATP, dTTP,
dGTP, dCTP) và cặp đoạn mồi đặc hiệu cho đoạn trình tự định sao chép.
Sản phẩm PCR được phát hiện bằng kỹ thuật điện di trên gen agarosa hoặc các kỹ thuật lai ghép miễn dịch
khác như lai ghép Dot plot (dot blot hybridzation), lai ghép Southern blot hoặc lai ghép với cơ chất trên
phiến nhựa, v.v.
I. CÁC THÔNG TIN CHUNG CẦN BIẾT VỀ PCR
I.1. Nguyên lý của PCR
PCR là kỹ thuật khuyếch đại số lượng ADN dựa trên trình tự ADN khuôn mẫu với quy trình tiến hành
gồm 3 giai đoạn: biến tính, gắn mồi và tổng hợp kéo dài với sự trợ giúp của ADN polymerase chịu nhiệt,
primers và deoxy-nucleotide triphosphates (dNTPs)
I.2. Thông số chu kỳ PCR
PCR được thực hiện với các chu trình ủ bệnh phẩm đã xử lý ở 3 nhiệt độ khác nhau tương ứng với 3 giai
đoạn cần thiết cho việc tổng hợp ADN. Mỗi chu kỳ bao gồm 3 giai đoạn: Biến tính ở 90-95
0
C, gắn mồi ở
40-65
0
C và tổng hợp kéo dài ở 70-75
0
C. Tuỳ theo nồng độ ADN đích có trong bệnh phẩm mà xác định số
lượng chu kỳ cần thực hiện, số lượng trình tự khuyếch đại càng nhiều nếu số chu kỳ càng tăng.
I.3. Các bước cần thiết để tránh nhiễm với M.tuberculosis hoặc sản phẩm PCR (amplicon) từ đợt

Thành phần
Trình
tự cho vào
Số lượng (ul) cho
tổng 50ul/ống
Nồng độ cuối cùng
Nước cất 2 lần Milli Q
Đệm phản ứng (10x)
Tris 100mM, pH 8,3
NaCl 500 mM
Gelatin 0,1% (w/v)
MgCl2 25mM
dNTP (hỗn hợp)
- dATP 20mM
- dCTP 20mM
- dGTP 20mM
- dUTP 20mM
Mồi: 50uM 330ug/ml
Ampli Taq polymerasa
Uracil-ADN-glycosylase
(UDG) 1U/ul
Bệnh phẩm, ADN hoặc TE
(a)
(b)
(c)
(d)
(e)
(g)
(h)
(i)

Bước 3: Bất hoạt 100
OC
trong 10 phút
II.3. Tách ADN của vi khuẩn lao trong bệnh phẩm (Phương pháp BOOM)
Bước 1: Phá tế bào giải phóng ADN
Cho 0,9ml dung dịch ly giải tế bào L6 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH 6.4, 22ml 0.2M EDTA
pH 8.0 và 2.6 ml Triton X 100) và 20ml diatom 20% vào mỗi bệnh phẩm
Lắc kỹ bằng máy lắc trong ít nhất 10phút
Ly tâm, lấy cặn
Bước 2: Tinh sạch ADN
Rửa 2 lần bằng dung dịch L2 (120g GuSCN, 100ml 0.1 M Tris-HCl pH 6.4)
Rửa 2 lần bằng Ethanol 70%
Rửa 1 lần bằng acetone
Phơi khô trong bể nước 56
oC
(10-15 phút )
Bước 3: Thu hồi ADN
Cho 70ml TE (10 mM Tris-HCl pH 8.0, 1mM EDTA) vào mỗi mẫu, ủ 56
0
C, 10 phút .
Lắc kỹ, ly tâm 12000 vòng / 2 phút
Tách nước nổi chứa ADN và sử dụng để chạy PCR
II.4. Cho mẫu vào ống phản ứng PCR
Dung dịch có chứa ADN sau khi được tách từ bệnh phẩm được cho vào ống phản ứng đã chứa sẵn 35 ul
hỗn dịch mix. Mỗi bệnh phẩm cần có hai ống phản ứng (ống a và ống b). ống a sử dụng để chạy phản ứng
với bệnh phẩm, ống b dùng để kiểm tra chất ức chế nếu có trong bệnh phẩm. ống b ngoài ADN tách từ
bệnh phẩm còn được cho thêm ADN của M.smegmatis đã được biễn đổi bằng gắn thêm một đoạn trình tự
IS6110. Cặp mồi Pt18 và INS2 có khả năng khuyếch đại trình tự 249 đôi bazỏ trên IS 6110 của M.
tuberculosis, và khuyếch đại cả trình tự 305 đôi bazơ trên IS6110 của M. smegmatis.
- ống a: 10ml d

III. CHUẨN BỊ HOÁ CHẤT, DUNG DỊCH CẦN THIẾT CHO PCR CHẨN ĐOÁN LAO
Dung dịch TTE: 1% Triton X 100 pha trong 20mM Tris-HCl pH=8,3 + 1mM EDTA (bảo quản trong
đông lạnh); Hấp ướt khử trùng 121
0
C x 15 phút
Dung dịch TE: 10 mM Tris HCl + 1mM EDTA, pH 8,3; Hấp ướt khử trùng 120
0
C x 20 phút
Dung dịch xử lý đờm:
Dung dịch 1 ( NaOH 1M): 40 gr NaOH / 1 lít H
2
O
Dung dịch 2 (Na-citrate 0,1M): 29,4gr Na-citrate.2H
2
O/lit,
Dung dịch 3 (N-acetyl-L-cysteine-NALC): 15 mg trong 3ml dd 1+ dd 2
Hấp ướt khử trùng 120
0
C x 20phút đối với dung dịch 1 và 2
Dung dịch proteinase K: 5% Triton X-100, 1mg proteinase K hoà trong 1ml
20 mM Tris-HCl pH 8,3 + 1mM EDTA
Dung dịch phá vỡ tế bào và tách ADN :
Dung dịch L6: 120 gr Guaniginum thiocyanate GuSCN (Fluka, Thụy sỹ) pha trong 100ml 0,1M Tris HCl,
pH 6,4 + 22ml EDTA 0,2M và 2,6ml Triton X-100; hấp ướt khử trùng 120
0
Cx20 phút
Dung dịch rửa L2: 10 gr GuSCN /100ml Tris HCl 0,1M, pH 6,4; hấp ướt khử trùng 120
0
Cx20 phút
Hỗn dịch Diatom (celite): 10 gr pha trong 50ml H