1

TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
LỚP DH06SH

BÁO CÁO TIỂU LUẬN
CHẨN ĐOÁN BỆNH GIA SÚC VÀ GIA CẦM BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC PHÂN TỬ
ĐỀ TÀI
SỬ DỤNG PHƯƠNG PHÁP PCR ĐỂ
CHẨN ĐOÁN VI KHUẨN LAO
( Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium bovis)

Giáo viên hướng dẫn: PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI
Sinh viên thực hiện: NGÔ THỊ TÚ TRINH
MSSV: 06126169
Tháng 10/200
2



đến việc chẩn đoán vi khuẩn lao
(Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis) bằng kỹ thuật PCR.
3

II. TỔNG QUAN 1. Bệnh lao
1.1. Vi khuẩn lao
1.1.1. Mycobacterium tuberculosis

Hình 1: Mycobacterium tuberculosis

Phân loại
Giới: Bacteria
Ngành: Actinobacteria
Bộ: Actinomycetales
Phân bộ: Corynebacterineae
Họ: Mycobacteriaceae
Giống: Mycobacterium
Loài: M. tuberculosis
Mycobacterium tuberculosis (MTB), tác nhân gây bệnh lao, là vi khuẩn
hiếu khí. Vi khuẩn này phân chia mỗi 16 đến 20 giờ, rất chậm so với thời gian
phân chia tính bằng phút của các vi khuẩn khác (trong số các vi khuẩn phân
chia nhanh nhất là một chủng E. coli, có thể phân chia mỗi 20 phút). MTB
không được phân loại Gram dương hay Gram âm vì chúng không có đặc tính
hoá học này, mặc dù thành tế bào có chứa peptidoglycan. Trên mẫu nhuộm
Gram, nó nhuộ
m Gram dương rất yếu hoặc là không biểu hiện gì cả. Trực
khuẩn lao có hình dạng giống que nhỏ, có thể chịu đựng được chất sát khuẩn

và các bộ phận khác của cơ thể. Vi khuẩn này phân chia rất chậm, từ 16 đến 20
giờ, là vi khuẩn hiếu khí. Nó có liên hệ với M. tuberculosis.
1.2. Sức đề kháng của vi khuẩn
Vi khuẩn có sức đề kháng mạnh nhất là chỗ thiếu ánh sáng và được làm
khô. Trong phân gia súc, đờm, chỗ tối thì vi khuẩn có thể sống hàng tháng.
Ánh sáng mặt trời có khả năng làm mất độc lực vi khuẩn sau 8 giờ.
1.3. Phương thức lây truy
ền
Các loài động vật máu nóng, máu lạnh, gia súc, thú rừng, người đều có
thể mắc bệnh. Có thể xếp thứ tự cảm nhiễm như sau: người, bò, gà, heo, chó,
mèo, trâu. Vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể theo các con đường sau:
9 Đường hô hấp: phổ biến nhất là ở bò và người, mầm bệnh từ cơ thể bị
bệnh bài xuất ra ngoài qua đường hô hấp hay qua phân, mầm bệnh có
trong không khí, gia sú khỏe hít vào sẽ mắc bệnh.
9
Đường tiêu hóa: thông thường qua bú sữa, thức ăn, nước uống có mầm
bệnh.
9 Ngoài ra còn có thể lây lan qua núm nhau, đường sinh dục, đường phối
giống.
1.4. Triệu chứng
9 Nhóm lao phổi: ho khan, sau to hơn có âm ran, về sau ho ướt ho
có đờm, vật ốm, đờm lúc đầu loãng sau đặc dần có thể có mủ
máu. Thời gian sau là rối loạn hô hấp, thở hắt nhiều, niêm mạc
mũi có thể xuất huyết, phổi có âm ran ướ
t.
9 Nhóm lao hạch: hạch sưng cứng, bề mặt hạch không trơn, hạch
cứng lồi lõm, không di động được, các hạch dưới hàm, vai, hạch
vú, hạch trước vai đều bị sưng.
9 Nhóm lao vú: chủ yếu ở bò sữa năng suất cao, vú sưng, núm vú
bi biến dạng, nạch vú sưng to gồ ghề, sản lượng sữa giảm.

C trong
môi trường Herold (h).
2. Chẩn đoán vi khuẩn lao bằng phương pháp PCR ( Polymerase Chain
Reaction)
2.1. Phương pháp PCR
2.1.1. Định nghĩa
Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao các
đoạn DNA mà không qua tạo dòng. Phương pháp này được K.Mullis đưa ra
năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Phương pháp PCR được thực hiện
hoàn toàn trong các eppendoff và trong thời gian ngắn ta có thể thu nhận rất
nhiều bản sao DNA. Kỹ thuật PCR có thể được ứng dụng trong nhiều lĩnh v
ực:
chẩn đoán, xét nghiệm các tác nhân vi sinh vật gây bệnh, xác định giới tính của
phôi, giải mã di truyền, tạo giống mới với các đột biến định hướng, nghiên cứu
sự tiến hoá của sinh vật ở mức độ phân tử,….
2.1.2. Nguyên lý
Phản ứng chuỗi sử dụng enzyme polymerase hay còn gọi là PCR là một
phản ứng tổng hợp sợi DNA đơn dựa vào một sợi DNA đơn khác làm khuôn và
một
đoạn oligonucleotide làm mồi. Sợi DNA đơn được tổng hợp nên có trình
tự bổ trợ với sợi khuôn.
Các oligonucleotide dùng làm mồi cho enzyme DNA polymerase và sợi
biến tính của phân đoạn DNA lớn được dùng làm sợi khuôn. Kết quả là tổng
hợp các sợi DNA mới bổ trợ cho các sợi khuôn bố mẹ. Những sợi mới này có
đầu 5’ (chính là đầu 5’của mồi oligonucleotide), trong khi đó đầu 3’ thì chưa
xác định được độ dài.
Quá trình tổng hợ
p định hướng theo oligonucleotide của các sợi DNA
con có thể được nhắc lại nếu sợi kép mới được biến tính (bằng nhiệt) và mồi bổ
sung được phép gắn vào sợi khuôn (nhờ hạ xuống nhiệt độ thích hợp). Các

Thườ
ng hàm lượng khuôn DNA trong khoảng 0.01-1 ng đối với
plasmid hoặc DNA phage và 0.1-1 µg đối với DNA nhân bào, cho một phản
ứng tổng thể tích 50 µl. Hàm lượng khuôn DNA cao hơn thường tăng hiệu
suất thu hồi sản phẩm PCR không đặc hiệu, nhưng nếu độ tin cậy tổng hợp
là tới hạn, nên dùng hàm lượng khuôn DNA tối đa cho phép cùng với số
chu kỳ PCR giới hạn để tăng tỷ lệ sản phẩm PCR đặc hiệu.
2.1.3.2.
Mồi
9

Mồi là một phân đoạn nucleotide ngắn bổ trợ cho vùng DNA cần
được khuếch đại trong PCR. Mồi có thể đặc hiệu hoặc chung (universal) với
trình tự nucleotide đặc trưng. Mồi chung bổ trợ cho nhiều trình tự
nucleotide là một bộ phân tử DNA đặc trưng nào đó. Do đó, chúng có thể
liên kết rộng rãi với nhiều loại khuôn DNA.
Mồi là một trong các yếu tố quan trọng nhất quyết định sự thành
công củ
a PCR. Việc thiết kế mồi đặc hiệu và sử dụng nồng độ thích hợp sẽ
dẫn đến PCR có sản phẩm hay không. Tính bổ trợ hoàn chỉnh của 18nt hoặc
hơn là lý tưởng.
2.1.3.4. dNTP
Nồng độ mỗi loại dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) trong hỗn hợp
phản ứng thường là 200 µM. Một điều quan trọng là nồng độ mỗi loại
dNTP phải như nhau. Chỉ cần một dNTP nào đó chênh v
ề nồng độ có thể
gia tăng mức độ gắn nhầm nucleotide vào sản phẩm PCR, dẫn đến kết quả
trình tự có lỗi và sản phẩm biểu hiện có thể là một thể đột biến.
Nồng độ nucleotide cần không quá 50µM mỗi lọai, tuy nhiên sản
phẩm dài có thể cần nhiều hơn. Khi độ tin cậy tối đa của quy trình PCR là

2.1.3.6. Nồng độ Mg
2+

Nồng độ Mg
2+
ảnh hưởng tới bắt cặp mồi, T
m
của sợi khuôn, sản
phẩm và liên kết mồi-khuôn, tính đặc hiệu sản phẩm, hoạt tính enzyme và
tính chính xác. [Mg
2+
] ảnh hưởng tới sự bắt cặp oligo với khuôn DNA bằng
cách bền hóa với khuôn-mồi. Vì vậy nó cũng tăng sự bắt cặp không đặc
hiệu và tổng hợp các sản phẩm PCR không mong muốn (cho nhiều băng
trên gel). EDTA kẹp càng cua Mg
2+
có thể thay đổi [Mg
2+
].
Do ion Mg
2+
taọ ra các phức hợp với dNTP, mồi và khuôn DNA,
nồng độ tối thích của MgCl
2
được lựa chọn cho từng thí nghiệm. Quá ít ion
Mg
2+
cho hiệu suất thu nhận sản phẩm PCR thấp và quá nhiều ion tăng hiệu
suất thu các sản phẩm không đặc hiệu và tăng gắn nhầm. [Mg2+] thấp hơn
được mong muốn khi độ tin cậy tổng hợp DNA là tới hạn.

Nonidet P-40 hoặc Triton X-100.
Nồng độ muối KCl hoặc NaCl cao hơn 50 mM sẽ ức chế Taq pol,
nhưng lại cần thiết để tạo điều kiện dễ dàng bắt cặp mồi.
Một số enzyme không cần bổ sung protein, một số khác lại phụ
thuộc vào nó. Một số enzyme hoạt động tốt hơn v
ới sự có mặt của chất tẩy
rửa, có lẽ do nó ngăn cản xu hướng tự nhiên của enzyme liên kết với nhau.
2.1.4. Chu trình nhiệt
2.1.4.1. Biến tính
Thường biến tính 0.5-2 phút ở 94-95
o
C là đủ, do sản phẩm PCR được
tổng hợp ở chu kỳ khuếch đại thứ nhất ngắn hơn đáng kể so với khuôn DNA
ban đầu và được biến tính hoàn toàn dưới các điều kiện này. Nếu DNA khuếch
đại có hàm lượng GC rất cao, thời gian biến tính có thể được tăng lên 3-4 phút.
2.1.4.2. Gắn mồi
12

Thường nhiệt độ bắt cặp tối thích thấp hơn 5
o
C so với nhiệt độ nóng
chảy của sợi kép mồi-khuôn DNA. Thời gian gắn mồi kéo dài 0.5-2 phút là đủ.
Tuy nhiên, nếu sản phẩm PCR không đặc hiệu thu được ngoài sản phẩm mong
đợi, nhiệt độ bắt cặp phải được tối ưu bằng cách tăng từng bước 1-2
o
C.
2.1.4.3. Kéo dài
Thường bước kéo dài mồi (tổng hợp) được thực hiện ở 70-75
o
C. Tốc độ

với một phổ rộng bệnh nhân nhiễm lao, gồm cả bệnh nhân không bị nhiễm HIV
cũng như bị nhiễm HIV.
Phương pháp thực hiện
Lấy mẫu máu ở vùng ngoại biên cho vào tube có chứa sẵn dung dịch
chống đông tụ EDTA và phân tích mẫu. Toàn bộ mẫu trong tube được trải trên
dung dịch Ficol-Hypaque và ly tâm 400 vòng trong 30 phút ở nhiệt độ phòng.
Phần kết tủa được rửa 2 lần với muối phosphate-buffered (10 mM phosphate
buffer [pH 7.2], 150 mM NaCl). Tế bào, 10
6
, được ly tâm 9000 vòng trong 15
phút, và được ủ trong 100 µl buffer phân giải (50 mM Tris-HCl [pH 8], 50 mM
KCl, 2.5 mM MgCl
2
, 0.45% Tween 20, 0.45% Nonidet P-40) có chứa 100 µg
enzyme proteinase K trên mỗi ml ở 56
o
C trong 3h và sau đó nâng nhiệt độ biến
tính ở 95
o
C trong 10 phút.
Tất cả các mẫu được phân tích với 1 cặp primer (PCO4-GH20) khuếch
đại 1 vùng của gene β-globin, với sự biến đổi như sau: các phản ứng PCR được
thực hiện với thể tích cuối là 25 µl chứa 1.5 mM MgCl
2
và 12.5 µl dung dịch
dung giải mẫu. Tiến trình này cho phép sự định lượng toàn bộ DNA tế bào và
sự có mặt của tác nhân ức chế của Taq polymerase.
Sự khuếch đại được tiến hành như đã được mô tả, sử dụng kỹ thuật khởi
động nóng ( hot start technique). Phản ứng phát hiện 1 vùng 123-bp từ trình tự
chèn IS 6110 là phức hợp chuyên biệt của M. tuberculosis. PCR được thực hiện

o
C để qua đêm với mẫu dò đánh dấu
32
P. Sự bắt cặp đặc hiệu của mẫu dò
khoảng 108 cpm/mg, xấp xỉ 107 cpm được sử dụng trong phản ứng lai. Sau đó,
màng lai được rửa trong 2x SSPE- 0.1 % SDS ở 55
o
C và được đưa vào máy ….
Có chứa các màng hình khuếch đại trong khoảng 2 đến 24 h ở -70
o
C.
Mẫu dương tính được nhìn thấy trong kỹ thuật phóng xạ tự ghi. Trong
tất cả các trường hợp, kết quả đạt được từ các mẫu nhân bản là giống nhau
hoàn toàn.
15
2.2.2. Xác định đặc hiệu loài của Mycobacterium bovis bằng PCR
Kỹ thuật RAPD được sử dụng trong xác định đoạn đặc hiệu loài của
Mycobacterium bovis. Một đọan DNA có kích thước khoảng 500 bp được
khuếch đại từ bộ gene của 15 dòng M. bovis, bao gồm cả M. bovis BCG
Pasteur, nhưng không có mặt trong 26 vi khuẩn lao khác và 20 dòng khác của
Mycobacterium tuberculosis. Khi đoạn DNA được sử dụng như là một mẫu dò
trong phương pháp Southern blot, một vài band có hoạt tính phóng xạ thu
ộc về
16

M. tuberculosis và M. bovis được quan sát. Tuy nhiên, đoạn DNA này lai đặc
hiệu với đoạn EcoRI 2900bp trên bộ gene của M. bovis, nhưng lại không lai

250 µg/ml. Sau 1.5h, DNA được ly trích với phenol/ chloroform và kết tủa với
0.6 V 2-propanol. Phần lắng được rửa với 70% (v/v) ethanol và được tăng sinh
lại trong 30-50 µl nước cất; 10 µl mẫu được sử dụng trong kỹ thuật RAPD,
hoặc trong phản ứng PCR đặc hiệu.
18

Các primer được sử dụng trong kỹ thuật RAPD được liệt kê trong bảng
2. Các trình tự oligonucleotide được thiết kế theo hàm lượng GC của bộ gene vi
khuẩn lao, và sử dụng chương trình Oligo version 4.0 ( National Biosciences).
Các primer được tổng hợp bởi phương pháp phosphite triester pha rắn theo
Pharmacia LKB Gene Assembler Special.
19

Khuếch đại bằng kỹ thuật RAPD: Thực hiện phản ứng với 50 µl có chứa
10µl DNA, 1x buffer phản ứng ( Gene amp kit, Perkin Elmer Cetus), 2.5 đơn vị
Taq pol, 0.2 mM mỗi deoxynucleoside triphosphate, và 75 pmol mỗi primer.
Phản ứng được thực hiện theo chu kỳ nhiệt DNA Perkin Elmer. Phản ứng được
thực hiện trong 30 chu kỳ khuếch đại với bước biến tính ở 94
o
C trong 1 phút,
bắt cặp trong 30s ở nhiệt độ nóng chảy (T
m
, bảng 2) của primer, và bước kéo
dài 1 phút ở 72
o
C.
Phân tích sản phẩm RAPD: 5µl mẫu từ thử nghiệm RAPD được phân
tích bởi điện di trên gel với 1% (w/v) gel agarose. DNA được quan sát bằng
cách nhuộm với ethidium bromide ( 0.5 µg/ml; Sigma) và gel được chiếu qua
tia UV. Các sản phẩm khuếch đại được đưa lên màng gắn mẫu dò Z-probe

được dòng hóa vào plasmid pCR 1000 ( Invitrogene) và giải trình tự nucleotide
của clone pLD1 được thực hiện bằng cách sử dụng T7 và M13 theo hướng
primer với Sequenase kit từ USB ( Sanger et al., 1977).
20

Khuếch đại bằng PCR. Dựa trên tỷ lệ trình tự nucleotide của đoạn 500bp
đặc hiệu, 1 cặp mồi được thiết kế cho việc sử dụng PCR đặc hiệu ( bảng 2).
Điều kiện phản ứng được thực hiện tối đa trong 30 chu kỳ, với chu kỳ nhiệt
như sau: bước biến tính ở 94
o
C trong vòng 1 phút, bước bắt cặp ở 68
o
C trong 1
phút, bước tổng hợp ở 72
o
C trong 1 phút.

21


22


III. KẾT LUẬN
Kỹ thuật PCR, với những ưu điểm của nó, đang ngày càng được sử dụng
rộng rãi trong chẩn đoán và xét nghiệm các bệnh trên người cũng như là trên
gia súc gia cầm. Việc chẩn đoán sớm vi khuẩn lao sẽ giúp đưa ra hướng điều trị
thích hợp nhằm tránh tình trạng uống thuốc không đúng bệnh, như vậy rất dễ
tạo ra các ch
ủng vi khuẩn kháng thuốc. Hy vọng trong tương lai không xa