BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THANH LAM
Mã sinh viên: 1101278

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG
AFLATOXIN B1 TRONG MỘT SỐ
LOẠI DƯỢC LIỆU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHAN THANH LAM
Mã sinh viên: 1101278

ĐÁNH GIÁ HÀM LƯỢNG
AFLATOXIN B1 TRONG MỘT SỐ
LOẠI DƯỢC LIỆU
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Lê Đình Chi
2. TS. Trần Cao Sơn
Nơi thực hiện:
Viện kiểm nghiệm an toàn vệ sinh
thực phẩm Quốc gia


DANH MỤC CÁC HÌNH ................................................................................
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................... 1
Chương 1. TỔNG QUAN .............................................................................. 2
1.1. Tổng quan về aflatoxin B1 .................................................................... 2
1.1.1. Vài nét chung về các aflatoxin ........................................................ 2
1.1.2. Điều kiện sinh Aflatoxin B1 ............................................................ 3
1.1.3. Cấu tạo hóa học và tính chất của aflatoxin B1 ................................. 4
1.1.4. Cơ chế gây bệnh của Aflatoxin B1: ................................................. 6
1.1.5. Độc tính của Aflatoxin B1 đến cơ thể người: .................................. 7
1.2. Tổng quan về sắc ký ái lực miễn dịch và sắc ký lỏng – khối phổ
(LC/MS):..................................................................................................... 9
1.2.1. Sắc ký ái lực miễn dịch: ................................................................. 9
1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ: ................................................................... 10
1.3. Các phương pháp phát hiện và định lượng aflatoxin B1: ..................... 14
1.4. Aflatoxin B1 trong dược liệu: ............................................................. 19
1.4.1. Hiện trạng:.................................................................................... 19
1.4.2. Giới hạn aflatoxin B1 trong dược liệu: .......................................... 20
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................. 22
2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị: .................................................................... 22
2.1.1. Nguyên vật liệu: ........................................................................... 22
2.1.2. Thiết bị, dụng cụ: ......................................................................... 23
2.2. Nội dung nghiên cứu: ......................................................................... 24
2.2.1. Khảo sát các điều kiện LC-MS/MS: ............................................. 24


2.2.2. Khảo sát điều kiện xử lý mẫu: ...................................................... 24
2.2.3. Thẩm định phương pháp: .............................................................. 24
2.2.4. Úng dụng phương pháp: ............................................................... 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu: ................................................................... 24
2.3.1. Phương pháp kiểm nghiệm: .......................................................... 24

Aflatoxin B2

AFG1

Aflatoxin G1

AFG2

Aflatoxin G2

AOAC

Hiệp hội các nhà hóa phân tích hóa học (Association of Official
Analytical Chemists)

CE
CE/MS

Năng lượng va chạm (Collision Energy)
Điện di mao quản - khối phổ (Capillary Electrophoresis - Mass
Spectrometry)

CV%

Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

ELISA

Kỹ thuật miễn dịch liên kết với enzyme (Enzyme-Linked
ImmunoSorbent Assay)


LC-MS

Sắc ký lỏng khối phổi (Liquid Chromatography Mass
Spectrometry)

LC-MS/MS Sắc ký lỏng khối phổ hai lần (Liquid Chromatography tandem


Mass Spectrometry)
LOD

Giới hạn định tính (Limit of detection)

LOQ

Giới hạn định lượng (Limit of quantitation)

MeOH

Methanol

PBS

Dung dịch đệm phosphat (Phosphate-Buffered Saline)

R%

Độ thu hồi (Recovery)



Trang

Bảng 1.1

Một số tính chất vật lý của aflatoxin B1

5

Bảng 1.2

Một số phương pháp phân tích aflatoxin

17

Bảng 1.3

Một số khảo sát aflatoxin trong dược liệu và chế phẩm
từ dược liệu đã thực hiện

Bảng 1.4

Quy định hàm lượng aflatoxin tối đa trong dược liệu và
chế phẩm từ dược liệu ở một số quốc gia

Bảng 1.5

Giới hạn aflatoxin B1 trong một số thực phẩm theo quy
định của Bộ Y tế



Các chương trình gradient khảo sát

32

Bảng 3.3

Kết quả khảo sát các quy trình xử lý mẫu

35

Bảng 3.4

Kết quả khảo sát tỷ lệ dung môi chiết

36

Bảng 3.5

Kết quả phân mảnh aflatoxin B1

38

Bảng 3.6

Kết quả xác định LOD, LOQ

40

Bảng 3.7


Tên hình
Công thức cấu tạo của aflatoxin B1
Aflatoxin B1 chuyển thành aflatoxin B2α trong môi
trường acid

Trang
4
6

Hình 1.3

Sơ đồ khối của máy khổi phổ

12

Hình 1.4

Bộ phân tích tứ cực chập ba

13

Hình 3.1

Phổ đồ phân mảnh của aflatoxin B1

30

Hình 3.2


38

Hình 3.7

Sắc ký đồ dung dịch chuẩn aflatoxin B1 10 µg/L

39

Hình 3.8

Sắc ký đồ mẫu trắng thêm chuẩn

39

Hình 3.9

Sắc ký đồ tại mức nồng độ LOD 0,1 µg/L

40

Hình 3.10

Sắc ký đồ tại mức nồng độ LOQ 0,3 µg/L

41

Hình 3.11

Đường chuẩn của Aflatoxin B1


loại dược liệu tại Hà Nội.


2

Chương 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về aflatoxin B1
1.1.1. Vài nét chung về các aflatoxin
Aflatoxin được phát hiện và phân lập lần đầu tiên năm 1960 sau sự kiện
Bệnh Gà tây X ở Anh làm chết hơn 100.000 con gà tây. Những con gà tây này
bị hoại tử gan sau khi được cho ăn lạc mốc và aflatoxin được xác định là
nguyên nhân gây bệnh [15], [33].
Aflatoxin là sản phẩm chuyển hóa thứ cấp được sản xuất bởi một vài loại
vi nấm, đặc biệt là nấm Aspergillus flavus và Aspergillus paraciticus. Nấm
mốc có thể phát triển và sinh aflatoxin trước và sau khi thu hoạch, khi bảo
quản cũng như chế biến. Nhiều nông sản có thể bị nhiễm aflatoxin như ngũ
cốc, lúa gạo; các loại hạt có dầu như hạt đậu, hạt hướng dương, bông; các loại
gia vị như ớt, hạt tiêu, nghệ, gừng; hạnh nhân, quả óc chó và sữa cùng các sản
phẩm từ sữa (bơ, pho mát…) [7], [23].
Aflatoxin là một nhóm chất gồm các chất có cấu tạo tương tự nhau và đều
là dẫn chất của difuranocoumarin, được tổng hợp nhờ con đường polyketide.
Ngày nay, người ta đã xác định được khoảng 20 loại aflatoxin trong đó 6 loại
aflatoxin quan trọng nhất lần lượt là B1, B2, M1, M2, G1 và G2 [38]. Aflatoxin
B1 là loại aflatoxin độc nhất và phổ biến nhất, chiếm 60-80% tổng số
aflatoxin nhiễm độc trong lương thực thực phẩm. Thông thường nếu không có
AFB1 thì cũng sẽ không có AFB2, AFG1 và AFG2 [7], [13].
Aflatoxin được ghi nhận gây ra nhiều bệnh và tổn thương cơ quan ở người
cũng như nhiều loài động vật trong đó Aflatoxin B1 có độc tính lớn nhất.
AFB1 là tác nhân gây ung thư nguồn gốc tự nhiên, cơ quan nghiên cứu ung
thư quốc tế IARC phân loại AFB1 là tác nhân gây ung thư nhóm 1 (năm 1993)

Như vậy, khí hậu và điều kiện bảo quản ảnh hưởng rất lớn đến sự nhiễm độc
aflatoxin B1 trong sản phẩm. Các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới trong đó có
Việt Nam có khí hậu nóng ẩm, nhiệt độ cao, mưa nhiều phần lớn thời gian


4

trong năm, thường có sản phẩm bị nhiễm aflatoxin B 1 nhiều hơn so với các
nước ôn đới. Các nước đang phát triển như ở khu vực Đông Nam Á, Châu
Phi… chưa có nền nông nghiệp hiện đại hóa với những điều kiện trồng trọt và
bảo quản chưa đạt tiêu chuẩn làm tăng nguy cơ xuất hiện aflatoxin B1 trong
sản phẩm.
Các yếu tố ảnh hưởng cây trồng như: hạn hán, nhiệt độ quá cao và thiếu
nước ức chế cây trồng, côn trùng phá hoại làm tăng nguy cơ nhiễm nấm mốc
và hình thành aflatoxin B1 [13].
1.1.3. Cấu tạo hóa học và tính chất của aflatoxin B1
Aflatoxin B1 là dẫn chất của difuranocoumarin, công thức cấu tạo gồm có
vòng bifuran, nhân coumarin và vòng pentanone [7].
Công thức hóa học: C17H12O6

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của aflatoxin B1


5

 Tính chất vật lý [13], [19]:
- Cảm quan: Aflatoxin B1 là tinh thể không màu hoặc màu vàng nhạt.
- Độ tan: rất ít tan trong nước (10–30 μg/mL), tan tự do trong dung môi hữu
cơ phân cực trung bình (chloroform và methanol) và đặc biệt trong dimethyl
sulfoxide; không tan trong dung môi không phân cực.

 Tính chất hóa học [13], [36]:
Aflatoxin B1 không bền khi để dưới ánh sáng (đặc biệt là tia UV) và có
mặt oxy. Tuy nhiên tinh thể aflatoxin rất bền vững khi không có ánh sáng tác
động, kể cả ở nhiệt độ 100oC. Dung dịch aflatoxin trong chloroform hoặc
benzen ổn định nhiều năm nếu được giữ lạnh trong bóng tối.
Aflatoxin B1 không bền trong môi trường pH < 3 hoặc pH > 10. Vòng
lacton trong công thức khiến aflatoxin B1 dễ bị thủy phân trong môi trường
kiềm như amoniac hoặc hypochlorit. Tuy nhiên quá trình acid hóa có thể đảo
ngược phản ứng trả lại aflatoxin ban đầu. Trong môi trường acid, aflatoxin B 1
bị chuyển thành aflatoxin B2α do phản ứng cộng nước vào liên kết đôi trên
vòng furan dưới xúc tác acid.
Aflatoxin dễ bị oxi hóa bởi các tác nhân oxi hóa như hydrogen peroxide,
ozon… và mất huỳnh quang.


6

Hình 1.2: Aflatoxin B1 chuyển thành aflatoxin B2α trong môi trường acid
1.1.4. Cơ chế gây bệnh của Aflatoxin B1:
Aflatoxin B1 được chuyển hóa chủ yếu tại gan thành dạng có hoạt tính
aflatoxin-8,9-epoxide hoặc hydroxyl hóa thành aflatoxin M 1 ít độc tính hơn
bởi cytochrome P450, một họ enzyme trong tế bào gan. Sự epoxide hóa
aflatoxin B1 là một bước nguy hiểm gây nguy cơ đột biến gen và ung thư.
Aflatoxin exo-8,9-epoxide là 1 chất rất ái điện tử, không bền vững, nó liên kết
ái lực cao với guanine base trong DNA tạo thành aflatoxin-N7-guanine.
Aflatoxin-N7-guanin methyl hóa biến G  T, gây đột biến gen và có thể là
nguyên nhân dẫn đến ung thư [11], [19].
Aflatoxin exo-8,9-epoxide và sản phẩm hydrat hóa của nó là dihydrodiol,
gắn kết cộng hóa trị với DNA, RNA làm thay đổi cấu trúc và ảnh hưởng chức
năng của acid nucleic và protein. Aflatoxin exo-8,9-epoxide còn ức chế

đột biến gen p53 – gen ức chế khối u. Một số nghiên cứu tại Trung Quốc và
Nam Phi cho thấy có đột biến ở codon 249 (guanine (G) thành thymine (T),
kết quả là argenine (R) chuyển thành serine (S)), exon 7 trên gen p53 ở những
bệnh nhân HCC [13]. Nguy cơ mắc HCC tăng lên khi đồng phơi nhiễm với
AFB1 và virus HBV hoặc HCV [38]. Ở những cá thể có HbsAg dương tính,
aflatoxin có tiềm năng gây độc gấp 30 lần ở những người không nhiễm virus.
Nhiễm HBV tăng nguy cơ ung thư gan lên 5 lần trong khi đồng phơi nhiễm


8

virus HBV và AF tăng nguy cơ ung thư gan lên 60 lần [17]. Ngoài ra ung thư
phổi do AFB1 cũng được báo cáo ở những người phơi nhiễm kéo dài với sản
phẩm đã nhiễm độc aflatoxin qua đường hô hấp [19].
Aflatoxin B1 còn được báo cáo có liên quan đến hội chứng giống như hội
chứng Reye ở trẻ em với những triệu chứng như ho, sốt, thay đổi trương lực
cơ, nôn. Giải phẫu cho thấy hình ảnh gan to nhiễm mỡ, phù não, thoái hóa mỡ
nội tạng, thoái hóa thần kinh. Khi gan bị tổn thương do AFB1 dẫn đến
amoniac – sản phẩm chuyển hóa protein và acid amin – không được giải độc
khỏi cơ thể, đạt nồng độ cao trong cơ thể, đi qua hàng rào máu não và gây hội
chứng não gan [10].
Theo FDA, nhiễm độc AFB1 trong sản phẩm nông nghiệp là khó tránh
khỏi, hàng năm có rất nhiều người có nguy cơ phơi nhiễm với AFB1, tuy
nhiên, nguy cơ nhiễm và độc tính của AFB1 có thể được giảm tới mức tối
thiểu nhờ các phương pháp kiểm soát và phát hiện aflatoxin B1 trong sản
phẩm.


9


lực là kháng thể hoặc kháng nguyên. Do tính đặc hiệu cao của tương tác
kháng thể - kháng nguyên và khả năng tạo kháng thể của nhiều loại chất, kỹ
thuật sắc ký ái lực miễn dịch trở thành một công cụ phổ biến và quan trọng
trong phân tích các chất có nguồn gốc sinh học [1].
Kỹ thuật sắc ký ái lực miễn dịch còn được ứng dụng để tinh chế và làm
giàu chất phân tích trong cột chiết pha rắn (SPE) với nhiều ưu điểm [33]:
- Sử dụng ít dung môi.
- Có tính đặc hiệu cao với chất phân tích.
- Làm giàu mẫu cho kết quả phân tích tốt hơn.
Nhược điểm của kỹ thuật này là chi phí cao do cột chỉ dùng được một lần
(kháng thể bị biến tính) [33].

1.2.2. Sắc ký lỏng khối phổ:
1.2.2.1. Sắc lý lỏng hiệu năng cao (HPLC):
HPLC là một kỹ thuật tách tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua
cột chứa các hạt pha tĩnh. Tốc độ di chuyển khác nhau liên quan đến hệ số
phân bố của chúng giữa hai pha tức là liên quan đến ái lực tương đối của các
chất này với pha tĩnh và pha động. Thứ tự rửa giải các chất ra khỏi cột vì vậy
phụ thuộc vào các yếu tố đó. Thời gian chất phân tích được rửa giải được ghi
lại nhờ detector gọi là thời gian lưu. Thời gian lưu phụ thuộc vào bản chất của
chất phân tích và thành phần của pha động và pha tĩnh [1].
 Pha tĩnh:
Trong HPLC, pha tĩnh là các hợp chất được gắn lên chất mang thường là
các hạt hình cầu có đường kính 1,5-10 µm, có nhiệm vụ tách hỗn hợp chất


11

phân tích. Pha tĩnh có độ phân cực khác nhau, dựa vào độ phân cực của pha
tĩnh mà người ta phân ra hai loại: sắc ký pha thuận và sắc ký pha đảo.

cường độ khác nhau tập hợp lại thành phổ khối. Nó cung cấp thông tin định
tính xác định cấu trúc và định lượng các chất [1].
 Máy khối phổ gồm có 5 bộ phận: bộ nạp mẫu, bộ nguồn ion, bộ
phân tích khối, detector, bộ xử lý dữ liệu.

Hình 1.3: Sơ đồ khối của máy khổi phổ
- Bộ nạp mẫu: là bộ phận đưa mẫu vào máy. Nếu mẫu ở dạng lỏng hoặc
rắn cần chuyển sang dạng hơi bằng cách thích hợp. Bộ nạp mẫu có thể phân
thành hai nhóm chính là nhóm nạp mẫu trực tiếp và nạp mẫu gián tiếp. Trong
nạp mẫu gián tiếp, bộ nạp mẫu là đầu ra của một thiết bị phân tích khác được
kết nối với khối phổ như sắc ký khí (GC/MS), sắc ký lỏng (LC/MS), điện di
mao quản (CE/MS)…
- Bộ nguồn ion: Trong máy khối phổ, có nhiều cách để ion hóa phân tử và
nguyên tử của mẫu ở trạng thái khí hoặc hơi. Một số kỹ thuật thường dùng
như ion hóa bằng va chạm electron, ion hóa hóa học, ion hóa bằng tia điện,
ion hóa bằng giải hấp… Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng kỹ thuật ion
hóa bằng tia điện ESI.
Kỹ thuật này tạo ra ion từ phân tử trong dung dịch. Dung dịch ở trong một
mao quản kim loại (tốc độ dòng dao động từ 1mL đến 10mL/phút). Người ta


13

đặt một điện trường giữa đầu mao quản và một điện cực, các giọt mịn hạt
sương mang điện tích được tạo thành và gia tốc đến điện cực. Kỹ thuật ESI
thích hợp để ion hóa các chất phân cực và nghiên cứu các phân tử sinh học có
khối lượng phân tử lớn (M ≤ 100000).
- Bộ phân tích khối: có nhiệm vụ tách các ion có trị số m/z khác nhau
thành từng phần riêng biệt. Tính năng của máy khối phổ chủ yếu phụ thuộc
vào bộ phân tích khối.

độ thuốc trong cơ thể do có nhiều ưu điểm như [1]:
- Cho thông tin về cấu trúc chất phân tích.
- Tính chọn lọc cao.
- Độ nhạy cao, giới hạn phát hiện có thể đến 10 -14 gam nên kỹ thuật này
thường được dùng để phân tích hàm lượng siêu vết.
- Có thể phân tích các chất dựa vào tỷ lệ m/z của ion phân tử và ion sản
phẩm mà không cần tách hoàn toàn các thành phần trong mẫu có nhiều thành
phần.
1.3. Các phương pháp phát hiện và định lượng aflatoxin B1:
 Tách chiết aflatoxin B1:
Phát hiện và định lượng aflatoxin yêu cầu quy trình tách chiết hiệu quả.
Aflatoxin thường tan trong các dung môi phân cực protic như methanol,
acetone, chloroform, acetonitril. Vì vậy, tách chiết aflatoxin thường sử dụng
các dung môi hữu cơ: methanol hoặc acetonitril hoặc aceton và lượng nhỏ
nước ở các tỷ lệ khác nhau [24].


15

Aflatoxin B1 có thể được tách chiết bằng phương pháp chiết lỏng – lỏng,
chiết bằng chất lỏng siêu tới hạn, chiết pha rắn [24]. Tuy nhiên hiện nay, tách
chiết AFB1 bằng phương pháp chiết pha rắn được sử dụng phổ biến hơn cả
nhờ những ưu điểm như tiết kiệm thời gian và dung môi, vật liệu chiết đa
dạng và cho hiệu quả cao.
Chiết pha rắn (SPE) là quá trình tách chất phân tích từ mẫu bằng một chất
rắn. Mẫu được phân tán vào một dung môi, dung môi được dẫn qua chất rắn
và chất phân tích sẽ được giữ lại trong chất rắn. Tạp chất không liên kết với
chất rắn được loại bỏ bằng dung môi hoặc dung dịch đệm, sau đó rửa giải
bằng một dung môi phù hợp để thu được chất cần phân tích [1].
Các loại pha rắn trong SPE rất đa dạng và tương tự như trong kỹ thuật sắc


môi LC-MS/MS

chiết: MeOH Pha tĩnh: cột C18

Độ thu

LOD

hồi

(µg/

(%)

Kg)

86,7-

0,28–

108,1

1,10

64,2 -

0,14–

106,9


hóa:

ESI(+)
AF tổng/ Dung
Dược liệu

môi LC-MS/MS

chiết: MeOH Pha tĩnh: cột C18

[24]

–H2O (70:30) Pha động: MeOH2

Làm
Cột

sạch: ACN
ái

(60:40)

+

lực amoni acetat 1mM

miễn dịch

Nguồn


0,15

lực (14:17:69)

miễn dịch

[39]

(B2,

Detector: FD, tạo dẫn

G2)

xuất brom sau cột
AF tổng/ Dung
4

thuốc

môi RP-HPLC

chiết: MeOH Pha tĩnh: cột C18

đông dược –H2O (70:30) Pha động: ACN –
Làm

sạch: MeOH – H2O (1:1:4)