BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ HỒNG
MSV 1101217

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA CỦA HAI LOÀI THUỘC CHI
GYNOSTEMMA THU HÁI TẠI YÊN BÁI
VÀ BẮC KẠN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

VŨ THỊ HỒNG
MSV 1101217

ĐÁNH GIÁ TÁC DỤNG CHỐNG OXY
HÓA CỦA HAI LOÀI THUỘC CHI
GYNOSTEMMA THU HÁI TẠI YÊN BÁI
VÀ BẮC KẠN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
ThS. Thân Thị Kiều My
Nơi thực hiện:
Bộ môn Dược Liệu


ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 2
1. 1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume ........................................................................ 2
1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume .............................................................. 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................................. 2
1.1.3. Đặc điểm thực vật của hai loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino và
Gynostemma burmanicum King ex Chakrav. ................................................................ 3
1.1.4. Thành phần hóa học ............................................................................................ 4
1.1.5. Tác dụng sinh học ............................................................................................... 9
1.1.6. Độc tính ............................................................................................................ 13
1.1.7. Chiết xuất, tinh chế ........................................................................................... 13
1.2. Quá trình oxy hóa trong cơ thể, các phương pháp sàng lọc và đánh giá hoạt tính
chống oxy hóa. ........................................................................................................... 14
1.2.1. Gốc tự do và quá trình oxy hóa ......................................................................... 14
1.2.2. Cơ chế chống oxy hóa ....................................................................................... 15
1.2.3. Các chất chống oxy hóa .................................................................................... 16
1.2.4. Một số phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa..................................... 19
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 23
2.1. Nguyên liệu, hóa chất và trang thiết bị ................................................................. 23
2.1.1. Nguyên liệu ...................................................................................................... 23
2.1.2. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm .......................................................................... 23
2.1.3. Hóa chất ........................................................................................................... 24


2.2. Nội dung nghiên cứu ........................................................................................... 24
2.3. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................... 24
2.3.1. Định tính các nhóm chất ................................................................................... 24
2.3.2 Chiết cao các phân đoạn .................................................................................... 25
2.3.3. Đánh giá tác dụng chống oxy hóa trên mô hình in-vitro .................................... 25
2.4. Xử lý số liệu ........................................................................................................ 27


Ethylacetat

EtOH

Ethanol

FRAP

Ferric reducing-antioxidant parameter

G.

Gynostemma

Glu

Glucose

Rham

Rhamnose

RP

Reducing power method

Xyl

Xylose


Số thứ tự

UV

Ánh sáng tử ngoại

UV254

Ánh sáng tử ngoại bước sóng 254 nm

UV365

Ánh sáng tử ngoại bước sóng 366 nm

TRAP

Total radical-trapping antioxidant parameter

ORAC

Oxygen radical absorbance capacity


DANH MỤC CÁC BẢNG

STT

Tên bảng



28

lam thu hái tại Yên Bái và Bắc Kạn
6

Bảng 3.2. Các thông số chạy nhựa D101 của 2 loài giảo cổ lam

35

7

Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc dọn gốc tự do DPPH của loài

41

G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
8

Bảng 3.4. Kết quả sàng lọc hoạt tính dọn gốc tự do DPPH của
G. burmanicum ex King ex Chakrav

42


DANH MỤC CÁC HÌNH, SƠ ĐỒ
Tên hình

Trang


33

thu hái tại Yên Bái và Bắc Kạn
Hình 3.2. Quy trình tách Saponin bằng nhựa hấp phụ D101

36

Hình 4.1. Sắc kí đồ cắn các phân đoạn của hai loài giảo cổ lam khi quan sát

37

dưới ánh sáng thường
Hình 4.2. Sắc kí đồ cắn các phân đoạn của hai loài Giảo cổ lam khi quan sát

38

dưới UV254
Hình 4.3. Sắc kí đồ cắn các phân đoạn của hai loài Giảo cổ lam khi quan sát

38

dưới UV366
Hình 4.4. Sắc kí đồ cắn các phân đoạn của hai loài Giảo cổ lam sau khi phun

39

thuốc thử vanillin/H2SO4 10 %
Hình 5.1. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cao toàn phần của
G. pentaphyllum khai triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – H2O (4 : 1 :
0,1)

PL 2

G. burmanicum khai triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – H2O (4 : 1 :
0,1)
Hình 5.7. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cắn butanol của

PL 2

G. pentaphyllum khải triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – H2O (4 : 1 :
0,1)
Hình 5.8. Sắc kí đồ, đồ thị và bảng biểu diễn các giá trị cắn butanol của

PL 2

G. burmanicum khai triển với hệ dung môi CH2Cl2 – MeOH – H2O (4 : 1 :
0,1)
Hình 6.1: Đồ thị kết quả dọn gốc tự do DPPH các phân đoạn của

42

G. pentaphyllum
Hình 6.2: Đồ thị kết quả dọn gốc tự do DPPH các phân đoạn của
G. burmanicum

43


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1. 1. Đặc điểm chi Gynostemma Blume
1.1.1. Vị trí phân loại chi Gynostemma Blume
Theo các tài liệu [3], [13], [49], Giảo cổ lam thuộc chi Gynostemma, một chi nằm
trong họ bầu bí (Cucurbitaceae), và có vị trí phân loại được tóm tắt như sau:
Giới thực vật (Plantae)
Ngành Ngọc Lan (Magnoliophyta)
Lớp Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp Sổ (Dilleniidale)
Liên bộ Hoa tím (Violanae)
Bộ Bí (Cucurbitales)
Họ Bầu bí ( Cucurbitaceae)
Chi Gynostemma
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Theo Từ điển cây thuốc Việt Nam [3] và Thực vật chí Trung Quốc [49], các loài
thuộc chi Gynostemma có những đặc điểm chung sau:
Cây thảo lâu năm, khác gốc, ít khi cùng gốc, thân leo mảnh, nhẵn hoặc lông mịn.
Lá kép, ít khi là lá đơn, lá có cuống, phiến lá chân vịt có 3-9 lá chét. Tua cuốn chẻ đôi,
đôi khi có tua cuốn đơn. Cụm hoa khác gốc, dạng chùy mảnh, dài, nhất là đối với hoa
đực. Hoa đực: nhỏ, màu trắng hoặc lục nhạt, có lá bắc con; cuống hoa có đốt. Đài hoa
hình bánh xe, hơi hàn liền phần gốc tràng, có đầu nhọn. Nhị 5, ở phần gốc chỉ nhị hàn
liền thành cột. Bao phấn một ô, nhưng nhìn có vẻ như hai ô. Hoa cái: đài và tràng giống
hoa đực. Nhụy 1 hoặc 2, bầu hình cầu nhỏ, 2-5 ngăn, thường 3 ngăn, ít khi 2,4,5, đầu
nhụy chia 2-3 đầu nhọn. Quả hình cầu lớn hơn hạt đậu, không mở. Quả có 2-3 hạt hình
trứng, hơi dẹt hai bên hoặc có 3 góc. Hạt sần sùi [3], [49].
Các loài thuộc chi Gynostemma chủ yếu được phân bố ở vùng nhiệt đới Châu Á
và Đông Nam Á: từ Himalaya tới Nhật Bản, Malaysia và đảo New Guinea.


3

thùy đài hình tam giác, dài khoảng 0.7 mm, đỉnh nhọn, thùy tràng hình bầu dục hoặc mũi
mác, đỉnh nhọn có một gân, nhị 5, bao phấn đính thành đĩa. Cụm hoa cái dạng chùy ngắn
hơn hoa đực. Hoa có đài và tràng giống hoa đực, bầu hình cầu 2-3 ô, vòi nhụy 3, ngắn
[49].


4

Quả khô, tròn, đường kính 5-9 mm, khi chín màu đen, hạt 2-3, treo, hình trứng
hoặc hình tim, đường kính 4 mm, màu nâu [3],[ 49].
Hoa tháng 7-8. Quả tháng 9-10.
Thu hái dây lá vào mùa thu, phơi khô [3], [4], [6].
Phân bố: cây mọc ở rừng, rừng thưa, lùm bụi từ vùng đồng bằng đến độ cao
2000m [3], [49]. Phân bố ở Ấn Độ, Trung Quốc, Thái Lan, Lào, Nhật Bản, Việt Nam và
bán đảo Malayxia. Tại Việt Nam, cây mọc nhiều nơi như Lào Cai, Hòa Bình, Lạng Sơn,
Kon Tum, Đồng Nai [3], [4], [6].
1.1.3.2. Gynostemma burmanicum King ex Chakrav.
Theo khóa phân loại chi Gynostemma Blume có đặc điểm thực vật như sau:
Cây thảo, mảnh, thân leo có góc-rãnh. Toàn thân có nhiều lông mịn bao gồm cả mấu,
chiều dài mỗi lóng thân 5-15cm. Lá kép chân vịt với cuống chung hình trụ có vân dọc ở
giữa; cuống chung dài 3-7cm; phiến lá do 3 lá chét tạo thành. Lá chét ở giữa hình thoi,
gốc hình nêm, mép khía tai bèo, đầu và gốc lá nhọn, cả hai mặt đều có nhiều lông, kích
thước mỗi phiến lá chét ở giữa 5-12cm × 3-6cm. Lá chét bên có hình trái xoan, kích
thước 4-9cm ×3-4cm. Gân lá hình lông chim với 8-9 gân bên. Cuống lá chét ở giữa dài
5-6mm, cuống lá chét bên ngắn hơn, đôi khi gần như không có cuống. Trên cây còn có
cả lá đơn hoặc lá kép hai lá chét. Tua cuống chia đôi ở phía ngọn và có nhiều lông ngắn
bao phủ. Cụm hoa đơn tính khác gốc. Quả mọng không tự mở khi chín, màu xanh, hình
cầu, đường kính 5-6 mm, bề mặt có lông, bên trong chứa 3 hạt. Hạt màu nấu, hình trứng
rộng, kích thước trung bình 3-5 × 3mm, dày khoảng 2mm, cả hai mặt đều có gai nhú,
bên rìa có nếp nhăn.

và bảng như sau:

R6
R4

20

R5

18

R7

17

a

b

CH2OH

c

OH

OH

R3

R2

OH
CH2O Glu

h

O
Rha

i

Hình 1.3. Các cấu trúc của R7


7

Bảng 1.1. Các nhóm thế và hoạt chất tương ứng của saponin trong
G. pentaphyllum (Thunb.) Makino
Các nhóm thế

Hoạt chất

Đường glu, rham, xyl, có thể 1 hoặc

R1

2,3 đường kết hợp với nhau
R2

R3


Gypentonosid A

- OH

Rg3, Rf

- Đường đôi; thường là glu hết hợp Rb1, gymnemasid II

R5

với rha hoặc xyl
- CH3
R6

- CH2OH

Rb1

- CH2O-glu hoặc –CH2O-xyl
R7

Có thể là a,b,c,d,e,f,g,h hoặc i

Các ginsenosid đều có cấu trúc a

Loại đường chính trong gypenosid ( hầu hết là loại pyranose) là β- D- glucose, βD-xylose, α-L-arabinose và α-L-rhamnose nối ở C-3(β) và C-20. Nhóm chức tiêu biểu
là hydroxyl, methyl, aldehyd, alcol và ít phổ biến nhất là aceton ở vị trí C-19 (R3). Nhóm
–OH cũng có vị trí C-2 (α) và C-12 (β) [41].




-

Polysarcharid: Đã phân lập được heteropolysaccharid phi tinh bột điển hình với
thành phần chính là glucose (23,2%), tiếp theo là galactose (18.9%), arabinose
(10,5%), rhamnose (7.7%),…[46]

-

Cholorophyll và dẫn chất: bằng phương pháp HPLC-MS, đã tách xác định được
trong G. pentaphyllum có 15 chlorophyll và dẫn chất [25].

-

Alcaloid: được báo cáo là không có mặt trong G. pentaphyllum [18].

-

Acid hữu cơ: đã xác định được sự có mặt của một số loại acid hữu cơ là acid malonic,
acid benzoic, acid vanilic.

1.1.5. Tác dụng sinh học
Đã có nhiều công trình nghiên cứu về các tác dụng dược lý, đa số các nghiên cứu
trên loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb.) Makino và tập trung vào thành phần
gypenosid. Do tính chất đa tác dụng, loài cây này đã được đặt tên là cây trường sinh "the immortality herb".
Có rất nhiều các tác dụng sinh học của loài Gynostemma pentaphyllum đã được
nghiên cứu chứng minh, trong đó nổi bật là các tác dụng trên chuyển hóa.
1.1.5.1. Tác dụng trên chuyển hóa
Tác dụng hạ đường huyết
Khả năng hạ đường huyết được chứng minh qua các nghiên cứu sau:

Các thử nghiệm trên người cho thấy, mức SOD trở về mức cao khi uống 20mg
gypenoside hàng ngày trong một tháng [17].


11

Thông qua các thử nghiệm in-vitro và in-vivo cho thấy Gypenoside của G.
pentaphyllum có tác dụng chống lão hóa. Tăng khả năng tổng hợp procollagen 43 % so
với nhóm đối chứng, tăng 2,0 và 2,66 lần so với N-Acetylglucosamine tại các mức 5 và
10 μg/g dịch chiết gypenoside [52].
Các hợp chất phenolic từ Gynostemma pentaphyllum có khả năng chống oxy hóa
và đóng góp đáng kể vào hoạt động chống oxy hóa của G. pentaphyllum . Dịch chiết
nước và methanol có khả năng chống oxy hóa mạnh, có thể dùng để phòng chống bệnh
tiểu đường và bệnh tim mạch [42].
Một số nghiên cứu trên các mẫu G. pentaphyllum chỉ ra rằng, dịch chiết G.
pentaphyllum có khả năng dọn gốc tự do DPPH và gốc tự do hydroxyl . Khả năng dọn
gốc tự do DPPH của các mẫu dao động từ 5,7 -148,7 μmol Trolox Equivalents (TE)/g
đối với dịch chiết Methanol và 33,6- 416,8 μmol TE/g với dịch chiết 50% aceton. Khả
năng dọn gốc tự do hydroxyl dao động từ 122,1- 1618,3 μmol TE/g với methanol và
223,7- 4113,0 μmol TE/g với dịch chiết aceton 50 %. Kết quả này cũng gợi rằng aceton
50 % là dung môi thích hợp cho việc đánh giá khả năng dọn gốc tự do hơn so với
methanol [55].
1.1.5.3. Các tác dụng sinh học khác
Tác dụng trên hệ tim mạch
G. pentaphyllum có khả năng ảnh hưởng tới hoạt động của hệ tim mạch, cụ thể là
tác dụng làm giảm áp lực máu, làm giảm nhịp tim, làm tăng độ bền mạch ngoại vi, động
mạch não và động mạch vành [38]. Có nhiều nghiên cứu đã minh chứng cho điều này
như cải thiện chứng loạn nhịp tim ở lợn [23], làm giảm phạm vi nhồi máu cơ tim và co
thắt mạch vành ở thỏ, bảo vệ cơ tim ở chuột, tăng cường lưu thông trên mạch vành của
chó đã gây tê [41],…

Tác dụng bảo vệ gan
Gypenosid cũng cho thấy tác động bảo vệ gan. Với liều 50 mg/kg tt tiêm dưới da
theo dõi trong 6 ngày hạn chế tác động của CCl4 lên γ-glutamine transaminase ở chuột
cống thí nghiệm. Gypenosid cũng có tác dụng kích thích phục hồi gan sau khi cắt bỏ 1


13

phần. Sử dụng cao thu được từ dịch chiết nước G. pentaphyllum (Thunb.) Makino với
liều 100, 300 và 500 mg/kg tt làm tăng sự phục hồi tổn thương gan bằng việc giảm sự
hoại tử, sự xung huyết, sự thấm của tế bào lympho và của tế bào Kupffer qua tĩnh mạch
trung tâm.
Tác dụng chống loét dạ dày
Gypenosid cũng có tác dụng chống loét . Gần đây đã nghiên cứu thấy dịch chiết
butanol có khả năng chống loét dạ dày. Điều trị bằng phân đoạn butanol từ G.
pentaphyllum (Thunb.) Makino bảo vệ màng nhày dạ dày và lượng hexosamin trong liệu
pháp gây loét bằng ethanol ở chuột cống. Chuột cống gây loét bằng H. pylori điều trị
bằng gypenosid dấu hiệu bệnh được cải thiện rõ rệt.
1.1.6. Độc tính
Đã có nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng việc sử dụng Gynostemma pentaphyllum
(Thunb.) Makino là khá an toàn và không có tác dụng phụ, không độc tính [19], [22],
[48].
1.1.7. Chiết xuất, tinh chế
-

Chiết xuất: Theo nghiên cứu về phương pháp chiết xuất dược liệu Giảo cổ lam bằng
dung môi hữu cơ, chiết xuất bằng EtOH 70 % cho khối lượng cao toàn phần lớn nhất,
bước loại tạp bằng dung môi không phân cực trước khi chiết xuất gần như không ảnh
hưởng đến hiệu quả và khả năng chiết xuất của dung môi [10], [11].


-

Từ chuỗi hô hấp tế bào trong ty thể.

-

Từ quá trình peroxyd hóa lipid.

-

Từ phản ứng tạo gốc khác trong cơ thể.

Đích phân tử chỉnh của các gốc tự do là các protein, DNA (acid
deoxyrybonucleic), RNA ( acid ribonucleic), đường và lipid. Những phản ứng của gốc
tự do có liên quan đến nhiều bệnh nghiêm trọng như ung thư, tim mạch bao gồm cả xơ
vữa động mạch và đột quỵ, rối loạn vữa xơ động mạch, rối loạn thận, rối loạn gan, tăng
huyết áp, viêm khớp dạng thấp, hội chứng suy hô hấp người lớn, miễn dịch, viêm, rối
loạn thoái hóa gắn liền với quá trình lão hóa, đái tháo đường, biến chứng tiểu đường, đục
thủy tinh thể, bệnh béo phì, bệnh tự kỷ, bệnh Alzheimer, Parkinson và bệnh


15

Hungtingtons, viêm mạch, viêm cầu thận, lupus ban đỏ hệ thống, loét dạ dày,
hemochromatosis,…[34], [50].
1.2.2. Cơ chế chống oxy hóa

Hình 1.5. Các cơ chế chống oxy hóa trong cơ thể [20].
Các cơ chế chống oxy hóa khác nhau [20]:
1. Ức chế các enzyme xúc tác làm tăng sản xuất các ROS/ RNS.

Glutathione reductase

Hợp chất chứa nitro (non- protein): uric

Glucose-6-phosphatedehydrogentase

Hợp chất chứa S: glutathione
Các chất chống oxy hóa ngoại sinh
Flavonoids
Flavonols: quercetin, kaempferol
Flavanols: catechin, pelagonidin
Anthocyanins: cyanidin, perlagonidin
Isoflavonoids:

Genistein,

Hesperidin,

Chrysin
Khoáng chất: kẽm, selen
Vitamin và dẫn chất : Vitamin A, E, K,
acid ascorbic