ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

LÊ XUÂN PHƢƠNG
LÊ XUÂN PHƢƠNG

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN BẰNG PHƢƠNG
PHÁP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VÙNG VEN BIỂN
ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG

CHỌN TẠO GIỐNG LÚA CHỊU MẶN BẰNG
PHƢƠNG PHÁP CHỈ THỊ PHÂN TỬ CHO VÙNG

Chuyên ngành: Công nghệ Sinh học

VEN BIỂN ĐỒNG BẰNG SÔNG HỒNG

Mã số: 60 42 02 01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ HÙNG LĨNH

Thái Nguyên - 2014
Thái Nguyên - 2014


Bên cạnh đó, tôi cũng xin chân thành cảm ơn sự hướng dẫn, giúp đỡ
quý báu, nhiệt tình của tập thể cán bộ thuộc:
1. Bộ môn Sinh học phân tử - Viện Di truyền Nông nghiệp
2. Khoa Khoa học sự sống, Đại học Khoa học Thái Nguyên

Thái Nguyên, ngày 19 tháng 9 năm 2014
Tác giả luận văn

Cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới gia đình,
đồng nghiệp và bạn bè đã luôn động viên, khích lệ, chia sẻ những khó khăn
cùng tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.

Thái Nguyên, ngày 19 tháng 9 năm 2014
Lê Xuân Phƣơng

Tác giả luận văn

Lê Xuân Phƣơng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


iii


Bảng 2.3. Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) qua quan sát mức hại của mặn ở

trong 50 năm.................................................................................................... 11

giai đoạn mạ (IRRI, 1997) .............................................................................. 37

Hình 1.4. Diễn biến của mực nước biển tại trạm hải văn Hòn Dấu ............... 12

Bảng 3.1. Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các giống ........................... 43

Hình 2.1. Vị trí các chỉ thị trên NST1 và Locus gen Saltol ........................... 28

Bảng 3.2.

Hình 2.2. Sơ đồ phương pháp MABC ………………...……………………33

478 44

Bảng 3.3. Kết quả thanh lọc mặn sau 2 tuần của các dòng ............................ 50
Bảng 3.4

3.1.

6 (P1) và

FL478 (P2) ...................................................................................................... 46
2013 tại Giao Thủy, Nam Định................................ 51

Hình 3.2.


2
3
4
5
6
7
8
9

Từ viết tắt
ANLT
BĐKH
CNSH
Cs
CTAB
EB
ENSO
FAO
IPCC

10 IRRI
11 MABC
12 MAS
13 NST
14 PCR
15 QTL/QTLs
16 SSR
17
18
19

cứu lúa quốc tế
Marker assisted backcrossing - Chọn giống hồi giao
nhờ chỉ thị phân tử
Marker assisted selection - Chọn lọc nhờ chỉ thị phân tử
Nhiễm sắc thể
Polymerase Chain Reaction - Phản ứng trùng hợp chuỗi

1. Tính cấp thiết của đề tài ............................................................................. 1

Quantitative Trait Loci(s) - Locus kiểm soát tính trạng
số lượng
Simple Sequence repeat - Sự lặp lại của trình tự đơn
giản
Tris - Bric Acid - EDTA
Tris - EDTA
Thời gian sinh trưởng
Ngân hàng thế giới

Lời cám ơn ...................................................................................................................... ii
Danh mục bảng ..............................................................................................................iii
Danh mục hình............................................................................................................... iv
Danh mục các từ viết tắt ................................................................................................. v
Mục lục........................................................................................................................... vi
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................ 1

2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài .................................................................. 2
3. Nội dung Nghiên cứu ................................................................................2
4. Ý nghĩa của đề tài ....................................................................................... 3
4.1. Ý nghĩa khoa học ....................................................................................... 3
4.2. Ý nghĩa thực tiễn ........................................................................................ 3

trong quần thể BC1F2....................................................................................... 48

giống lúa chịu mặn .......................................................................................... 19

3.3. Đánh giá vật liệu sử dụng trong nghiên cứu và chọn tạo giống lúa chịu mặn.. 49

1.2.5. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nước ........... 23

3.3.1. Đánh giá tính chịu mặn của các dòng lúa chọn tạo trong điều kiện nhân tạo. . 49

Chƣơng 2 VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 28

3.3.2. Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 28

năng chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ mùa 2013.. 51

2.2. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 30

3.3.3. Đánh giá các đặc tính nông sinh học, yếu tố cấu thành năng suất và khả năng

2.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................ 30

chịu mặn của các dòng được tạo ra mang QTL/Saltol trong vụ xuân 2014 ........... 55

2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 30

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ.................................................................................. 59


chịu mặn trong quần thể BC1F1. ...................................................................... 47
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


1

2
giống bằng MAS sẽ giảm được giá thành và thời gian. Chọn giống nhờ chỉ thị

MỞ ĐẦU
1.

phân tử là kỹ thuật hiệu quả cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen của từng cá

Tính cấp thiết của đề tài
Biến đổi khí hậu (BĐKH) là một trong những thách thức lớn nhất đối

với nhân loại trong thế kỷ 21. BĐKH dẫn đến nhiều thay đổi bất thường của
thời tiết, tác động nghiêm trọng đến sản xuất, đời sống và môi trường. BĐKH

thể trong quần thể. Chọn giống nhờ chỉ thị phân tử có thể sử dụng chỉ thị để
kiểm tra di truyền của dòng bố mẹ và các cá thể con lai. Từ đó có thể kiểm
soát được các alen đặc biệt trong các cá thể của quần thể.



hậu [21], [22]. Từ những vấn đề nêu trên, việc ứng dụng công nghệ chọn
giống nhờ chỉ thị phân tử để chọn tạo giống lúa có năng suất cao, có khả năng
chống chịu mặn là một vấn đề cấp thiết. Vì vậy chúng tôi xây dựng đề tài:
“Chọn tạo giống lúa chịu mặn bằng phương pháp chỉ thị phân tử cho vùng
ven biển Đồng bằng sông Hồng”.
2.

Mục tiêu nghiên cứu của đề tài

[5]. Đáp ứng sản lượng lúa ở Việt Nam là rất cần thiết cho ứng phó với điều

Sử dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử chọn tạo giống lúa

kiện biến đổi khí hậu. Do vậy, chọn tạo giống lúa năng suất cao chống chịu

chịu mặn đáp ứng nhu cầu giống lúa cho vùng ven biển Đồng bằng Sông

mặn là hết sức cần thiết và có ý nghĩa cho an toàn lương thực và tăng thu

Hồng ứng phó với tác động biến đổi khí hậu.

nhập của nông dân tại vùng chịu ảnh hưởng của biến đổi khí hậu.

3.

Chọn giống bằng chỉ thị phân tử (Marker assisted selection - MAS) là
phương pháp thiết thực, hiệu quả trong việc chuyển locus gen quy định tính
trạng di truyền số lượng (Quantitative Trait Loci - QTL) hay gen đích vào


triển vọng phục vụ công tác phát triển giống lúa chịu mặn cho sản xuất.

- Giống lúa FL478 là thuần mang QTL/Saltol (gen chịu mặn) được nhập
từ Viện Nghiên cứu Lúa Quốc tế (The International Rice Research Institute IRRI).

4. Ý nghĩa của đề tài
4.1. Ý nghĩa khoa học
Ứng dụng phương pháp chọn giống bằng chỉ thị phân tử để chọn tạo giống
lúa chịu mặn giúp chọn lọc nhanh và chính xác nguồn gen chịu mặn ở các thế
hệ chọn tạo giống, nhờ vậy có thể rút ngắn thời gian chọn lọc trên đồng
ruộng, giảm số lượng cá thể gieo trồng hàng vụ, giảm diện tích gieo trồng,

- Giống TL6 Là giống lúa chịu thâm canh khá, chống chịu tốt với một số
sâu bệnh hại chính như: bệnh Đạo ôn, khô vằn và bạc lá. Phẩm chất gạo
ngon, thơm, cơm mềm, nhưng không dính. Gieo cấy được 2 vụ trong năm, có
tiềm năng cho năng suất cao.
- Các chỉ thị phân tử có liên quan được sử dụng trong nghiên cứu.

giảm lao động nặng nhọc, giảm chi phí cho những thí nghiệm đồng ruộng

5.2. Phạm vi nghiên cứu

góp phần tăng đầu tư cho nghiên cứu trong phòng thí nghiệm một cách chuẩn

Thí nghiệm được triển khai tại: Phòng thí nghiệm Sinh học phân tử thuộc
Viện Di truyền Nông nghiệp (Từ Liêm, Hà Nội); Huyện Giao Thuỷ, Nam
Định.

mực.
4.2. Ý nghĩa thực tiễn

Biến đổi khí hậu là do các hoạt động trực tiếp và gián tiếp của con
người gây ra, nó làm thay đổi các thành phần trong khí quyển toàn cầu.
BĐKH đã và đang gây ra những ảnh hưởng tiêu cực đến cuộc sống của con
người trên mọi lĩnh vực, cả về môi trường và kinh tế-xã hội. Trong 150 năm
qua, nhiệt độ bình quân bề mặt trái đất giai đoạn 1900-2005 tăng khoảng 0,80
C; nhiệt độ đại dương tăng 0,50 C nhiệt độ bình quân bề mặt toàn cầu đã tăng
0,760C [20]. Sự nóng lên toàn cầu đã gây nên khí hậu thay đổi nhiều hơn, như
những biến đổi của mưa và gia tăng tần suất, cường độ và tính biến động và

Hình 1.1. Dự báo sự thay đổi của mực nước biển đến năm 2100
(Nguồn: IPCC, 2007) [20]

tính cực đoan của các hiện tượng thời tiết nguy hiểm như bão, lốc, các thiên
tai liên quan đến nhiệt độ và mưa như thời tiết khô nóng, lũ, ngập lụt, hạn
hán, rét hại, xâm nhập mặn, dịch bệnh và dẫn đến mực nước biển bình quân
toàn cầu dâng cao.
Theo các nhà khoa học về BĐKH toàn cầu và nước biển dâng cho thấy,
đại dương đã nóng lên đáng kể từ cuối thập kỷ 1950. Các nghiên cứu từ số
liệu quan trắc trên toàn cầu cho thấy, mực nước biển trung bình toàn cầu
trong thời kỳ 1961-2003 đã dâng với tốc độ 0,5 - 1,8mm/năm [20]. Dự báo sự
thay đổi của mực nước biển và diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu đến năm
2100 thể hiện ở hình 1.1 và hình 1.2

Hình 1.2. Diễn biến nhiệt độ ở quy mô toàn cầu và khu vực
(Nguồn: IPCC AR4 WG-I Report, 2007) [20]

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/



các giống lúa có khả năng chịu được ngập và độ mặn cao.
Bên cạnh đó, theo báo cáo của FAO (2010), trên 800 triệu ha đất trên

dụng mô hình CSIRO-Mk2 model 1961-2100.
- Hadley Centre: Trung tâm nghiên cứu và dự báo khí hậu Hadley. Sử
dụng mô hình HADCM3 model 1950-2099.

toàn thế giới bị ảnh hưởng nghiêm trọng bởi muối và khoảng 20% diện tích
tưới (khoảng 45 triệu ha) được ước tính bị vấn đề xâm nhiễm mặn theo mức
độ khác nhau. Mặt khác, tài liệu “Tác động của mực nước biển dâng cao đến

- GFDL: Phòng nghiên cứu biến động các chất lỏng theo địa vật lý. Sử
dụng mô hình R30 Model 1961-2100.

các nước đang phát triển: Phân tích so sánh” của Ngân hàng Thế giới (WB)
thực hiện tháng 2/2007 đã đánh giá các tác động của mực nước biển dâng cao

- MPI-M: Viện khí tượng Max Planck. Sử dụng mô hình

đối với tất cả các nước đang phát triển bằng cách sử dụng bộ chỉ số đồng nhất
các chỉ thị và với các kịch bản khác nhau về mực nước biển dâng cao. WB đã

ECHAM4/OPYC coupled model 1990-2100.
- NCAR PCM: Trung tâm nghiên cứu khí quyển Quốc gia Mỹ. Sử dụng

chia 84 nước đang phát triển ở ven biển thành 5 nhóm theo 5 văn phòng khu
vực của WB gồm: Mỹ Latin và Caribê (25 nước); Trung Đông và Bắc Phi (13

mô hình PCM model 1980-2099.


Alaska và Đông Bắc Canada, vùng biển Scandinavia. Theo một số báo cáo

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


9

10

thị và đất ngập nước (khoảng 10%). Nông nghiệp của Ai Cập bị ảnh hưởng

Ghi chú:

nhiều nhất, gần 13%. 28% diện tích đất ngập nước của Việt Nam, Jamaica và

- a: Sự đánh giá này được đánh giá từ một hệ thống mô hình, bao gồm

Belize có thể bị ảnh hưởng khi mực nước biển dâng cao 1m. Xét về tất cả các

một mô hình khí hậu đơn giản, một số mô hình Trái đất có mức tạp vừa phải

chỉ thị, theo Báo cáo của WB, Việt Nam nằm trong danh sách 5 nước bị ảnh


dòng chảy băng
trong tương lai

Hàm lượng KNK không đổi ở
mức năm 2000b

0,6

0,3 - 0,9

-

Kịch bản B1

1,8

1,1 – 2,9

0,18 – 0,38

Kịch bản A1T

2,4

1,4 – 3,8

0,20 – 0,45

Kịch bản B2


Trường hợp

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

AOGCMs.
1.1.2. Ảnh hƣởng của BĐKH tại Việt Nam
Cũng như các nước khác trên thế giới, khí hậu đã, đang và sẽ biến đổi
trên lãnh thổ Việt Nam. Kết quả phân tích các số liệu khí hậu cho thấy những
biến đổi chủ yếu của các yếu tố khí hậu và mực nước biển như sau:
- Nhiệt độ: Trong 50 năm qua (1958 - 2007), nhiệt độ trung bình năm ở
Việt Nam tăng lên khoảng từ 0,50C đến 0,70C. Nhiệt độ mùa đông tăng nhanh
hơn nhiệt độ mùa hè và nhiệt độ ở các vùng khí hậu phía Bắc tăng nhanh hơn
ở các vùng khí hậu phía Nam (hình1.3a). Nhiệt độ trung bình năm của 4 thập
kỷ gần đây (1961 - 2000) cao hơn trung bình năm của 3 thập kỷ trước đó
(1931 - 1960). Nhiệt độ trung bình năm của thập kỷ 1991 - 2000 ở Hà Nội,
Đà Nẵng, thành phố Hồ Chí Minh đều cao hơn trung bình của thập kỷ 1931 1940 lần lượt là 0,8; 0,4 và 0,60C. Năm 2007, nhiệt độ trung bình năm ở cả 3
nơi trên đều cao hơn trung bình của thập kỷ 1931 - 1940 là 0,8 - 1,30C và cao

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

hơn thập kỷ 1991 - 2000 là 0,4 - 0,50C.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


11

12

Trung, làm cho nước nhạt (nước ngọt) bị nhiễm mặn và do đó làm giảm
lượng nước nhạt có thể khai thác, sử dụng. Theo kết quả các kịch bản biến
đổi khí hậu đã được đưa ra, nếu mực nước biển có thể dâng cao 0,75 – 1 m
so với thời kỳ 1980 – 1999, thì khoảng 20 – 38% diện tích Đồng bằng sông
Cửu Long và đồng bằng sông Hồng bị ngập, là hai vùng sản xuất lúa chính

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


13

14

của Việt Nam và do đó ảnh hưởng nghiêm trọng đến sản xuất lương thực để

đây là dạng gây stress quan trọng đối với sản xuất lúa, và đặt ra mục tiêu

cung cấp cho hơn 86 triệu dân Việt Nam và gần 100 triệu dân trên thế giới.

hướng tới để cải tiến giống lúa trên qui mô toàn cầu. Xác định gen chống

2

Việt Nam có bờ biển dài khoảng 3260 km, hơn một triệu km lãnh hải và

chịu mặn là trọng tâm quan trọng trong chọn giống lúa, nó có những khó

trên 3000 hòn đảo gần bờ và hai quần đảo xa bờ là Hoàng Sa và Trường Sa,


ảnh hưởng nghiêm trọng của BĐKH và nước biển dâng. Trong đó, đồng bằng

bao phấn, sàng lọc và tái sinh cây trong môi trường bổ xung hàm lượng NaCl

châu thổ sông Hồng và sông Cửu Long là hai vùng chịu tác động BĐKH và

với nồng độ khác nhau, hay chuyển gen chịu mặn vào giống có tiềm năng

nước biển dâng nhiều nhất. Đây là hai vùng sản xuất nông nghiệp chính của

năng suất nhưng mẫn cảm với mặn. Biện pháp chọn tạo giống lúa chống chịu

Việt Nam nhưng địa hình thấp, phần lớn chỉ cao hơn 1 m so với mực nước

mặn nhờ chỉ thị phân tử (MAS) tỏ ra là phương pháp hiệu quả, chính xác đã

biển, thậm chí có nơi thấp dưới mực nước biển. Theo kết quả các kịch bản

được các nhà chọn giống sự dụng trong những năm gần đây trên thế giới.

biến đổi khí hậu đã được đưa ra, nếu mực nước biển có thể dâng cao 0,75

Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh yếu tố di truyền tính chống chịu

đến1m so với thời kỳ 1980 – 1999, thì khoảng 20 – 38% diện tích Đồng bằng

mặn biến động khác nhau giữa các giống lúa. Vì vậy, muốn chọn giống lúa

sông Cửu Long và đồng bằng sông Hồng bị ngập và do đó ảnh hưởng nghiêm



15

16

(EC = 12 dSm-1) trong môi trường kiểm soát được các yếu tố ngoại cảnh;

lượng bông và số hạt chắc trên bông [29]. Narayanan và cs., (1990) cho rằng,

người ta thấy, tính trạng chiều dài chồi, hàm lượng Na và K ở trong chồi,

số hạt chắc trên bông, chiều dài bông là tính trạng chính đóng góp vào năng

khối lượng khô của chồi và rễ thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê giữa

suất của các giống lúa trong những vùng đất bị nhiễm mặn[32].

giống chống chịu và giống nhiễm, tính trạng này chủ yếu được điều khiển do
hoạt động của nhóm gen cộng tính. Hệ số di truyền tính chống chịu thông qua
các tính trạng này rất thấp [38]. Trong giai đoạn trưởng thành của cây lúa tính
trạng chiều cao cây, năng suất trong điều kiện mặn được điều khiển bởi
những gen cộng tính [28].

1.2.2. Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống lúa chịu mặn
Ứng dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu di truyền và phục vụ cho công
tác chọn giống cây trồng đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới
triển khai rộng rãi. Nhiều bản đồ phân tử cùng vị trí các gen kiểm soát các
tính trạng khác nhau đã được xác định và ứng dụng trong chọn giống. Đi tiên


chu kỳ, bất dục đực nhân nhậy cảm nhiệt độ, gen tương hợp rộng... Phân tích,

điều kiện bình thường, nhưng trở nên có ý nghĩa trong điều kiện xử lý mặn.

lập bản đồ di truyền phân tử đã được thiết lập rất phổ biến bằng việc sử dụng

Năng suất lúa bị giảm là do ảnh hưởng của mặn. Trong một số giống lúa, ưu

quần thể phân ly F2 hay dòng cập phối (RIL) từ tổ hợp lai xa về di truyền như

thế hoạt động của gen cộng tính đối với năng suất là điều kiện thuận lợi cho

giữa hai loài phụ Indica và Japonica, thế hệ tái tổ hợp thu được nhiều đa hình

chọn lọc giống trong môi trường mặn [19].

hơn là trong cùng loài phụ. Như vậy đối với tính chịu mặn, việc phân tích các

Nghiên cứu về các thông số di truyền Mishra và cs, (1996) cho rằng,

tính trạng phức tạp liên quan đến tính chịu mặn có nghĩa là việc hiểu rõ bản

chiều dài bông và khối lượng 1000 hạt chịu tác động rất ít bởi các yếu tố môi

đồ gen QTLs sẽ cung cấp thông tin hữu ích cho việc làm tăng tính chịu mặn

trường, nếu như chọn giống chống chịu mặn dựa vào hai tính trạng này là

cho lúa. Các phân tích QTL về tính chịu mặn của lúa đã được tiến hành bằng



Zhang và cs (1995) đã phát hiện QTLs cho trọng lượng 1000 hạt trên nhiễm

Giống Pokali là giống lúa chịu mặn điển hình, Pokali đã và đang được

sắc thể số 7 bằng cách sử dụng quần thể F2 dưới điều kiện có NaCl. Năm

các nhà chọn giống trên thế giới chọn là giống cho gen chịu mặn trong

2000, Prasad và cs đã xác định được QTLs cho các tính trạng của cây giống

chương trình chọn giống của mình. Những nghiên cứu đã xác định được rõ

như sự nảy mầm của hạt, chiều dài rễ, trọng lượng khô và sức sống của cây

những đặc điểm sinh thái học cũng như mức độ phân tử về khả năng chịu

con dưới tác động của muối (salt stress) bằng cách sử dụng một quần thể đơn

mặn của giống Pokali. Khả năng chịu mặn được thể hiện ở cả hai khả năng là

bội kép xuất phát từ lai giữa các giống Indica và Japonica. Năm 2001,

duy trì thấp tỷ lệ Na+/K+ ở chồi và phát triển nhanh trong điều kiện mặn [23].

+

+

+

nhiễm sắc thể số 1. Lin và cs (2004), Ren và cs (2005) cùng xác định QTL

Saltol chịu mặn đã được một số nhà khoa học Viện nghiên cứu lúa quốc tế

liên kết với khả năng chịu mặn trên nhiễm sắc thể số 1 [24], [26], [34], [35],

IRRI nghiên cứu và khẳng định lại khả năng chịu mặn của Saltol.
Michael J. Thomson và cs (2010) đã sử dụng 140 dòng tái tổ hợp (RILs)

[36], [44].
Tính chịu mặn của lúa có thể phụ thuộc vào các chất vận chuyển chất

từ tổ hợp lai giữa IR29/Pokkali xác định lại Saltol trên nhiễm sắc thể số 1 và

truyền vận K+ ái lực cao, những chất này làm trung gian cho chất vận chuyển

xác định thêm một số QTL chịu mặn khác. Kết quả đã xác định được 2 QTL

chuyên biệt Na hoặc chất truyền vận Na - K và giữ một vai trò quan trọng

chịu mặn, một trên nhiễm sắc thể số 4 và một trên nhiễm sắc thể số 9. QTL

trong điều hoà sự ổn định Na+ [30].

cho tỷ lệ Na+/K+ được xác định trên nhiễm sắc thế số 6. Bản đồ chi tiết cho

+

+


e. Đối với chỉ thị hình thái, các hiệu ứng lấn át thường làm sai lệch việc

tiện hữu ích trong quy trình chọn tạo giống mới. Ở đây, thay vì phải đánh giá

đánh giá các cá thể phân ly ở trong cùng một quần thể phân ly, còn đối với

kiểu hình của cả một quần thể nhằm phát hiện những cá thể chứa gen mong

chỉ thị phân tử, hiệu ứng lấn át hoặc cộng tính rất hiếm gặp.

muốn, người ta chỉ cần đi tìm những cá thể riêng biệt mang các chỉ thị hình

Ngày nay, phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử là một phương

thái liên kết với các gen đó. Tuy nhiên các chỉ thị hình thái vốn có số lượng

tiện hữu hiệu trợ giúp đắc lực cho chọn giống truyền thống nhằm khắc phục

không nhiều, còn những chỉ thị “may mắn” (liên kết với gen quan tâm) lại

những trở ngại mà công tác chọn giống truyền thống rất khó giải quyết. Sự

càng hiếm gặp, vì thế giá trị thực tiễn của chỉ thị hình thái trong chọn giống

phát triển của công nghệ chỉ thị phân tử đã giải phóng các nhà chọn giống

gặp nhiều hạn chế. Với sự phát triển mạnh mẽ của công nghệ chỉ thị phân tử,

khỏi một lượng lớn công việc khi phải chọn lọc, phát hiện một lượng ít ỏi


đưa cùng lúc nhiều gen khác nhau vào một genôm đích.

b. Số lượng các chỉ thị phân tử là cực kỳ lớn, trong khi số lượng các

Như vậy, chỉ thị phân tử làm tăng thêm hiệu quả sàng lọc trong các
chương trình chọn giống với các ưu điểm sau:

chỉ thị hình thái rất hạn chế.
c. Các alen khác nhau của chỉ thị phân tử thường không liên kết với các

- Khả năng chọn lọc ngay từ giai đoạn cây con đang nẩy mầm trong khi

hiệu ứng có hại, trong khi việc đánh giá các chỉ thị hình thái thường hay đi

nhiều dấu hiệu chỉ có thể sàng lọc khi chúng được biểu hiện ở những giai

kèm với những hiệu ứng kiểu hình không mong muốn.

đoạn muộn hơn trong quá trình sống nếu chỉ sử dụng phương pháp chọn

d. Các alen của các chỉ thị phân tử phần lớn là đồng trội, vì thế cho

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

giống cổ điển (ví dụ: chất lượng quả và hạt, tính bất dục đực, khả năng phản
ứng chu kỳ quang).

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

- Khả năng chọn lọc đồng thời vài đặc tính trong cùng một thời gian, do

* Bước thứ nhất: Sử dụng chỉ thị phân tử liên kết chặt với locus hay

vậy mà có thể đưa vào cùng lúc vài gen có giá trị về mặt nông học, ví dụ đưa

gen đích để chọn lọc trực tiếp lôcut hay gen tính trạng đó từ các cá thể trong

vào cùng một lúc nhiều gen kháng dịch hại khác nhau. Trong trường hợp này,

quần thể BC1F1, BC2F1, BC3F1, BC3F2.

các phương pháp sàng lọc kiểu hình các cá thể thông qua sự lây nhiễm (đồng

* Bước thứ hai: Sử dụng chỉ thị phân tử quanh vùng locus gen, chọn

thời hoặc thậm chí lần lượt từng thể gây bệnh hay từng côn trùng gây hại) rất

lọc cá thể tái tổ hợp mang gen đích, giảm tối thiểu các locus gen không mong

khó đạt được kết quả, nếu không muốn nói là không thể được. Nhưng nếu ta

muốn quang vùng gen đích. Bước này còn gọi là chọn lọc tái tổ hợp

áp dụng công nghệ chỉ thị phân tử, ta có thể kiểm tra sự có mặt hay vắng mặt

(recombinant selection).

của từng alen kháng (hay nhiễm) khác nhau ở từng cá thể riêng biệt.



vọng

như:

IR72046-B-R-8-3-1-3,

IR77674-3B-8-2-2-8-3-AJY5,

IR52713-2B-8-2B-1-2,

IR45427-2B-2-2B-1-1,

IR55179-3B-11-3,

IR64197-3B-3-1, IR74099-3R-3-3, IR66946-3R-178-1-1 (FL478).

đến thế hệ BC3 thì có thể chọn lọc được cá thể mang gen đích và có nền di

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


23


một lượng lớn chỉ thị để kiểm tra di truyền của dòng bố mẹ. Từ đó có thể

biển sẽ dâng 1m, nhiệt độ sẽ tăng thêm 2 0C. Nếu nước biển dâng cao 1m thì

kiểm soát được các alen đặc biệt trong các cá thể của quần thể. Kiểm tra theo

vùng đồng bằng sông Cửu Long sẽ có 1,5 -2 triệu ha đất nông nghiệp bị ngập

phương pháp đó kết hợp lai trở lại 2 đến 3 thế hệ là có thể thu được cá thể với

nước; còn ở vùng đồng bằng sông Hồng sẽ có 1.668 km2 đất bị ngập, trong

nền di truyền của dòng mẹ và mang gen chuyển. Các dòng này có thể cho tự

đó có khoảng 0,3-0,5 triệu ha đất chủ yếu là đất lúa bị ngập. Sự biến đổi khí

thụ, thu hạt để làm thí nghiệm thử nghiêm trên đồng ruộng.

hậu ở nước ta cũng làm gia tăng thiên tai khiến năng suất cây trồng giảm, ước

1.2.5. Tình hình nghiên cứu chọn tạo giống lúa chịu mặn trong nƣớc

tính nếu tăng thêm 10C thì năng suất lúa giảm 10% [20].

Việt Nam có đường bờ biển 3.620 km nằm trải dài từ Bắc vào Nam, hiện

Trước những biến đổi nghiêm trọng đó, trồng các giống lúa chống chịu

tượng xâm thực của nước biển ngày càng trở lên nghiêm trọng làm ảnh



Ninh Bình, Thanh Hoá.

bằng Sông Cửu Long và Sông Hồng [2], [3], [9], [8].

Hơn nữa nghề trồng lúa ở vùng nhiễm mặn đang phải đối mặt với những

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

-

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


25

26
Đỗ Hữu Ất (2005) đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật hạt nhân trong cải
tạo một số giống lúa địa phương vùng Đồng bằng ven biển Bắc Bộ. Kết quả gây
đột biến nguồn Coban (Co 60) đã tạo ra những biến dị có lợi cho chọn giống. Các

: lúa Tiêu, Ba Lê, Đốc Đỏ, Nàng Thước Dài, Chân

giống lúa CM1, CM5, ... là những giống tạo ra cho vùng mặn, kết hợp được

Hương, Tam Sắc, Nàng Quốc Nhuyễn, Nàng Hương 2, Nàng Hương 3, Nàng


trong lai tạo giống mới là đôi khi có mối liên kết khá chặt chẽ giữa tính trạng

đỏ, Đốc phụng, Trái mây, Cà đung trắng. Đó là những mẫu giống cho gen

chống chịu mặn với các tính trạng xấu, không mong muốn thường được lai

mục tiêu để cải tiến giống lúa chịu mặn có hiệu quả [5].

chuyển vào các con lai cùng lúc. Các gen điều khiển tính trạng không mong

Nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ (1997) cho thấy, ở nồng độ

muốn này ảnh hưởng xấu đến biểu hiện của con lai. Do đó lai tạo tính trạng
chống chịu mặn có thể kéo dài đến 10 – 15 năm để phát triển một giống lúa

muối EC = 10dS/

mới [12]. Vì vậy, phương pháp lai tạo truyền thống thường khó, mất nhiều
thời gian và không hiệu quả.
: Nếp Áo Già, Trắng Điệp, Móng Chim, Móng Chim Rơi và Nếp
Bờ Giếng [6]. Theo Ngô Đình Thức (2006) đã

172 giống lúa mùa

địa phương và cao sản ở giai đoạn nẩy mầm với 1,5% NaCl và giai đoạn mạ
với EC = 12dS/m cho thấy có 8 giống lúa mùa địa phương chống chịu mặn
cấp 3, tương đương với giống Pokkali là Nàng Quốc Đỏ, Canh Nông Lùn,
Rồng Xanh, Đốc Phụng, Nhỏ Đỏ, Tám Vuốt, Trắng Điệp, TD2. Hai giống lúa


phấn, đã tạo ra được 72 dòng lúa bằng nuôi cấy túi phấn trong nhà lưới. Từ
kết quả thanh lọc mặn ở giai đoạn mạ thông qua các dữ liệu marker SSR với
primer RM 223 sử dụng trên 72 dòng, kết quả, các băng hình thu được có sự
phân tách giữa giống chống chịu và giống nhiễm với kích thước phân tử có

VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
- Giống lúa FL478: Là giống chịu mặn nhập từ Viện lúa Quốc tế IRRI.
Thông qua dự án hợp tác: “Tạo giống lúa chịu ngập chìm và chịu mặn thích
nghi với điều kiện nước biển dâng cho các vùng bờ biển đồng bằng Việt
Nam” do chính phủ Đan Mạch tài trợ giai đoạn 2010-2012.

chiều dài nằm trong khoảng 140 - 160bp. Các dòng lúa tái sinh qua nuôi cấy

- Giống lúa TL 6 là giống lúa năng suất cao, thơm, chịu thâm canh khá,

túi phấn: C53/Đốc Phụng - 17, C53/Đốc Phụng - 19, C53/Pokkali - 5,

chống chịu tốt với một số sâu bệnh hại chính như: Bệnh đạo ôn, khô vằn và

C53/Pokkali - 11, C53/Pokkali - 27, C53/Pokkali - 42, C53/Pokkali - 43,

bạc lá. Phẩm chất gạo ngon, thơm, cơm mềm, nhưng không dính. Gieo cấy

C53/Pokkali - 44, C53/D51 - 4, C53/D51 - 5 và C53/D51 - 8 là các dòng có

được 2 vụ trong năm, được chọn tạo tại Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp

khả năng chống chịu tốt với điều kiện mặn [7].



Nông nghiệp: Acrylamide, Ammonium persulfate (APS), Agarose, Bis –
acylamide, Boric acid, Cetyltrimethyl Ammonium Bromide (CTAB),

Bảng 2.1. Thông tin về các chỉ thị phân tử trên NST1

Chloroform Ethylenediaminetetra acetic acid (EDTA) 0,5M; pH = 8.0,
Vị
TT

Tên mồi

NST

Trình tự mồi thuận/nghịch

trí

Nhiệt

Kích

N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine (TEMED), Sodium dedoxyl sulfat

độ

thƣớc

(SDS), Sodium thiosulfates, Tris base 1M; pH= 8.0, Tris HCl 1M; pH = 8.0...


TGCACTAATCTTTCTGCCACAGC
GTACGTAAACGCGGAAGGTGACG

110

Văn Đồng, Hà Nội.
Thí nghiệm đồng ruộng được thực hiện tại huyện Giao Thủy, tỉnh Nam

60
55

211

CGACGTACGAGATGCCGATCC

(Nguồn http://www.gramene.org) [45]

Các vật tư, hóa chất sinh học phân tử chuyên dụng, sử dụng trong nghiên
cứu:

Định.
2.3. Nội dung nghiên cứu
- Nghiên cứu đánh giá vật liệu bố mẹ trong nghiên cứu chọn tạo giống
lúa chịu mặn
- Ứng dụng chỉ thị phân tử xác định cá thể mang locus gen Saltol.
- Đánh giá và trồng thử nghiệm các dòng chịu mặn được chọn tạo bằng

o Máy PCR (hãng Eppendorf)

phương pháp chọn giống nhờ chỉ thị phân tử. Xác định các dòng chịu mặn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


31

32

- Chọn cây: Chọn cây sinh trưởng tốt, không sâu bệnh, chuyển cây

- Quan sát kỹ các bông, khi nào túi phấn vươn ra khỏi vỏ trấu của cây

vào chậu (đã được chuẩn bị trước), cột thẻ ghi tên giống vào cây. Chọn 2-3

cha phải thụ phấn ngay khi hoa nở, càng nhanh càng tốt, tận dụng thời gian

bông/tổ hợp lai. Chọn bông đã trổ khỏi bẹ 50–60%. Cẩn thận tách bông

thụ phấn nhiều nhất.

được chọn ra khỏi các bông xung quanh, cắt bỏ các bông đã trổ.

- Lấy bao giấy ra khỏi bông cây mẹ (TL6), rút một bông của cây cha

- Chọn cây lai: loại bỏ những hoa trên (chóp bông) và hoa dưới (gần

(FL478) đang nở rắc lên các bông cây mẹ đã khử đực. Bao bông cây mẹ lại

cổ bông); chỉ giữ lại các hoa có chiều cao bao phấn ở khoảng ½ - ⅓ vỏ trấu

- Các dòng bố mẹ được lựa chọn là cây nhận QTL/Saltol (TL6) sẽ
được lai tạo với giống cho QTL/Saltol (FL478).

2.4.1.3. Chọn cây bố
- Chọn bông từ những cây đại diện, tốt, có nhiều hoa sẽ nở, hoa ở
chóp bông đã tung phấn. Cắt bông lúa có độ dài thích hợp, cắt bỏ lá cờ. Cột
các bông lúa cùng cây cha lại và gắn các thẻ ghi vào bó bông. Mang các

- Khi hai giống lúa cùng trỗ bông, tiến hành thực hiện phép lai hữu
tính, để tạo thế hệ F1.
Bước 2: Tạo thế hệ BC1F1,
- Các tổ hợp lai F1 được lai trở lại với giống nhận QTL/Saltol (TL6) để

bông từ ruộng vào nơi thụ phấn.
- Đặt các bông vào chậu nước, nơi ít gió, dễ di chuyển. Sắp xếp các
bông để rút bất cứ bông nào mà không ảnh hưởng đến bông khác

tạo quần thể BC1F1
- Sử dụng chỉ thị phân tử đa hình, liên kết chặt với QTL/Saltol để xác
định các cá thể mang gen trong quần thể BC1F1

2.4.1.4. Thụ phấn

Bước 3: Tạo cây BC1F2,

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

thành năng suất các dòng mang locus gen Saltol chịu mặn trong các thế hệ

như các chỉ tiêu cấu thành năng suất của các dòng/giống lúa trên đồng

BC1F3, BC1F4 , …
- Đánh giá các dòng mang locus gen chịu mặn Saltol trên đồng ruộng.
TL6

- Đánh giá các chỉ tiêu theo dõi về khả năng sinh trưởng, phát triển cũng

FL478

X

ruộng theo phương pháp nghiên cứu của IRRI, 1980. Các chỉ tiêu theo dõi
gồm có:
o Thời gian sinh trưởng
o Chiều cao cây: đo từ mặt đất đến chóp lá cao nhất theo từng lần

F1

X

lặp lại, đơn vị tính cm.

TL6

o Chiều dài lá đòng: Đo từ cổ lá đến chóp lá
BC1F1


2.4.4. Phƣơng pháp thử độ mặn nhân tạo
* Thanh lọc mặn nhân tạo giai đoạn mạ bằng chậu và dung dịch
Yoshida có muối theo phương pháp đề xuất của IRRI năm 1997.
- Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida được thể hiện ở bảng 2.2

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/


35

36

Bảng 2.2. Thành phần dinh dưỡng của môi trường Yoshida

được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, có lặp lại trong điều kiện pH = 5, với công

(Yoshida và ctv, 1976)
Nguyên tố

- Thí nghiệm đánh giá khả năng chịu mặn của các dòng được chọn tạo

Hoá chất

Lượng cần


o Giống IR29 (giống mẫn cảm có nguồn gốc từ IRRI)

K

Potassium sulfate (K2SO4)

285,6

Ca

Calcium sulfate, dihydrate (CaCl2.2 H2O)

469,4

Mg

Magensium

sulfate,

7-

hydrate 1.296,0

(MgSO4.7H2O)
Micronutrient

- Trước khi tiến hành thử nghiệm khả năng chịu mặn, tiến hành xử lý hạt
giống tránh tác động ảnh hưởng của sự ngủ nghỉ đến khả năng nảy mầm của

[(NH4)6MoO24.4H2O]
Zn

Zinc sulfate, 7-hydrate (ZnSO4.7 H2O)

0,140

mạ con sinh trưởng, rễ có thể xuyên qua lớp lưới xuống dung dịch bên dưới.

B

Boric acid (H3BO3)

3,736

Để hạt có thể làm quen với môi trường, đồng thời tránh gây bất kỳ tổn hại

Cu

Cupric sulfate, 5-hydrate (CuSO4.5H2O)

0,124

nào đến hệ thống rễ cây - cơ quan trực tiếp ảnh hưởng đến cơ chế chống chịu

Fe

Ferric chloride, 6-hydrate (FeCl3.6H2O)

30,800

38

trưởng dựa vào điểm đánh giá chuẩn SES (Standard Evaluation System) của

- Nghiền mẫu cùng với nitơ lỏng trong eppendorf (hoặc cối) thành
dạng bột mịn, khi nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng.

IRRI.
Bảng 2.3. Đánh giá tiêu chuẩn cải tiến (SES) qua quan sát mức hại của
mặn ở giai đoạn mạ (IRRI, 1997)
Mức độ

Khả năng chống

Quan sát

chịu

Sinh trưởng bình thường, lá không có triệu

1

chứng, rễ phát triển mạnh
Sinh trường gần như bình thường, một vài lá hơi

3

trắng và cuộn
Sinh trưởng đã bị chậm lại, hầu hết lá bị cuộn lại,


- Ly tâm 13500 vòng/phút trong 25 phút.

Mẫn cảm
Mẫn cảm cao

- Đổ hết dịch nổi ở trên rồi giữ lại tủa ở dưới đáy eppendorf. Cho
400 l đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0) cho vào tủ
650C ủ trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hoà tan tủa, bước này có

- Để đánh giá khả năng chịu mặn được sử dụng thang điểm đánh giá

thể giữ ở 40C qua đêm.
- Cho 3 l Rnase (10mg/ml) vào mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC khoảng 3

tiêu chuẩn cải tiến (bảng 2.2) để ghi triệu chứng quan sát được của ngộ độc
muối, cho điểm phân biệt kiểu gen nhiễm và kiểu gen chống chịu vừa phải.
2.4.5. Phƣơng pháp tách chiết DNA và phân tích di truyền chỉ thị

- Thêm 400 l đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M
EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh

phân tử

thoảng trộn, lắc đều.

a. Phương pháp tách CTAB
Phương pháp CTAB cải tiến trên cơ sở phương pháp của Shagai –
Maroof (năm 1984). Quy trình thực hiện gồm các bước:
- Lá của các giống lúa nghiên cứu được cắt lấy mẫu sau khi cấy 2 -3
tuần. Mẫu được lấy vào sáng sớm là lúc nồng độ muối trong lá thấp, các


trắng ở đáy ống.
- Rửa tiếp bằng 400 l cồn 70% rồi đưa vào máy ly tâm 13500

phân tích phải được nhỏ thuốc nhuộm Ethidium Bromide vào các mẫu, sau

vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm

đó đưa vào máy PCR gây biến tính ở 940C trong 5phút sau đó để mẫu vào

khô chân không khoảng 10 phút làm khô tủa (ADN), sau đó cho 100 l TE

luôn khay đựng đá lạnh rồi tiến hành tra mẫu DNA vào bản gel điện di.

(10: 1) vào mỗi eppendorf hoà tan tủa.

c. Phương pháp điện di trên gel agarose 0,8%

0

- Giữ ADN trong tủ lạnh sâu (- 20 C) để sử dụng cho các bước nghiên cứu
tiếp theo.

- Nguyên tắc : DNA tích điện âm không đổi nhờ khung phosphate vì thế
khi đặt trong điện trường, các phân tử DNA dịch chuyển từ cực âm sang cực

b. Kỹ thuật PCR với các mồi SSR

dương và các phân tử DNA có khối lượng và điện tích khác nhau sẽ được
phân tách.

1

H2O (nước cất 2 lần)

5,3

2

Buffer 10X

1

- Đổ gel vào khuôn gel và lắp lược

3

dNTPs (2mM)

1

- Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm

4

MgCl2 (5mM)

0,6

5


http://www.lrc-tnu.edu.vn/

chảy gel và không tạo bọt.
- Làm nguội gel đến 50-55oC, thêm 1µl Ethidium Bromide vào.

chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 3-5mm
* Kỹ thuật điện di trên gel agarose
- Khi gel nguội, đặt khuôn gel vào buồng điện di, tháo lược và đổ đệm
chạy vào khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 3-5mm
- Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng tương ứng theo thứ tự mẫu

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu

http://www.lrc-tnu.edu.vn/