TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA HÓA HỌC
BỘ MÔN HÓA HỌC HỮU CƠ


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA
LOÀI NẤM CORDYCEPS NEOVOLKIANA

GVHD: ThS. Dương Thúc Huy
SVTH: Nguyễn Khánh Toàn
MSSV: K38.106.133

Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2016


LỜI CẢM ƠN

Trên con đường đi đến bến bờ của sự thành công không thể thiếu những
người lái đò tận tụy. Thành công của em ngày hôm nay là cả một quá trình phấn đấu
rèn luyện với sự hỗ trợ của những con người hết sức quan trọng.
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến thầy Dương Thúc Huy –
người lái đò đầy tâm huyết và nhiệt tình nhất, tấm gương nghiên cứu khoa học.
Thầy không những chỉ dạy cho em kiến thức chuyên môn cùng với những kinh
nghiệm nghiên cứu quý báu mà còn giúp đánh thức niềm say mê nghiên cứu khoa
học của em trong suốt thời gian được thầy hướng dẫn.
Tất cả quý Thầy Cô khoa Hóa, trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí
Minh đã tận tình truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt thời gian em theo
học và hoàn thành khóa luận.
Các anh chị học viên cao học và các bạn sinh viên bộ môn Hóa Hữu cơ, khoa

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT4 ................................................... 11
3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T2 ..................................................... 14
4.1 KẾT LUẬN ..................................................................................................... 16
4.2 ĐỀ XUẤT........................................................................................................ 16
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 17
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

13

C-NMR

: Carbon Nuclear Magnetic Resonance

1

H-NMR

: Proton Nuclear Magnetic Resonance

d
dd

: Mũi đôi (Doublet)
Mũi đôi đôi (Doublet of doublet)

DMSO


NMR

: Cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

ppm

: Part per million

s

: Mũi đơn (Singlet)

t

: Mũi ba (Triplet)

UV

: Tia cực tím (ultra violet)


DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH, SƠ ĐỒ, BẢNG BIỂU

 DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1.1 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự, 2009 ............................ 3
Hình 1.2 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps................................ 4
Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) ...................... 5
Hình 1.4 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp) ...................... 6
Hình 3.1. Khung sườn sterol .................................................................................... 11
Hình 3.2 Tương quan HMBC trên nhân B của hợp chất TT4 (trái) và cấu trúc

dụng một số loài nấm thuộc chi Cordyceps để chữa bệnh. Được biết đến nhiều nhất
và có vai trò như một loại thần dược quý hiếm trong chi là loài Cordyceps sinensis
(còn gọi là đông trùng hạ thảo).
Chi Cordyceps với hơn 400 thuộc loài chi này có sự phân bố rộng khắp thế
giới và phần lớn sinh sống ở châu Á (Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên, Thái Lan
và Việt Nam).
Những nghiên cứu gần đây cho biết các polysaccharide hiện diện trong C.
sinensis thể hiện đa dạng các hoạt tính sinh học như kháng oxi hóa, ức chế miễn
dịch và chống xơ vữa động mạch, các nucleoside mang đa tác dụng trên
macrophage và cordycepin có hoạt tính ức chế sự phát triển khối u và điều hòa miễn
dịch. Vì thế, loài nấm này thu hút rất nhiều nhà nghiên cứu những năm gần đây dựa
trên giá trị dinh dưỡng và dược học của nó. Tuy nhiên, nguồn cung cấp tự nhiên của
các loài nấm này giảm dần bởi vì môi trường sống khắc nghiệt và sự khai thác quá
mức nguồn nguyên liệu. Gần đây, một vài loài nấm thuộc chi Cordyceps được chiết
tách và nuôi cấy trong phòng thí nghiệm. Một nguyên cứu gần đây chứng tỏ có sự
khác nhau về thành phần và hàm lượng các hợp chất hóa học giữa nấm tự nhiên và
nấm nuôi cấy. Nấm nuôi cấy chứa hàm lượng của polysaccharide, adenine và
adenosine cao hơn so với các loài nấm tự nhiên [27].
Xuất phát từ những ứng dụng Y học quý giá và kế thừa những kết quả
nghiên cứu trong và ngoài nước trên chi Cordyceps, chúng tôi tiến hành nghiên cứu
trên loài nấm Cordyceps neovolkiana.


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 GIỚI THIỆU CHUNG VỀ CHI CORDYCEPS
1.1.1 Định nghĩa và phân loại chi Cordyceps


Nguyễn Khánh Toàn

1.2 NHỮNG NGHIÊN CỨU HÓA HỌC CỦA CÁC LOÀI NẤM THUỘC CHI
CORDYCEPS
Các

hợp

chất

như

Cordycepin

(3’-deoxyadenosine),

3’-amino-3’-

deoxyadenosine, homocitrullyl aminoadenosine, adenine, cordycepic acid và

D-

mannitol đã được cô lập từ các loài nấm thuộc chi Cordyceps từ những năm 1950
(Cunningham và cộng sự, 1950 [6]; Chatterjee và cộng sự, 1957 [3]; Kredich và
Guarino, 1961 [18]; Kaczka và cộng sự 1964 [10], Liu và cộng sự 1989 [22]).
Một nguyên cứu gần đây chứng tỏ có sự khác nhau về thành phần và hàm
lượng các hợp chất hóa học giữa nấm tự nhiên và nấm nuôi cấy. Nấm nuôi cấy chứa
hàm lượng của polysaccharide, adenine và adenosine cao hơn so với các loài nấm tự
nhiên. Li và cộng sự [19,20] cũng tìm thấy nấm C. sinensis nuôi cấy có hàm lượng

kDa đến 2260 kDa được cô lập từ C. militaris bởi Kim và cộng sự (2003b, c) [132


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

15]. Yu và cộng sự (2004a, b) cũng công bố bốn polysaccharides từ C. militaris.
[31-32]. Ngoài ra còn nhiều công bố khác nghiên cứu về polysaccharide từ nấm
Cordyceps như Chun và cộng sự, 2003 [5]; Methacanon và cộng sự, 2005 [23]; Wu,
Sun, và Pan, 2006 [28]; Xiao và cộng sự, 2006 [29]; Yu và cộng sự, 2007 [33];
Cheung và cộng sự, 2009 [4]. Các nghiên cứu chỉ dừng ở xác định thành phần các
monosaccharide và khối lượng phân tử cũng như hoạt tính sinh học. Một nghiên
cứu gần đây được thực hiện bởi Yu và cộng sự, 2009 [25] sử dụng nhiều phương
pháp xác định cấu trúc của polysaccharide từ Cordyceps militaris.

-(1→3)-

→
→
[ 4-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1→4)-α-D-Man-(1 ]n

→
β-D-Gal-(1→
[ 6)-β-D-Gal-(1 ]3 4)-α-D-Glc
Hình 1.1 Polysaccharide được xác định bởi Yu và cộng sự, 2009.
Gần đây, Yang và cộng sự [30] đã cô lập cordysinins A-E (1-5) cùng với 46
hợp chất đã biết khác từ nấm Cordyceps sinensis nuôi cấy: ergosterol (6), (17R)-17methylincisterol (7), ergosterol peroxide (8), ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9),
fungisterol (10), hỗn hợp của β-sitosterol (11) và stigmasterol (12), hỗn hợp của βsitosterol 3-O-acetate (13) và stigmasterol 3-O-acetate (14), 4,4-dimethyl-5αergosta-8,24(28)-dien-3β-ol (15), 3-O-ferulylcycloartenol (16), daidzein (17), phydroxybenzoic acid (18), vanillic acid (19), orobol (20), uracil (21), genistein (22),
D-mannitol

Nguyễn Khánh Toàn
H2N

O
N

NH
O
HO

H
H

O
Cordysinin A (1)

N

N

HO

N

N

N

N



OCH3
Cordysinin B (2)

N
H

N
H

Cordysinin E (5)

H

O
H

H

O

O

H

O

H

H


H

H

Stigmasterol (12)
CH2

HO

ß -Sitosterol (11)

HO

H

H

H

H

H

Ergosta-4,6,8(14),22-tetraen-3-one (9)

H

H



O

H

HO

O

O

OH
3-O-Ferulylcycloartenol (16)
O

O

HO

p -Hydroxybenzoic acid (18)

Daidzein (17)

O

H
N

O


HO
OH

D-Mannitol(23)

OH

OH

OH
OH

O
Genistein (22)

O
OH

OH

O
p -Methoxybenzoic acid (24)

O
3-Hydroxy-2-methyl-4-pyrone (25)

Hình 2.2 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps
4



H
O
Cyclo-(L-Pro-L-Val) (28)

OH

HN

HO

HN

HO

N

N

O
Cyclo(L-Phe-L-Pro) (30)

Syringic acid (29)

O
HO

N

O


Salicylic acid (35)

Glycitein (34)

O

HN

O

H
N
H

O

O
Methyl p-hydroxyphenylacetate (36)

OH

O
HO

Thymine (37)

OH
H

HO

O

N
Nicotinic acid (40)

O

OH
3',4',7-Trihydroxyisoflavone (41)

O
HO

1-Methylpyrimidine-2,4-dione
(44)

H
N

N
H

HO

O

O

O


CO2H OH
O

HO
NH2

OH
HN

HO
Adenosine (50)
O
H
N
CH3

Cicadapeptin I (51) and cicadapeptin II (52)
N
HOH2C

NH2 OH

OH

O

N

N



O

OH

NH2

Val

Perlolyrine (43)
CH3
4-Hydroxyacetophenone (47)
OH

O

OH

Protocatechuic acid (45)

O

Succinic acid (42)

3,4Dihydroxyacet
ophenone (46)

HO
OH


1-Acetyl-ß -carboline (49)

HOOC
OH

53: Myriocin

O

Hình 1.3 Các hợp chất cô lập từ loài nấm thuộc chi Cordyceps (tiếp)
5


Khóa luận tốt nghiệp

H3CO
8

8a

7
6

H3CO

OH
9 9a

10a 10 4a
5

CH3

10
OH

5'

H3CO

CH3

H3CO

CH3

OH
R2

R2
H3CO

1 O
4 3

1 O

1 O
4

OH

56 : R1 = OAc, R2 = OH
57 : R1 = OAc, R2 = OAc
58 : R1 = OH, R2 = H
59 : R1 = OAc, R2 = H4
60 : R1 = H, R2 = H

H3CO

CH3

4'

H3CO

OH

OH
O
O
H3CO

H3CO

CH3
R1

66 : R1 = OH
67 : R1 = H

OH


6

4

H

X

5

OH
13

OH

9

7
8

2

O

N
1

H
N

O

O

N

H

H

13 14

OH

OH
O

N

H
OR1

N
1 OCH3

14
72

OCH3


O
H

3

OCH3

OH

8

13 O

OH

H
14 R2

R1 =

H
74 :
75 : R1 = CH3

80

R2

= HgX
76 :


 Dung môi dùng cho quá trình thí nghiệm gồm: hexane, ethyl acetate,
acetic acid, chloroform, acetone, methanol, ethanol, butanol và nước cất.
 Thuốc thử hiện hình các vết chất hữu cơ trên bảng mỏng: sử dụng
vanillin/H 2 SO 4 .
2.1.2. Thiết bị
 Các thiết bị dùng để giải ly, dụng cụ chứa mẫu.
 Các cột sắc kí.
 Máy cô quay chân không.
 Bếp cách thuỷ.
 Đèn soi UV: bước sóng 254 nm và 365 nm.
 Cân điện tử.
 Các thiết bị ghi phổ 1H-NMR (500 MHz),

13

C-NMR (125 MHz) và

2D-NMR tại phòng Phân tích Trung tâm trường Đại học Khoa học Tự nhiên
thành phố Hồ Chí Minh, số 227, Nguyễn Văn Cừ, Quận 5, thành phố Hồ Chí
Minh.
2.2 NGUYÊN LIỆU
Mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp từ TS. Đinh Minh Hiệp
(Ban quản lý khu nông nghiệp công nghệ cao) vào tháng 7 năm 2015 với khối
lượng 3.5 kg.

7


Khóa luận tốt nghiệp

A3 (3.1 g)
A4 (10.0 g)
A5 (3.0 g)
A6 (10.0 g)
A7 (30.0 g)
M (56.0 g)

2.3.1 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A1
Từ phân đoạn cao A1 (1.56 g) tách riêng phần dầu DA1 (660.0 mg) và phần
tủa TA1 (0.9 g), sau đó tủa TA1 được rửa bằng acetone. Tiếp tục lấy dịch rửa
(200.0 mg) thực hiện sắc ký cột với hệ dung môi H:EA:AcOH (4:1:0.2) thu được
hợp chất T2 có khối lượng 6.0 mg có dạng bột màu trắng.

8


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

2.3.2 Sắc kí cột trên phân đoạn cao A3.4
Cao A3 (3.1 g) được tiến hành sắc kí cột với hệ dung môi H:EA:AcOH
(4:1.0:0.2) thu được 6 phân đoạn kí hiệu từ A3.1 đến A3.6.
Phân đoạn A3.4 (360.0 mg) tiếp tục được sắc kí cột với hệ dung môi C:Me
(5:0.1) thu được hợp chất TT4 có khối lượng 15.0 mg có dạng bột màu trắng.

9


Khóa luận tốt nghiệp


EA:Me
[5:5]

A5
3.0 g

Me
100%

A7
30.0 g

A6
10.0 g

M
56.0 g

SKC H:EA:AcOH
4:1:0,2

Dầu (DA1)
660.0 mg

Tủa TA1
900.0 mg

A3.1
150.0 mg

TT4
(15.0 mg)

Sơ đồ 2.1 Quy trình cô lập hợp chất TT4 và T2

10


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

3.1 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT TT4
 Hợp chất TT4 thu được từ phân đoạn A3.
 Dạng bột màu trắng, không UV.
 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, DMSO-d 6 ) và

13

C-NMR (125 MHz,

DMSO-d 6 ) được trình bày trong Bảng 3.1 (Phụ lục 1,2,3).
 Phổ HSQC, HMBC trong dung môi DMSO-d 6 (phụ lục 4, 5, 6, 7, 8).
 Biện luận cấu trúc hợp chất TT4 (1)
Phổ 1H-NMR cho thấy 6 tín hiệu của các nhóm methyl tại: δ H 0.54 (s, H 3 18), δ H 0.90 (s, H 3 -19), δ H 0.80 (d, H 3 -26), δ H 0.79 (d, H 3 -27), δ H 0.88 (d, H 3 -28),
δ H 1.00 (d, H 3 -21). Trong đó có một nhóm methyl chuyển dịch về vùng từ trường
rất cao tại δ H 0.54 (s, H 3 -18) đặc trưng cho khung sườn sterol.
28

14

9

A

3

HC

24

20

H

27

17

D

16

15

7

Hình 3.1 Khung sườn sterol
Trên phổ 1H-NMR xuất hiện 2 tín hiệu ở vùng từ trường thấp của 2 proton

28

12
1
2
A
HO

3

4

5

20
H

11 13 17D
16
9 C 14

19
10

18

B

8


B

8

25

23

H
13
14

9

A

3

HC

24

20

12

27

HO


12


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

Bảng 3.1 Dữ liệu phổ của TT4 và cerevisterol
Vị
trí

TT4 (1)

Cerevisterol (2)

δC
δ H (ppm)
(ppm)
1
33.4
2
31.2
3
3.77 (m)
66.0
3.87 (m)
4
36.7
5
74.5

19
0.91 (s)
19.5
0.90 (s)
20
42.0
21
1.00 (d, 6.5)
21.0
0.87 (d, 6.5)
22 5.20 (dd, 15.5, 8.0) 131.5
5.10 (m)
23 5.24 (dd, 15.5, 7.0) 135.4
5.20 (m)
24
42.3
25
32.5
26
0.8 (d, 6.5)
17.8
0.69 (d, 6.3)
27
0.79 (d, 6.5)
19.8
0.65 (d, 6.9)
28
0.89 (d, 7.0)
17.3
0.77 (d, 6.6)

42.6
32.8
19.6
20.8
17.2

13


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

3.2 KHẢO SÁT CẤU TRÚC HỢP CHẤT T2
 Hợp chất T2 thu được từ phân đoạn A1.
 Dạng bột màu trắng, không UV.
 Dữ liệu phổ 1H-NMR (500 MHz, CDCl 3 ) và

13

C-NMR (125 MHz,

CDCl 3 ) được trình bày trong bảng 3.1 (Phụ lục 9, 10, 11).
 Biện luận cấu trúc hợp chất T2 (2)
Phổ 1H-NMR hợp chất T2 cũng cho thấy sự xuất hiện của 6 nhóm tín hiệu –
CH 3 đặc trưng của khung sườn sterol tại δ H 0.84 (s, H 3 -18), δ H 0.88 (s, H 3 -19), δ H
0.82 (d, H 3 -26), δ H 0.80 (d, H 3 -27), δ H 0.91 (d, H 3 -28), δ H 0.99 (d, H 3 -21). Ngoài ra
phổ 1H-NMR cũng cho thấy sự hiện diện của nối đôi tại C-22 và C-23 của khung
sườn ergosterol tại δ H 5.20 (J 1 = 15.5, J 2 = 7.5) và δ H 5.15 (J 1 = 15.5, J 2 = 8.0), và
tín hiệu H-3 đặc trưng của khung sterol tại δ H 3.97.


1
2

11
H

9
10

O
O

HO

3

4

5

18

13

20
H

17
14

8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
28
(3),(4)

T2 (3)
δ H (ppm)

3.97 (m)

6.20 (d, 8.5)
6.50 (d, 8.5)

13.0
18.3
39.9
21.0
132.5
135.4
42.9
33.2
18.3
20.1
17.7

Ergosterol peroxide (4)
δC
δ H (ppm)
(ppm)
34.7
30.2
3.97 (m)
66.5
37.0
79.5
6.24 (d, 8.4)
130.8
6.50 (d, 8.4)
135.5
82.2
51.7
37.0
20.7


Khóa luận tốt nghiệp

Nguyễn Khánh Toàn

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT

4.1 KẾT LUẬN
Trong khóa luận này, chúng tôi đã bước đầu tiến hành khảo sát thành phần
hóa học cao ethanol của mẫu nấm Cordyceps neovolkiana được cung cấp bởi TS.
Đinh Minh Hiệp.
Thực hiện các phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với sắc ký cột trên
silica gel pha thường, đã cô lập được hai hợp chất đó là: Cerevisterol (TT4) và
ergosterol peroxide (T2).

H

H
H

H

H

HO
OH

O
O


Md. S., Mosihuzzaman M. M., “Isolation of Bioactive Secondary Metabolites
from, the Endophytic Fungus of Ocimum basillicum”, Department of Chemistry,
129, 2005.
[2]

Boros C., Hamilton S. M., Katz B., Kulanthaivel P., “Comparison of balanol

from Verticillium balanoides and ophiocordin from Cordyceps ophioglossoides”, J.
Antibiot. (Tokyo), 47, 1010–1016, 1994.
[3]

Chatterjee R., Srinivasan K. S., Maiti P. C., “Cordyceps sinesis (Berkeley)

Saccardo: structure of cordycepic acid”, J. Am. Pharm. Assoc. Am. Pharm. Assoc.
(Baltimore), 46, 114–118, 1957.
[4]

Cheung JK1, Li J., Cheung AW., Zhu Y., Zheng KY., Bi CW., Duan R., Choi

RC., Lau DT., Dong TT., Lau BW., Tsim KW., “Cordysinocan, a polysaccharide
isolated from cultured Cordyceps, activates immune responses in cultured Tlymphocytes and macrophages: signaling cascade and induction of cytokines”, J
Ethnopharmacol., 124(1), 61-8, 2009.
[5]

Chun K. Lob, Jerry K. H. Cheungb, Shang Q. Zhub, Karl W. K. Tsimb, “A

polysaccharide isolated from Cordyceps sinensis, a traditional Chinese medicine,
protects PC12 cells against hydrogen peroxide-induced injury, Life Sciences 73,
2503–2513”, 2003.
[6]

[10]

Kaczka E. A., Trenner N. R., Arison B., Walker R. W., Folkers K.,

“Identification of cordycepin, a metabolite of Cordyceps militaris, as 3’deoxyadenosine”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 14, 456–457, 1964.
[11]

Kawaguchi N., Ohmori T., Takeshita Y., Kawanishi G., Katayama S.,

Yamada H., “Occurrence of Gal beta (1—3) GalNAc-Ser/Thr in the linkage region
of

polygalactosamine

containing

fungal

glycoprotein

from

Cordyceps

ophioglossoides”, Biochem. Biophys. Res. Commun., 140, 350–356, 1986.
[12]

Kim D. S., Baek N.-I., Oh S. R., Jung K. Y., Lee I. S., Kim J. H., Lee H.-K.

(1997), Anticomplementary activity of ergosterol peroxide from Naematoloma

from

an

enthomopathogenic fungus Cordyceps militaris”, NG3. Biotechnol. Progr., 19,
428–435, 2003.
[16]

Kneifel H., Konig W. A., Loeffler W., Muller R., “Ophiocordin, an

antifungal antibiotic of Cordyceps ophioglossoides Arch.”, Microbiol., 113, 121–
130, 1977.

18