BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ HOA
MÃ SINH VIÊN: 1101196

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI NANG
Lactobacillus acidophilus
BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐÔNG TỤ
TỪ NHŨ TƢƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRỊNH THỊ HOA
MÃ SINH VIÊN: 1101196

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI NANG
Lactobacillus acidophilus
BẰNG PHƢƠNG PHÁP ĐÔNG TỤ
TỪ NHŨ TƢƠNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

Người hướng dẫn:
1. PGS.TS. Nguyễn Ngọc Chiến
2. DS. Nguyễn Thị Phƣơng Thúy
Nơi thực hiện:

MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

Chƣơng 1. TỔNG QUAN

2

1.1. Đại cƣơng về probiotics

2

1.2. Loài Lactobacilus acidophilus

3

1.2.1. Đặc điểm hình thái và điều kiện nuôi cấy

3

1.2.2. Tác dụng của Lactobacillus acidophilus đối với sức khỏe

3

1.3. Tổng quan về dạng bào chế vi nang


12

Chƣơng 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

15

2.1. Nguyên vật liệu, thiết bị

15

2.1.1. Nguyên vật liệu

15

2.1.2. Thiết bị

16

2.2. Nội dung nghiên cứu

16

2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố công thức và quy trình đến một số
chỉ tiêu chất lượng của vi nang probiotics bào chế được

16


2.2.2. Đánh giá khả năng bảo vệ VSV của vi nang trong môi trường acid pH 1,2
và khả năng giải phóng VSV của vi nang trong môi trường pH 7,4


31

3.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ alginat

31

3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ tinh bột

33

3.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ glycerin

36

3.2.4. Ảnh hưởng của nồng độ chitosan

37

3.3. Đánh giá khả năng giải phóng VSV trong môi trƣờng kiềm

39

3.4. Đánh giá ảnh hƣởng của điều kiện bảo quản đến lƣợng VSV sống sót

41

KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ

43

Đông khô

kl/tt

Khối lượng/thể tích

L. acidophilus

Lactobacillus acidophilus

L. casei

Lactobacillus casei

MRS

Môi trường nuôi cấy vi khuẩn (de Man, Rogosa, Sharpe)

MT

Môi trường

N/D

Nước/dầu

TCNSX

Tiêu chuẩn nhà sản suất



Bảng 2.1

Nguyên liệu và hóa chất nghiên cứu

15

Bảng 2.2

Môi trường MRS lỏng (MT1)

17

Bảng 3.1

Bảng thiết kế công thức khảo sát ảnh hưởng của loại và
lượng chất diện hoạt đến vi nang placebo

Bảng 3.2

Đặc tính vi nang placebo bào chế được khi thay đổi loại và
nồng độ chất diện hoạt

Bảng 3.3

Bảng thiết kế công thức khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ pha
nội/pha ngoại đến vi nang placebo

Bảng 3.4


Đặc tính vi nang placebo thu được khi thay đổi thời gian
nhũ hóa

23

24

26

26

27

28

29

29

30
31


Bảng 3.11

Bảng thiết kế công thức khảo sát ảnh hưởng của nồng độ
tinh bột đến vi nang probiotics

Bảng 3.12


STT
Hình 1.1

Tên hình

Trang

Mô hình "vỉ trứng" mô tả các ion calci phối hợp với các

10

chuỗi guluronat trong hydrogel calci alginat
Hình 3.1

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của loại và lượng chất diện

24

hoạt đến hiệu suất và kích thước vi nang placebo
Hình 3.2

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ alginat đến hiệu

32

suất tạo vi nang, hiệu suất bao VSV (Hình A) và số lượng
VSV sau đông khô (Hình B)
Hình 3.3

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ alginat đến số


Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của nồng độ chitosan đến số

38

lượng VSV sau đông khô
Hình 3.8

Đồ thị biểu diễn khả năng bảo vệ VSV trong vi nang bao

39

chitosan sau khi ủ 2h trong môi trường acid pH 1,2
Hình 3.9

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của chiotosan đến lượng VSV

40

được giải phóng trong môi trường đệm phosphat pH 7,4
Hình 3.10

Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của điều kiện bảo quản đến
lượng VSV sống sót trong thời gian bảo quản

41


1


Chƣơng 1. TỔNG QUAN
1.1.

Đại cƣơng về probiotics
Thuật ngữ probiotics có nguồn gốc từ Hy Lạp. Theo nghĩa gốc, “biotic” hay

“biosis” xuất phát từ chữ “life” là đời sống và “pro” là thân thiện, nên probiotics có
thể hiểu theo nghĩa là “thân thiện với đời sống con người” [12]. Năm 2002, Tổ chức
Y tế thế giới (WHO) và tổ chức Nông lương thế giới (FAO) đã đưa ra định nghĩa
ngắn gọn và hoàn chỉnh nhất về probiotics như sau: “Probiotics là những vi sinh vật
sống mà khi đưa vào cơ thể với một lượng đủ lớn sẽ đem lại tác động có lợi cho sức
khỏe vật chủ” [12], [19], [36]. Probiotics có thể được sử dụng cho cả con người và
động vật. Những loài vi khuẩn (VK) hay sử dụng trong các chế phẩm probiotics
thuộc chi Bifidobacterium và chi Lactobacillus gồm: Lactobacillus acidophillus,
Lactobacillus

casei,

Bifidobacterium

bifidum,

Bifidobacterium

longum,

Bifidobacterium infantis, Enterococcus faecium,…[54].
Theo đánh giá của tổ chức FAO và WHO, tiêu chuẩn quan trọng nhất để chọn
chủng probiotics là chủng đó phải có khả năng sống sót và phát triển trong đường
ruột. Trong quá trình bảo quản và sử dụng, probiotics bị ảnh hưởng bởi nhiều điều

Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân
của trẻ sơ sinh. L. acidophilus nằm trong chi Lactobacillus, chi lớn nhất của họ VK
lactic với rất nhiều chủng đã được nghiên cứu và ứng dụng trong sản xuất [50].
L. acidophilus có dạng hình roi (hình gậy), rộng 0,6 – 0,9 µm, dài 1,5 – 6,0
µm, tồn tại riêng lẻ hoặc xếp đôi, chuỗi ngắn, không sinh bào tử, không có lông roi,
không di động, không ưa muối, không ưa acid, kỵ khí tùy tiện và có khả năng
chuyển hóa đường lactose tạo ra sản phẩm L (+) lactic acid. Nhiệt độ thích hợp cho
quá trình sinh trưởng là 37oC, có thể phát triển được ở nhiệt độ cao (45oC) không
phát triển trong khoảng 20 - 22oC hoặc nhiệt độ cao hơn 48oC [48].
L. acidophilus là VK vi hiếu khí, do đó môi trường nuôi cấy thường là kỵ khí
hoặc là giảm áp oxy với 5 - 10% CO2. L. acidophilus là đại diện chính của nhóm
VK sinh acid lactic, có khả năng chịu được điều kiện acid trong khoảng pH 5 - 6
trong thời gian 24 - 36h. L. acidophilus phát triển tốt trong điều kiện sức căng bề
mặt thấp và có khả năng kháng lysozyme [9].
1.2.2. Tác dụng của Lactobacillus acidophilus đối với sức khỏe
Nhiều nghiên cứu đã chứng minh L. acidophilus giúp cải thiện chức năng
miễn dịch không đặc hiệu, ức chế sự phát triển của các VK gây bệnh, phòng ngừa


4

bệnh tiêu chảy, hấp thụ ure hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân suy thận, giảm cholesterol
máu và cải thiện khả năng dung nạp lactose [33], [34].
1.3.

Tổng quan về dạng bào chế vi nang

1.3.1. Khái niệm
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, có
kích thước 0,1 µm – 5mm (thông thường từ 100 - 500 µm). Một số tài liệu xếp kích

chất của vi nang [4].


5

Các tính chất của vật liệu làm vỏ vi nang như bám dính, tính thấm, khả năng
hút ẩm, khả năng hòa tan, độ ổn định phải phù hợp với mục đích bào chế vi
nang[65]. Lớp vỏ này phải có khả năng “bẫy”, “nhốt” và bao gói các dược chất,
VSV trong các vi nang nhỏ. Lớp vỏ vi nang có độ bền tương đối để vừa có khả
năng bảo vệ tế bào VK vừa có khả năng giải phóng dược chất khi cần thiết [31].
VK, dược chất được giải phóng theo các cơ chế như: gãy vỡ màng, hòa tan
màng hoặc khuếch tán qua màng,... [31].
1.3.3. Ưu nhược điểm của vi nang hóa probiotics
a. Ưu điểm
Vi nang hóa giúp bảo vệ VK khỏi các yếu tố bất lợi của môi trường như oxy
và điều kiện acid ở dạ dày [55]. Ngoài ra, vi nang làm ổn định hoạt tính trao đổi
chất của tế bào khi có sự thay đổi pH, nhiệt độ hay sự có mặt của các chất ức chế có
trong môi trường lên men do đó làm tăng độ ổn định và kéo dài khả năng tồn tại của
VK [12], [41].
Tăng cường khả năng tồn tại của VK, tạo điều kiện để điều khiển tế bào và
cho phép kiểm soát liều lượng [55]. Vi nang cũng cho phép điều chỉnh tốc độ sinh
trưởng của VSV, cho phép sử dụng tế bào ở một pha riêng biệt đối với môi trường
lên men, do đó có khả năng dừng phản ứng nhanh [12].
Vi nang có khả năng tạo ra mật độ VSV lớn do có thể cố định một lượng lớn
tế bào sống. Phương pháp cố định tế bào VSV dùng trong lên men rượu, bia,… để
sử dụng VSV tiết kiệm, tối ưu và hiệu quả hơn [29], [41].
Quá trình bao gói cũng có thể ngăn chặn các VSV sinh sôi nảy nở trong thực
phẩm để tránh thay đổi các hương vị của sản phẩm [20].
Vi nang hóa dự kiến sẽ kéo dài thời hạn sử dụng của các chế phẩm sinh học ở
nhiệt độ phòng, tăng khả năng chịu nhiệt, tăng khả năng chịu nén, chịu biến dạng và

được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ (coacervat). Sau đó các hạt
coacervat dần kết dính lại với nhau hoặc hấp thụ lên bề mặt chất cần bao gói tạo
thành lớp màng vi nang [4], [8].
Có thể chia thành hai nhóm cơ bản:
Đông tụ đơn giản: Là quá trình loại nước của các chất keo thân nước dùng trong
hệ, do đó làm giảm độ tan của chất keo. Trong phương pháp này thường chỉ sử
dụng một loại polyme (gelatin, polyvinyl alcol, carboxymethyl cellulose). Làm


7

giảm độ tan của chất keo bằng cách: Thêm vào một dung môi có thể trộn lẫn với
nước (ethanol, aceton, isopropanol,…) hoặc thêm vào một muối vô cơ hay thay đổi
nhiệt độ [1].
Đông tụ phức hợp: Là quá trình tương tác giữa các phân tử tích điện âm và tích
điện dương của hai hoặc nhiều hợp chất cao phân tử. Các polyme càng có sự khác
nhau về điểm đẳng điện càng dễ tạo thành hạt đông tụ [4], [8].
Kĩ thuật đông tụ hóa muối còn được biết đến là kỹ thuật ion hóa cố định gel,
ion hóa tạo gel để tạo ra các hạt gel không tan (hydrogel). Trong phương pháp này
các polyanion như alginat kết hợp với các ion đa hóa trị tạo thành các hạt gel có
mạng lưới không gian ba chiều bao gói lấy VSV hoặc có thể kết hợp tạo phức với
các polyanion khác trên bề mặt của hạt gel alginat để tạo lớp màng có độ bền cơ học
cao hơn và ngăn thấm tốt hơn. Hydrogel được bào chế bằng 2 kỹ thuật cơ bản là kỹ
thuật nhỏ giọt và kỹ thuật phun đông tụ.
Kỹ thuật đông tụ hóa muối sử dụng alginat và calci clorid làm chất bao gói có
những ưu điểm sau: đơn giản, dễ làm, chi phí thấp, không phải sử dụng nhiệt độ cao
hoặc các dung môi hữu cơ. Đông tụ cho phép kết hợp một số lượng lớn VSV với
chất bao gói [20], tuy nhiên nhược điểm là gây thất thoát VSV trong quá trình bào
chế. Kỹ thuật nhỏ giọt thường cho các vi nang có kích thước lớn nằm trong khoảng
2 - 5 mm [35]. Đối với kỹ thuật phun đông tụ, sử dụng hệ thống phun dung dịch

được thêm vào sau khi nhũ tương N/D hình thành, ion Ca2+ đi qua pha ngoại vào
tiếp xúc với alginat trong pha nội, quá trình đông tụ xảy ra và vi nang được hình
thành.
Vi nang thu được có kích thước nhỏ hơn kích thước giọt pha nội của nhũ
tương và nằm trong khoảng từ 25 µm đến 2 mm [36].
Phương pháp hóa rắn nhũ tương là một phương pháp thích hợp để vi nang hóa
probiotics trong các vi nang có kích thước nhỏ hơn 1 mm [55], [59]. Loại và lượng
chất diện hoạt cũng như lượng dầu và dung dịch calci clorid có thể ảnh hưởng đến
hiệu suất của quá trình tạo vi nang. Các nghiên cứu gợi ý sử dụng tỷ lệ pha
dầu/alginat là 2: 1 trong bao gói probiotics, Tween 80 được sử dụng như là một chất
diện hoạt trong quá trình tạo vi nang probiotics [55], [59]. Kỹ thuật đông tụ từ nhũ
tương có hiệu quả trong việc giữ số lượng của L. acidophilus LA - 5 và B. bifidum
BB - 12 cao hơn mức tối thiểu điều trị (> 107 cfu/g).


9

Kỹ thuật đông tụ từ nhũ tương tránh sử dụng nhiệt độ cao trong quá trình tạo
nang. Phương pháp này cho tỷ lệ VSV sống cao, kích thước vi nang nhỏ hơn và có
tiềm năng để phát triển thành quy mô lớn [62].
1.5.

Tổng quan một số thành phần sử dụng trong vi nang probiotics

1.5.1. Alginat
a. Cấu tạo
Alginat là một trong các loại chuỗi polysaccharid anion được chiết tách từ loài
tảo nâu Phaeophyta, bao gồm: acid β - 1,4 - mannuronic (chuỗi M) và α - 1,4 - L guluronic (chuỗi G) liên kết với nhau bằng liên kết 1,4 glycosid [42].
b. Đặc điểm, tính chất liên quan đến bào chế vi nang
Độ nhớt: Khác nhau phụ thuộc vào tỷ lệ block M và G có mặt trong khối

vi nang hóa VK bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể thực hiện ở nhiệt
độ thường nên ít ảnh hưởng đến VK sống và gel tạo thành có tính thuận nghịch giúp
giải phóng tế bào bên trong. Hạt vi nang tạo thành đẹp và tương đối đồng đều [11].
Nhược điểm:
Gel alginat rã khi các cation hóa trị II phối hợp được thay thế bằng các cation
hóa trị I hoặc chất tạo phức chelat với Ca2+ và trong môi trường acid thấp. Sự tương
tác giữa các dãy alginat và các cation hóa trị I dẫn đến hiện tượng hòa tan của gel.
Cốt alginat vẫn có cấu trúc ổn định trong môi trường acid thấp, tuy nhiên nếu pH
được hạ xuống dưới giá trị pKa của mannuronic và acid guluronic (3,6 và 3,7)
alginat chuyển thành acid alginic và giải phóng ion Ca2+ [17], [27].
d. Ứng dụng
Alginat được sử dụng trong vi nang hóa tế bào sống, sử dụng trong kỹ thuật cố
định tế bào, cố định enzym [44]. Calci alginat tạo thành có tính trương nở trở lại
phụ thuộc vào pH môi trường nên có thể sử dụng để tạo các vi nang bảo vệ các
dược chất không bền trong môi trường pH dịch vị [50].


11

Ngoài ra trong dược phẩm, alginat được sử dụng trong các dạng bào chế
đường uống, đường bôi ngoài da (làm tá dược dính trong viên nén, tá dược độn
trong viên nang), còn dùng trong các dạng bào chế giải phóng kéo dài [42], [50].
1.5.2. Chitosan
Chitosan là một polyaminosaccarid sinh học tự nhiên thu được từ phản ứng
deacetyl hóa chitin - một polyaminosaccarid rất phong phú trong tự nhiên, là thành
phần cơ bản của lớp vỏ bảo vệ của các động vật giáp xác như tôm, cua,…và thành
tế bào của một số loài như aspegillus, mucor,…[53].
Phân tử lượng từ 3800 đến 2000000 dalton, mức độ acetyl hóa từ 40 đến 98%.
Kích thước tiểu phân, phân tử lượng, tỷ trọng, độ nhớt, mức độ acetyl hóa là những
đặc tính quan trọng ảnh hưởng đến khả năng ứng dụng làm tá dược trong kỹ thuật

đồng nhất. Hỗn hợp trên được nhũ hóa vào 500ml dung dịch dầu thực vật chứa
0,2% Tween 80 và khuấy ở tốc độ 350 vòng/phút trong 20 phút cho đến khi tạo
thành nhũ tương. Thêm 200 ml dung dịch CaCl2 0,1M vào nhũ tương trong khi
đang khuấy để đông tụ tạo thành vi nang. Sự tách pha dầu và nước xảy ra, hỗn hợp
được để yên trong 30 phút để nang lắng xuống đáy cốc, vi nang được thu bằng cách
ly tâm 350 vòng/phút và giữ trong dung dịch pepton 0,1% ở 4oC. Chitosan được hòa
tan trong 90 ml nước có chứa acid acetic, chỉnh thể tích để thu được chitosan 0,4%,
chỉnh pH lên 5,7 - 6,0 bằng NaOH 1N. Sau đó 20g vi nang được ngâm vào 100 ml
dung dịch chitosan và lắc 100 vòng/phút trong 40 phút. Vi nang bao chitosan được
rửa bằng dung dịch pepton và giữ trong dung dịch pepton 0,1% ở 4oC. Nghiên cứu
tiến hành thử khả năng bảo vệ VSV của vi nang trong môi trường acid pH 1,5 có
chứa pancreatin, NaCl và muối mật ở 37oC sau 30, 60, 90 và 120 phút. Kết quả là
bao gói L. casei và B. bifidum trong calci alginat - tinh bột với lớp bao chitosan dẫn
đến khả năng sống tốt hơn so với tế bào tự do sau khi thử trong dung dịch mô phỏng
dịch dạ dày - ruột (pepsin và pancreatin) [39].
Adhikari và cộng sự đã tiến hành bào chế vi nang như sau: 20 ml hỗn dịch tế
bào (1011 cfu/ml) trong nước muối vô trùng 0,85% được thêm vào 60 ml dung dịch
alginat 3% (w/v). Chuẩn bị pha dầu gồm 100 ml dầu đậu nành và 0,1% Tween 80,
đun nóng ở 40°C trong 3 phút. Hỗn dịch alginat - VSV được cho vào pha dầu và
khuấy bằng khuấy từ trong 10 phút. Sau đó cho 150 ml dung dịch CaCl2 0,1M vào
nhũ tương và khuấy đều, vi nang được thu bằng ly tâm. Kết quả cho thấy 94% VSV
đã được bao gói và vi nang làm tăng khả năng sống sót của VSV trong môi trường


13

pH thấp, sau 8 tuần bảo quản ở 18oC số VSV sống sót ổn định khoảng 108 - 109
cfu/g [13].
Muthukumarasamy và Holley đã tiến hành đánh giá khả năng sống sót của
L. reuteri trong vi nang được bào chế bằng phương pháp đông tụ từ nhũ tương. Đầu


Tỷ lệ tinh

Nồng độ

Nồng độ

Nồng độ

dịch lên

alginat

bột

glycerol

chitosan

calci

men
200ml

clorid
2%

2%

15%

Glucose

Trung Quốc

TCNSX

Pepton

Merk - Đức

TCNSX

Cao thịt

Merk - Đức

TCNSX

Cao nấm men

Merk - Đức

TCNSX

Kali dihydro phosphat

Trung Quốc

TKHH


Dinatri citrat

Trung Quốc

TKHH

Natri hydroxyd

Trung Quốc

TKHH

Acid acetic

Trung Quốc

TKHH

Thạch agar

Việt Nam

TCNSX

Nước tinh khiết

Việt Nam

DDVN IV


Trung Quốc

USP38

Span 80

Trung Quốc

USP38

Việt Nam

TCNSX

Lactobacillus acidophilus ATCC 4563

Chitosan

Dầu đậu nành


16

2.1.2. Thiết bị
1. Tủ cấy vô trùng BIOAIR - Euroclone S.p.A - Italy
2. Tủ ấm SANYO CO2 INCUBATOR - SANYO Electric Biomedical - Nhật
3. Tủ lạnh sâu HAIER DW86W420 - Trung Quốc
4. Tủ lạnh Panasonic - Nhật
5. Máy đông khô Christ Alpha - Đức
6. Máy ly tâm lạnh HERMLE Z326K - Đức

 Tỷ lệ pha nội/pha ngoại

 Nồng độ calci clorid

 Nồng độ glycerin