BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI
PHẠM THỊ PHƢƠNG NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI NANG
PROBIOTICS BẰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐÔNG TỤ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
HÀ NỘI - 2015
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI PHẠM THỊ PHƢƠNG
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ VI NANG
PROBIOTICS BẰNG PHƢƠNG PHÁP
ĐÔNG TỤ
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Phạm Thị Phƣơng MỤC LỤC
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Đại cương về probiotics 2
1.2. Loài Lactobacillus acidophilus 3
1.3. Tổng quan về dạng bào chế vi nang 6
1.4. Alginat 11
1.5. Chitosan 12
1.6. Một số nghiên cứu về dạng bào chế vi nang probiotics 14
Chƣơng 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Nguyên vật liệu và thiết bị nghiên cứu 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 18
2.3. Phương pháp nghiên cứu 18
Chƣơng 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23
3.1. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố công thức đến vi nang bào chế được. 23
3.2. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố quy trình bào chế đến vi nang 37
3.3. Theo dõi độ ổn định của vi nang trong quá trình bảo quản 39
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
MT
Môi trường
TCCS
Tiêu chuẩn cơ sở
VK
Vi khuẩn
VSV
Vi sinh vật DANH MỤC CÁC BẢNG
STT
Tên bảng
Trang
1.1
Tỷ lệ sống sót của A. aerogenes khi được bảo quản với glycerol ở
-20
o
C
15
2.1
32
3.7
Đặc tính vi nang bào chế được khi thay đổi nồng độ chitosan
33
3.8
Kết quả bảo vệ L. acidophilus của alginat và chitosan trong môi
trường acid pH 1,2.
34
3.9
So sánh khả năng bảo vệ VSV trong môi trường acid của các mẫu
36
3.10
Bảng công thức tốt nhất CT35
36
3.11
Đặc tính của vi nang bào chế được khi thay đổi thời gian ủ
37
3.12
Đặc tính của vi nang bào chế khi thay đổi tốc độ khuấy môi trường
38
3.13
Đặc tính của vi nang bào chế khi thay đổi tốc độ nhỏ giọt
39
3.14
Bảng biến thiên số lượng VSV và hàm ẩm trong thời gian bảo quản
40
3.4
Đồ thị biểu diễn số lượng VSV sống sót trong môi trường acid
35
3.5
Đồ thị biến thiên số lượng VSV và hàm ẩm trong thời gian
bảo quản
40
1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Vi khuẩn probiotics được biết đến là một nhóm vi sinh vật mang lại nhiều lợi
ích cho con người: ngăn ngừa nhiễm khuẩn đường ruột, cải thiện khả năng dung nạp
lactose, tăng cường miễn dịch, hấp thụ ure hỗ trợ điều trị cho người bị suy thận,
giảm cholesterol máu…[19], [23], [26]. Tuy nhiên, vi sinh vật này dễ bị ảnh hưởng
bởi các yếu tố như: pH, nhiệt độ, ánh sáng, hàm ẩm…[48]. Những yếu tố này giảm
số lượng sống sót, ngăn cản việc thiết lập cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột [39].
Do đó, để đảm bảo số lượng vi sinh vật trong chế phẩm và đem lại tác dụng
mong muốn, cần tạo ra những nguyên liệu có khả năng cung cấp lượng vi sinh vật
phù hợp và có thể chất thích hợp. Hiện nay, các dạng bào chế probiotics thông dụng
trên thị trường là dạng bột và cốm. Tuy nhiên, việc đảm bảo số lượng vi sinh vật
sống sót và bảo vệ chúng khi sử dụng đường uống là vấn đề lớn do khi sử dụng các
vi sinh vật phải chịu tác động của các yếu tố bất lợi như: pH acid của dạ dày,
enzyme tiêu hóa, muối mật…[23]. Nhiều phương pháp bào chế đã được nghiên cứu
để giảm thiểu ảnh hưởng các yếu tố nêu trên đến vi khuẩn probiotics, trong đó có
phương pháp vi nang hóa.
Vi nang hóa giúp tăng độ ổn định hoạt tính trao đổi chất của tế bào khi só sự
thay đổi nhiệt độ, pH hay sự có mặt của các chất ức chế trong môi trường. Do đó,
làm cho tế bào kéo dài khả năng tồn tại và tăng độ ổn định. Từ các lý do trên, đề tài:
“Nghiên cứu bào chế vi nang probiotics bằng phương pháp đông tụ” được thực
6
cfu/ml tế bào vi
sinh vật sống cho đến ngày hết hạn sử dụng [15], [36].
Probiotics đem lại nhiều tác dụng có lợi cho cơ thể vật chủ, nhưng hiểu biết
của con người về cơ chế tác dụng của các vi khuẩn probiotics còn rất hạn chế. Một
số tác giả cho rằng vi khuẩn probiotics ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây
bệnh trong đường tiêu hóa. Các cơ chế cụ thể được nêu ra như: cạnh tranh chất dinh
dưỡng, cạnh tranh vị trí bám dính trên niêm mạc ruột, ức chế sự phát triển của vi
khuẩn có hại bằng kích thích hệ thống miễn dịch ruột, bằng các sản phẩm trao đổi
chất của vi khuẩn probiotics [17], [18].
3
Trong thời gian gần đây, đã có sự gia tăng mạnh mẽ về số lượng các sản phẩm
y tế có nguồn gốc từ probiotics. Probiotics ngày càng được bào chế dưới nhiều dạng
chế phẩm khác nhau sử dụng theo đường uống như bột, cốm, viên nang, pellet… và
còn sử dụng cho đường khác như viên đặt, kem bôi da. Tuy nhiên, nhiều báo cáo
chỉ ra rằng số lượng các vi khuẩn probiotics trong các chế phẩm này rất nghèo nàn.
Để cải thiện số lượng vi khuẩn sống sót trong suốt quá trình bảo quản và ở môi
trường có độ pH thấp trong cơ thể, trên thị trường đã có các sản phẩm probiotics
được bao tới thế hệ 1,2,3…[2].
Thế hệ 1
Không bao như cốm, pellet…( Non – Coated)
Thế hệ 2
Bao tan trong ruột (Enteric – Coated)
Thế hệ 3
Vi nang hóa (Microencapsulated)
Thế hệ 4
1.2.2. Tác dụng của Lactobacillus acidophilus đối với sức khỏe
a. Cải thiện chức năng miễn dịch không đặc hiệu
Các VK sinh acid lactic có thể tăng các đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu như
chức năng thực bào, tăng hoạt động các tế bào NK – natural killer cells và các đáp
ứng miễn dịch đặc hiệu (hoạt động sản xuất kháng thể, cytokinase, tăng sinh các tế
bào lympho,…) của vật chủ. Sự gia tăng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu (hoạt
động thực bào của bạch cầu hạt) đã được ghi nhận ở những người tình nguyện sau
khi sử dụng hỗn hợp probiotics gồm Lactobacillus acidophilus và Bifidobacterium
bifidum [23].
b. Ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh
L. acidophilus có tác dụng ức chế sự phát triển của các VK gây bệnh đường
ruột như Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Yersinia enterocolitica
và Clostridium perfringens thông qua cơ chế kháng VSV. Bằng cách cạnh tranh
chất dinh dưỡng, năng lượng cũng như vị trí bám lên niêm mạc ruột của các VK gây
bệnh và sinh ra các chất có tác dụng kháng khuẩn làm cho VK có hại không phát
triển được như: các barteriocin (như: nisin, lactobrevin, acidophilin, acidolin,
lactobacillin, lactocidin và lactolin), acid lactic, acid acetic, hydrogen peroxid,
carbon dioxid, diacetyl…[23].
c. Phòng ngừa bệnh tiêu chảy
Đã có nhiều nghiên cứu cho thấy rằng, probiotics có tác dụng điều trị trong
các trường hợp tiêu chảy do sử dụng kháng sinh ở người lớn, tiêu chảy khi đi du
lịch, cũng như tiêu chảy ở trẻ em do rotavirus. Khi sữa có chứa L. acidophilus,
5
S.thermophiles và B. longum được dùng cho những bệnh nhân cao tuổi bị tiêu chảy
do thường xuyên dùng thuốc xổ, tần suất tiêu chảy của người bệnh đã giảm xuống,
đồng thời tình trạng bệnh tiêu chảy cũng được cải thiện [10], [23].
d. Hấp thụ ure hỗ trợ điều trị cho bệnh nhân suy thận
Theo nghiên cứu in vitro của Satya Prakash và cộng sự, tác giả đã tiến hành
thử nghiệm: vi nang alginat - chitosan bao gói VK Lactobacillus acidophilus và vi
lactase để dung nạp lactose. Do đó làm giảm lactose bị phân hủy dẫn đến giảm hình
thành các loại khí gây đầy hơi như khí hydro [26].
L. acidophilus trong các thử nghiệm in vitro gây đối kháng lại sự phát triển
của các loại VK sản sinh ra khí. Do các VK này bị ức chế bởi các lactobacilli do
L. acidophilus sinh ra [26].
L. acidophilus là VK lên men đồng hình, chuyển các loại đường hexose thành
acid lactic và không sinh khí. Khi tỷ lệ VK lên men đồng hình tăng lên, thì lượng
khí sinh ra từ các VK lên men dị hình sẽ giảm xuống [26].
1.3. Tổng quan về dạng bào chế vi nang
1.3.1. Khái niệm
Vi nang (microcapsule) là những tiểu phân hình cầu hoặc không xác định, có
kích thước từ 0,1 µm tới 5 mm (thông thường từ 100 - 500 µm). Các vi nang được
bào chế qua quá trình bao dược chất lỏng hoặc rắn bằng một màng bao mỏng
polyme liên tục [4].
Xét về hình thái học, có thể chia thành 2 loại:
Vi nang (microcapsule): hệ thống có cấu trúc kiểu “bình chứa “ (reservoir),
gồm nhân và vỏ xác định. Nhân có thể ở dạng rắn, lỏng, khí. Vỏ là một màng
polyme (có thể một hoặc nhiều polyme) liên tục, có cấu trúc xốp hoặc không [20].
Vi cầu (microsphere): cấu trúc đồng nhất hoặc nguyên khối tạo nên bởi chất
nền liên tục (một hoặc nhiều polyme hòa trộn với nhau), phân tử thuốc được phân
tán vào chất nền (matrix) [20].
Trên thực tế, sự phân biệt trên chỉ là tương đối [4], [5].
1.3.2. Cấu tạo, thành phần, đặc điểm
Vi nang được cấu tạo bởi hai thành phần:
7
Phần nhân: gồm một hoặc nhiều dược chất. Dược chất rất phong phú, đa
dạng, có thể ở trạng thái rắn, lỏng hoặc dưới dạng một nhũ tương, hỗn dịch, có thể
thêm các chất phụ nhằm mục đích ổn định hoặc điều chỉnh tốc độ giải phóng dược
chất [4], [14], [20], [47].
[40], [28].
Nhƣợc điểm
Trong quá trình trao đổi chất, tế bào VSV sản sinh ra nhiều enzym trong đó có
những enzym có thể xúc tác các phản ứng không mong muốn làm tổn hại đến lớp
vật liệu vi nang và cả chính tế bào [49].
Đa số các vật liệu vi nang như thạch, gelatin…đều là những nguồn dinh dưỡng
mà VSV có thể tiêu hóa được. Điều này dẫn đến nhược điểm là VSV được bao gói
bên trong hoặc VSV tạp nhiễm từ bên ngoài có thể tiêu hóa làm cho lớp vi nang bị
rách, thủng và như vậy hiệu quả vi nang hóa sẽ giảm xuống đáng kể.
1.3.4. Phương pháp bào chế vi nang
Có nhiều phương pháp chế tạo vi nang. Về nguyên tắc, phương pháp chung
chế tạo vi nang không bắt buộc phải có những thiết bị riêng. Việc lựa chọn phương
pháp chế tạo phụ thuộc vào điều kiện thực tế như độ tan, tính tương đồng, kích
thước vi nang…[4].
Có thể tạm phân chia như sau:
Phương pháp hóa lý: đông tụ (đơn giản, phức hợp); sử dụng các polyme không
tương thích; bốc hơi dung môi; sử dụng chất lỏng siêu tới hạn…
Phương pháp cơ lý: ly tâm, bao tầng sôi, xát hạt tầng sôi quay tròn, nồi bao
viên thông thường, phun sấy…
Phương pháp hóa học: polyme hóa (tương tác các polyme, polyme hóa bề
mặt)…[14].
Một số phương pháp được trình bày cụ thể sau:
Phƣơng pháp tách pha đông tụ
Nguyên tắc: tách pha nhờ sự thay đổi nhiệt độ, thay đổi pH, sự muối hóa hoặc
khi thêm một dung môi thứ hai vào hệ tạo vi nang, làm thay đổi độ tan của polyme,
kết quả là hình thành một pha mới. Lúc này, hệ trở thành hai pha, một pha có nồng
9
độ cao chất keo được tách ra dưới dạng giọt nhỏ gọi là các giọt đông tụ (coacervat).
Sau đó các hạt coacervat dần kết dính lại với nhau hoặc hấp thụ lên bề mặt chất cần
nang có kích thước lớn. Đối với kỹ thuật phun đông tụ sử dụng hệ thống phun dung
dịch alginat dưới áp suất không khí tạo các giọt nhỏ và trở thành đông tụ khi gặp
môi trường có tác nhân liên kết chéo. Kỹ thuật này cho vi hạt có kích thước bé (5 -
15µm) nhưng yêu cầu bắt buộc là phải có thiết bị thích hợp, tốn kém, khả năng tắc
nghẽn cao [33].
Đã có nhiều nghiên cứu về vấn đề này, Himanshu K. Solanki cùng các cộng sự
đã tạo vi nang probiotics trên cơ sở nguyên tắc đông tụ do tạo muối (phương pháp
gel ion ngoại). Thử nghiệm được tiến hành gồm các bước: Chuẩn bị hỗn dịch
alginat có chứa sinh khối, với nồng độ alginat từ 1 – 2%, dùng kim tiêm để nhỏ vào
dung dịch calci clorid 0,005 – 1,5M, đường kính của hạt phụ thuộc vào nồng độ, độ
nhớt của dung dịch alginat, khoảng cách giữa đầu kim với dung dịch alginat, đường
kính trong của đầu kim nhỏ giọt. Đường kính vi nang tạo ra trong khoảng từ 500µm
đến 3mm [42].
Maria Chavarri và các cộng sự đã tạo vi nang probiotics bằng phương pháp
đông tụ tạo muối. Sinh khối sau khi lên men thu được bằng cách ly tâm L. gasseri
và B. bifidum với tốc độ 1500 xG trong 5 phút ở nhiệt độ thấp (4
o
C), sau đó sinh
khối thu được phối hợp vào 10ml dung dịch alginat 2% tạo hỗn dịch đồng nhất. Hỗn
dịch này được phun vào dung dịch chitosan - calci clorid với nồng độ chitosan 0,4%
(kl/tt) và calci clorid 0,1M. Các hạt vi nang được làm lạnh ở -20
o
C, được đông khô
ở nhiệt độ -40
o
C trong 18h. Hạt vi nang sau đông khô được bảo quản ở trong bình
kín với nhiệt độ thấp (4
o
C) [13].
Kỹ thuật hóa rắn nhũ tƣơng
các phần gấp khúc tạo thành khoảng không gian giống như chỗ đặt trứng. Các ion
Ca
2+
khớp vào các chỗ trống này tạo nên mạng lưới không gian ba chiều. Với cấu
trúc gel này, khi sử dụng làm màng bao, chúng có vai trò như một tấm chắn chống
lại những tác động bất lợi của môi trường và cho phép giải phóng vật liệu được bao
gói theo cách kiểm soát được [29].
12
c. Ƣu, nhƣợc điểm của vật liệu bao vi nang alginat đối với probiotics
Sử dụng alginat làm vật liệu bao vi nang có nhiều ưu điểm. Alginat là vật liệu
an toàn, không độc với cơ thể, có khả năng tạo chất kết dính với calci clorid [29].
Alginat dễ dàng tạo gel bao bọc các tế bào vi khuẩn, lớp gel tạo thành có độ ổn định
cao. Quá trình vi nang hóa vi khuẩn bằng alginat thực hiện dễ dàng, đơn giản, có thể
thực hiện ở nhiệt độ thường nên ít ảnh hưởng đến vi khuẩn sống và gel tạo thành có
tính thuận nghịch giúp giải phóng tế bào bên trong. Hạt vi nang tạo thành đẹp và
tương đối đồng đều [12], [21].
Tuy nhiên, sử dụng alginat để vi nang hóa tế bào VSV cũng có một số nhược
điểm. Độ bền gel phụ thuộc vào một số ion hóa trị I và các chất tạo phức với ion
Ca
2+
. Vì vậy, khi sử dụng lên men lactic, các yếu tố tạo phức như lactat có thể làm
giảm độ bền của gel calci alginat và làm cho các tế bào thoát ra ngoài [12], [21].
d. Ứng dụng trong vi nang
Alginat được sử dụng trong vi nang hóa tế bào sống, sử dụng trong kỹ thuật cố
định tế bào, cố định enzym [16]. Calci alginat tạo thành có tính trương nở trở lại
phụ thuộc vào pH môi trường nên có thể sử dụng để tạo các vi nang bảo vệ các
(muối glutamat, clorid) tan trong nước. Chitosan không tan trong môi trường kiềm,
môi trường trung tính. Đặc tính này được ứng dụng để chế tạo vi cầu, vi nang
chitosan [41].
Chitosan có mức độ deacetyl hóa thấp (40%) có thể tan được trong môi trường
pH dưới 9,0 trong khi loại có mức độ deacetyl hoá cao (85%) chỉ có thể tan được
trong môi trường pH dưới 6,5 [24]. Do có các nhóm amin tự do, chitosan mang điện
tích dương và có thể phản ứng với các phân tử mang điện tích âm và tạo phức với
ion kim loại như Cobalt…[41].
14
1.6. Một số nghiên cứu về dạng bào chế vi nang probiotics
Theo nghiên cứu của Sepideh Abbaszadeh và các cộng sự, đã tiến hành tạo vi
nang L. rhamnosus sử dụng chitosan- alginat như sau: sinh khối sau lên men, ly tâm
ở tốc độ 3200xg trong 10 phút ở 4
o
C để thu sinh khối và rửa sinh khối VK 2 lần
bằng cách ly tâm với dung dịch nước muối sinh lý NaCl 0.9%. Dùng 5ml dung dịch
nước muối sinh lý đã tiệt khuẩn để thu sinh khối trong các ống ly tâm. Phân tán sinh
khối vào 10ml dung dịch alginat (các nồng độ 20,30,40 g/L) bằng khuấy từ [38].
Dung dịch chitosan với các nồng độ (2,4 và 10 g/L) được phân tán vào 90ml
nước cất được acid hóa bằng 0,4ml acid acetic băng, điều chỉnh về pH 5,7 – 6 bằng
dung dịch NaOH 0,1M. Lọc qua giấy lọc để loại cặn, sau hấp tiệt khuẩn ở 121
o
C
trong 15 phút. Hỗn dịch sinh khối – alginat được đùn qua đầu kim có kích thước
0,11mm vào dung dịch CaCl
2
0,1M đã hấp tiệt khuẩn. Hạt được ủ trong 30 phút,
khuấy từ với tốc độ 100 rpm. Sau đó, rửa sạch hạt, ủ hạt trong dung dịch chitosan
chitosan - alginat khả năng tồn tại cao hơn với việc bao gói trong alginat [13].
Theo nghiên cứu của Postgate và Hunter: trong quá trình đông khô, tiền đông
A. aerogenes và đông khô ở nhiệt độ thấp thì số lượng VSV sống sót giảm. Tác giả
sử dụng glycerol 10% (kl/tt) làm chất bảo vệ VK A.aerogenes trong quá trình đông
khô và bảo quản ở nhiệt độ thấp. Khi sử dụng glycerol làm chất bảo vệ, tỉ lệ
A.aerogenes sống sót sau đông khô và bảo quản ở -20
o
C như sau:
Bảng 1.1: Tỷ lệ sống sót của A. aerogenes khi được bảo quản với glycerol ở -20
o
C
Thời gian bảo quản (ngày)
0
2
6
10
20
27
40
Tỉ lệ VSV sống sót (%)
95
92
91
86
92
85
85
Thử nghiệm cho thấy, khi dùng glycerol với nồng độ10 - 15% thì lượng VSV
sống sót sau đông khô lớn, dùng glycerol với nồng độ <2% không có ý nghĩa bảo
vệ. Tuy nhiên, khi dùng với nồng độ >30% làm giảm tỷ lệ sống sót của VSV [34].
Cao thịt
Merk – Đức
TCCS
Cao nấm men
Merk – Đức
TCCS
Kali dihydro phosphat
Trung Quốc
TCCS
Magnesi sulfat heptadihydrat
Trung Quốc
TCCS
Triamoni citrat
Trung Quốc
TCCS
Natri acetat
Trung Quốc
TCCS
Natri clorid
Trung Quốc
TCCS
Mangan sulfat tetrahyrat
Trung Quốc
TCCS
Natri citrat
Trung Quốc
TCCS
Natri hydroxyd
Trung Quốc
TCCS
TCCS
2.1.2. Thiết bị
Bảng 2.3: Các thiết bị dùng trong nghiên cứu
Tên thiết bị
Nguồn gốc
Bơm nhu động
Đức (Longer pump)
Tủ cấy vô trùng
Nhật (Sanyo)
Tủ ấm CO
2
Nhật (Sanyo)
Tủ lạnh sâu
Đức
Tủ lạnh LG
Hàn Quốc
Thiết bị đông khô (Christ alpha)
Đức (Alpha)
Máy ly tâm
Đức
Nồi hấp tiệt khuẩn
ALP – Nhật
Cân phân tích
Đức (Sartorius)
Cân kỹ thuật
Đức (Sartorius)
Máy đo hàm ẩm
Mỹ (Ohaus)
Máy khuấy từ
trình bảo quản.
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp nhân giống
Cân, đong các thành phần trong công thức môi trường MRS lỏng (công thức
trong bảng 2.4). Hòa tan, phân tán hết các thành phần. Hút 10,0ml MRS lỏng vào
mỗi ống nghiệm, đậy kín ống nghiệm (ống thủy tinh, kích thước 1,5 x 20cm). Hấp
tiệt khuẩn môi trường ở nhiệt độ 115
o
C trong 20 phút. Để nguội, cấy giống vào các
ống nghiệm trên. Ủ trong tủ ấm ở điều kiện 37
o
C, 5% CO
2
trong 24 giờ [6].
Thể tích sinh khối tế bào
Nồng độ glycerol
Nồng độ alginat
Tỷ lệ tinh bột
Nồng độ dung dịch CaCl
2
Nồng độ dung dịch chitosan
Copyright: Tài liệu đại học ©