BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGÔ THỊ BÍCH PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG
PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI – 2013
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
NGÔ THỊ BÍCH PHƯỢNG

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B BẰNG PHƯƠNG
PHÁP BỐC HƠI PHA ĐẢO

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ



Hà Nội, tháng 5 năm 2013
Sinh viên

Ngô Thị Bích Phượng
MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Amphotericin B 2
1.1.1. Công thức hóa học 2
1.1.2. Đặc tính lý hóa 2
1.1.3. Tác dụng dược lý 3
1.1.4. Dược động học 3
1.1.5. Chỉ định 3
1.1.6. Tác dụng không mong muốn 4
1.1.7. Liều dùng 4
1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 4
1.2. Liposome 5
1.2.1. Khái niệm 5
1.2.2. Thành phần 5
1.2.3. Ưu nhược điểm 8
1.2.3.1. Ưu điểm 8
1.2.3.2. Nhược điểm 8
1.2.4. Độ ổn định 9

nhau… 27
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố thuộc về công thức bào
chế đến đặc tính của liposome AMB 28
3.3.1. Bố trí thí nghiệm 28
3.3.2. Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB 28
3.3.2.1. Hình thức, hình thái, phân bố KTTP của liposome AMB 28
3.3.2.2. Hiệu suất liposome hóa 32
3.3.2.3. Tính ổn định của liposome AMB 34
3.4.

Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ dược chất trong công thức đến đặc
tính của liposome 37

3.5.

Bàn luận 39

3.5.1.

Về phương pháp định lượng AMB 39

3.5.2.

Về phương pháp bào chế 39

3.5.3.

Về phương pháp đánh giá hiệu suất liposome hóa 40

3.5.4.

DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT

Viết tắt Từ/ cụm từ đầy đủ
1 AMB Amphotericin B
2 Chol Cholesterol
3 DĐVN Dược điển Việt Nam
4 DMPC α-Dimyristoylphosphatidylcholin
5 DMPG l-α-Dimyristoylphosphatidylglycerol
6 DSC Phân tích nhiệt vi sai (Differential scanning calorimetry)
7 DSPC Distearoylphophatidylcholin
8 DSPG Distearoylphosphatidylglycerol
9 EDTA Ethylendiamin tetraacetic acid
10 HPLC Sắc kí lỏng hiệu năng cao (high performance liquid
chromatography)
11 HSPC Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (Hydrogenated soy
phosphatidylcholine)
12 IC50 Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử (50 % inhibitory
concentrations)
13 KTTP Kích thước tiểu phân
14 N/D Nước/dầu
15 NSX Nhà sản xuất
16 PDI Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)
17 RBCPR Chỉ số giải phóng kali ra khỏi tế bào hồng cầu (red blood cell
potassium release)
18 SPC Phosphatidylcholin đậu nành (Soy phosphatidylcholine)
19 TEM Kinh hiển vi điện tử truyền qua (Transmission electron
microscope)
20 TKHH Tinh khiết hóa học
21 USP United state Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)

(extrusion)
16
Hình 2.1 Sơ đồ tóm tắt các giai đoạn của quy trình bào chế liposome
AMB
20
Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa nồng độ AMB và diện tích
peak
26
Hình 3.2 Hỗn dịch liposome AMB sau khi bào chế 29
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn KTTP của các mẫu liposome AMB 30
Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome
nhóm A
30
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn KTTP, phân bố KTTP của các mẫu liposome
nhóm B
30
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu liposome 33
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP của các mẫu liposome sau 1
tuần bảo quản
35
Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của các
mẫu liposome sau 1 tuần bảo quản
36
Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP của các mẫu có tỷ lệ
% mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau
38
Hình 3.10

Đồ thị biểu diễn hiệu suất liposome hóa của các mẫu có tỷ lệ %
mol dược chất/tổng lượng lipid khác nhau
2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Amphotericin B
1.1.1. Công thức hóa học

Công thức phân tử: C
47
H
73
NO
17
.
Khối lượng phân tử: 924,08.
pK
a
: 5,5; 10 [2].
1.1.2. Đặc tính lý hóa
 Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng da cam.
- Độ tan: không tan trong nước ở pH từ 6 đến 7, tan trong dimethylsulphoxid (30 –
40 mg/ml) và propylene glycol, khó tan trong dimethylformamid (2 – 4 mg/ml),
rất khó tan trong methanol [2].
 Hóa tính: Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin
và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau:
- Tính lưỡng tính.
- Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các dung
dịch kiềm.

- Phòng nhiễm nấm cho bệnh nhân sốt kéo dài và giảm bạch cầu trung tính đã điều
trị lâu bằng kháng sinh phổ rộng hoặc sau điều trị ung thư bằng hóa chất.
- Dạng liposome hoặc phức hợp lipid: chỉ định cho trường hợp điều trị thất bại
bằng AMB thông thường hoặc trường hợp AMB có thể gây độc cho thận hoặc
gây suy thận [3].

4

1.1.6. Tác dụng không mong muốn
- Phản ứng chung: sốt, rét run, đau đầu, đau cơ khi mới tiêm truyền.
- Độc với thận: giảm sức lọc cầu thận, hoại tử thận.
- Tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, độc với gan, tim, giảm K
+

và
Mg
2+
huyết… [3].
1.1.7. Liều dùng
Đường tiêm tĩnh mạch:
- AMB thông thường: bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1
mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách
1 ngày.
- AMB dạng liposome: bắt đầu với liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3-4
mg/kg/ngày.
- Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày.
Đường uống:
- Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100 mg/ml.
+ Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1ml/lần ×4 lần/ngày, giữ thuốc
trong miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày.

Amphotec
50 mg,
100 mg

phức hợp AMB với
cholesteryl sulfate
phức hợp
lipid
bột đông
khô
5

(tỷ lệ mol 1:1)
4
Ambisome

50 mg HSPC:DSPG:Chol:AMB
(tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4)
liposome bột đông
khô
1.2. Liposome
1.2.1. Khái niệm
Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân nước ở
giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có
kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [1].

Hình 1.1. Cấu trúc của liposome
1.2.2. Thành phần
Phospholipid
Là thành phần cơ bản cấu tạo nên tiểu phân liposome, là những phân tử

làm giải phóng các thành phần bên
trong ra ngoài môi trường [5]. Liposome sử dụng trong điều trị cần ổn định trong
điều kiện sinh lí, do đó nên sử dụng các phospholipid có T
c
> 37 ºC [4].

7 Cholesterol
Cholesterol và các dẫn chất được sử dụng trong bào chế liposome với vai trò
làm tăng tính cứng và giảm tính thấm của lớp màng lipip đối với các chất mang
[18].
Màng phospholipid kép tồn tại ở 2 trạng thái: trạng thái gel và trạng thái tinh
thể lỏng. Ở trạng thái gel, mạch hydrocacbon ở dạng cấu hình trans (hình 1.3), diện
tích không gian giữa các phân tử phospholipid nhỏ nhất, độ dày của màng lipid kép
cao nhất, chuyển động quay của phân tử hạn chế ở mức tối đa. Ở trạng thái tinh thể
lỏng, mạch hydrocacbon ở dạng cấu hình gauche (hình 1.3), diện tích không gian
giữa các phân tử lớn hơn, màng lipid kép lỏng lẻo hơn, chuyển động quay nội phân
tử và giữa các phân tử diễn ra mạnh hơn. Quá trình chuyển trạng thái của lớp màng
lipid khi không có cholesterol diễn ra trong khoảng nhiệt độ hẹp. Sự có mặt của
cholesterol làm nới rộng khoảng chuyển pha, giảm enthalpy chuyển pha, giảm diện
tích không gian giữa các phân tử, giảm chuyển động quay của các hydrocacbon, làm
cho các phân tử phospholipid sắp xếp một cách có trật tự và tạo thành một lớp màng
lipid kép cứng chắc hơn [13].

Hình 1.3. Cấu trúc của phospholipid ở dưới và trên nhiệt độ chuyển pha
Cholesterol còn giúp làm tăng tính ổn định của liposome trong các dịch sinh
học như huyết tương. Liposome không chứa cholesterol sẽ tương tác nhanh với các
protein trong huyết tương như albumin, transferin, macrogloburin. Các protein này

nguồn nguyên liệu tự nhiên, do đó rất khó kiểm soát mức độ tinh khiết của nguyên
9

liệu. Phospholipid có thể lẫn các lysophospholipid hoặc các sản phẩm của quá trình
oxy hóa phospholipid [21].
Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để
hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng cũng như môi trường
[25].
Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về mặt vật lí và hóa học [21].
Hầu hết các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng
thí nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn [21].
Hiện vẫn chưa có thông tin đầy đủ về mức độ an toàn của các chế phẩm
liposome. Ví dụ như: hội chứng tay chân (“hand and foot” syndrome) không xuất
hiện khi sử dụng doxorubicin dạng tự do nhưng lại được tìm thấy khi sử dụng
liposome doxorubicin tuần hoàn kéo dài [21].
1.2.4. Độ ổn định
Liposome được coi là dạng bào chế kém ổn định cả về mặt vật lí, hóa học và
sinh học. Sự thay đổi đặc tính lí hóa của liposome có thể xảy ra ngay trong quá trình
bào chế cũng như trong quá trình bảo quản.
Về mặt hóa học: sự kém ổn định về mặt hóa học của liposome là do quá trình
oxy hóa chuỗi acid béo không no của phân tử phospholipid và quá trình thủy phân
liên kết ester của phospholipid tạo ra các lysophospholid. Có thể dùng các kĩ thuật
sắc kí khác nhau để đánh giá mức độ tinh khiết, định tính, định lượng lipid trong
liposome [5].
Về mặt vật lí: sự thay đổi đặc tính vật lí của liposome do quá trình thấm
thuốc qua màng và do sự có mặt của các thành phần tích điện trên bề mặt gây ra
hiện tượng kết tụ tiểu phân trong quá trình bảo quản. Trạng thái vật lí của liposome
có thể được đánh giá thông qua các chỉ số: kích thước tiểu phân và thế Zeta [5]. Thế
Zeta cho biết mức độ tích điện trên bề mặt tiểu phân liposome. Nếu tiểu phân tích
điện lớn thì lực đẩy tĩnh điện mạnh, các tiểu phân cách xa nhau và hạn chế quá trình

11 Hình 1.4. Cơ chế hình thành liposome bằng phương pháp bốc hơi pha đảo
Ưu điểm của phương pháp này là tạo ra các tiểu phân liposome chứa 1 thể
tích khoang nước lớn và do đó tăng hiệu suất gắn thuốc đối với các dược chất tan
trong nước. Phương pháp này rất phù hợp để bào chế các tiểu phân liposome mang
các chất có cấu trúc phân tử cồng kềnh, kích thước lớn như albumin, các
phosphatase kiềm, ferritin. Tuy nhiên, nhược điểm của phương pháp là tạo ra các
liposome có kích thước lớn, không đồng nhất và có sự phơi nhiễm với dung môi
hữu cơ [23].
1.3.2. Giảm kích thước tiểu phân liposome
Mục đích của quá trình này là tạo ra liposome có kích thước nhỏ và phân bố
kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lí, cải thiện hình thức cho
chế phẩm, đồng thời cho phép lọc loại khuẩn liposome và sử dụng liposome bằng
đường tiêm tĩnh mạch [23].
Hơn nữa, KTTP là một trong những yếu tố quyết định tỷ lệ liposome bị bắt
giữ bởi hệ thống đại thực bào (RES), quá trình opsonin hóa liposome có kích thước
nhỏ (< 100 nm) diễn ra chậm hơn các liposome có kích thước lớn (> 100 nm). Các
liposome có kích thước nhỏ có thể dễ dàng đi qua các khe kẽ trên màng tế bào vào

12

trong bào tương và phát huy tác dụng tại tế bào đích. Như vậy, KTTP ảnh hưởng tới
hiệu quả điều trị của dạng thuốc [17].
Hai phương pháp chính hay được sử dụng để làm giảm KTTP là siêu âm
(sonication) và đùn ép qua màng (extrution):
Với phương pháp siêu âm, liposome được làm nhỏ nhờ năng lượng của sóng
siêu âm, thu được các tiểu phân kích thước nhỏ và tương đối đồng nhất. Nhược
điểm của phương pháp: gây hiện tượng tăng nhiệt cục bộ trong quá trình siêu âm và

bị rửa giải trước các phân tử dược chất không gắn vào liposome [23].
Ly tâm (centrifugation)
Có 3 kiểu ly tâm được ứng dụng để tinh chế liposome: ly tâm vi phân, ly tâm
theo gradient tỷ trọng và ly tâm có sử dụng các lưới lọc phân tử. Điều kiện li tâm tối
ưu phụ thuộc vào loại lipid, loại liposome, hệ đệm và nhiệt độ [23].
Với các dược chất tan trong dầu:
Dược chất tan trong dầu khi tách khỏi lớp màng lipid kép sẽ tồn tại dưới
dạng tinh thể hoặc dạng vô định hình. Để tách loại các tinh thể dược chất ra khỏi
liposome có thể li tâm hỗn dịch trong 10 – 30 giây ở tốc độ cao, khi đó những tinh
thể dược chất bị lắng xuống. Phương pháp này yêu cầu đánh giá lại nồng độ
phospholipid sau quá trình li tâm để khẳng định liposome không bị lắng xuống
trong quá trình li tâm. Ngoài ra, có thể đùn ép hỗn dịch liposome qua màng
polycacbonat có kích thước lỗ lọc dưới 100 nm để loại tinh thể dược chất, khi đó
chỉ có liposome có tính chất mềm dẻo đi qua màng lọc còn tinh thể dược chất thì
không. Nhược điểm của phương pháp là sử dụng lực nén lớn trong quá trình đùn ép
làm tăng sự tách pha của dược chất ra khỏi lớp màng lipid kép [23]. 14

1.4. Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B
Pleumchitt Rojanapanthu cùng cộng sự đã nghiên cứu đặc tính lý hóa của
liposome amphotericin B bào chế từ phosphatidylcholin (PC), cholesterol bằng
phương pháp bốc hơi pha đảo, sử dụng tỷ lệ diethylether: dung dịch NaCl 0,9 % là
3:1 v/v, siêu âm trong 5 phút ở 7 ºC, bốc hơi ở 25 ºC để loại ether. Đánh giá hiệu
suất liposome hóa bằng kĩ thuật thẩm tích qua màng thẩm tích (molecular cutoff
12000 dalton), môi trường thẩm tích là dung dịch NaCl 0,9 %, ở 30 ºC, có khuấy từ.
Kết quả cho thấy, liposome chứa 2 % mol AMB trên tổng lượng lipid cho hiệu suất
gắn thuốc cao nhất (khoảng 95%), KTTP trong khoảng 1307 – 1451 nm với tỷ lệ
PC: chol là 1:1. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, khi tăng tỷ lệ % về số mol AMB/tổng

100 nm, thế zeta -43,3 ± 2,8 mV và hiệu suất gắn thuốc trên 95 % đối với tất cả các
mẫu, khả năng giải phóng dược chất in vitro trong 24 giờ và giá trị IC50 của 2 công
thức hầu như không có sự khác biệt so với chế phẩm Ambisome [20].
A. Manosroi cùng cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB với
nguyên liệu là HSPC, chol và các phospholipid tích điện: dicetylphosphat (-),
stearylamine (+) với các tỷ lệ 1:1:0, 7:2:0, 7:2:1 (-), 7:2:1 (+), ở nồng độ 0,05 mg
AMB/mg lipid bằng phương pháp hydrat hóa màng film, sử dụng kĩ thuật siêu âm
để đồng nhất hóa và giảm KTTP, sử dụng phân tích nhiệt vi sai để đánh giá mức độ
ổn định của liposome. Đánh giá hiệu suất liposome hóa bằng phương pháp li tâm
với lực li tâm là 50000 g (ở 4 ºC), trong 1h. Kết quả thu được các liposome có
KTTP từ 115 – 364 nm, hiệu suất liposome hóa trên 85 % với tất cả các mẫu, trong
đó mẫu 7:2:1 (+) AMB cho hiệu suất gắn thuốc cao nhất và ổn định nhất [12].
Maryam Iman cùng cộng sự đã nghiên cứu bào chế liposome AMB sử dụng
1,2 – distigmasterylhemisuccinoyl – sn – 3 – phosphocholin (DSHemsPC), là một
loại lipid mới, được tổng hợp từ 2 phân tử stigmasterol (là sterol ở tế bào thực vật)
liên kết với acid succinic và glycerolphosphocholin. Nghiên cứu khảo sát ảnh
hưởng của tỷ lệ DSHemPC, DMPC, DMPG ở các pH khác nhau (7,4 ; 6,5; 5,5) đến
đặc tính vật lí, khả năng giải phóng ion kali ra khỏi tế bào hồng cầu (RBCPR), hoạt
tính kháng nấm in vitro, kháng hắc nhiệt da (Leishmania major), đồng thời so sánh
với 2 chế phẩm hiện có trên thị trường là Ambisome và Fungizone nhằm xác định
khả năng sử dụng sterol thực vật thay thế chol trong bào chế liposome. Kết quả
16

nghiên cứu cho thấy hầu hết các công thức đều có các đặc tính tương đương với
Ambisome: KTTP khoảng 100 nm, phân bố kích thước hẹp, giá trị RBCPR, IC50
tương đương hoặc nhỏ hơn khi sử dụng Ambisome, hoạt tính kháng nấm in vitro và
kháng hắc nhiệt da gần như tương đương với Ambisome và Fungizone, liều tiêm
tĩnh mạch tối đa của các công thức dưới 10 mg/kg. Tuy nhiên, ở tỷ lệ
DSHemsPC/DMPC/DMPG/AMB là 1,25/5,0/1,5/1,0 pH 5,5 cho kết quả tốt hơn cả
và tương đương với Ambisome, liều tiêm tĩnh mạch có thể lên tới 60 mg/kg, điều