BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ THỊ QUỲNH
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC TIÊM
ĐÔNG KHÔ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B BẰNG PHƢƠNG
PHÁP TIÊM ETHANOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ HÀ NỘI – 2015
BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI VŨ THỊ QUỲNH
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC TIÊM
ĐÔNG KHÔ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B BẰNG PHƢƠNG
PHÁP TIÊM ETHANOL
Sinh viên
Vũ Thị Quỳnh MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
1.1. Amphotericin B 2
1.1.1. Công thức hóa học 2
1.1.2. Đặc tính lý - hóa 2
1.1.3. Tác dụng, dược lý, chỉ định, liều dùng 2
1.1.4. Tác dụng không mong muốn (thường gặp) 3
1.2. Liposome 3
1.2.1. Khái niệm 3
1.2.2. Ưu, nhược điểm của liposome 4
1.2.3. Phương pháp bào chế liposome 5
1.2.3.1. Các phương pháp bào chế liposome 5
1.2.3.2. Bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol 5
1.3. Liposome Amphoterin B 9
1.3.1. Cấu trúc liposome Amphotericin B 9
1.3.2. Một số nghiên cứu về liposome Amphotericin B 12
1.3.2.1. Một số nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B trên thế giới 12
1.3.2.2. Một số nghiên cứu bào chế liposome Amphotericin B tại Việt Nam 12
1.4. Đông khô liposome 13
1.4.1. Độ ổn định của liposome 13
1.4.2. Quá trình đông khô 14
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu, thiết bị nghiên cứu. 16
2.2. Nội dung nghiên cứu 17
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu 17
2.3.1. Phương pháp bào chế liposome Amphotericin B 17
3.2.2.1. Ảnh hưởng của đường kính kim đến đặc tính của liposome
Amphotericin B 31
3.2.2.2. Ảnh hưởng của thời gian khuấy trộn pha nước. 33
3.3. Bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin B. 34
3.3.1. Ảnh hưởng của tá dược tạo khung đến các đặc tính của liposome
Amphotericin B trước đông khô. 34
3.3.2. Ảnh hưởng của tá dược tạo khung đến các đặc tính của liposome
Amphotericin B sau đông khô. 34
3.3.3. Đề xuất quy trình bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin
B 37
3.4. Bàn luận 39
3.4.1. Về phương pháp định lượng Amphotericin B 39
3.4.2. Về phương pháp tiêm ethanol bào chế liposome Amphotericin B 39
3.4.3. Về công thức bào chế liposome Amphotericin B 40
3.4.4. Về đông khô liposome Amphotericin B 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC CỤM TỪ VIẾT TẮT
STT
Viết tắt
Từ/cụm từ viết tắt
1
AmB
Amphotericin B
2
BP
HSPC
Phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa
(Hydrogennated soy phosphatidylcholine)
13
IC50
Nồng độ thuốc ức chế 50% đối tượng thử
14
KTTP
Kích thước tiểu phân
15
kl/kl
Khối lượng/khối lượng
16
L-AmB
Liposome amphotericin B
17
LTT
Lọc tiếp tuyến
18
NSX
Nhà xản xuất
19
PDI
Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)
20
PL
Phospholipid
21
TB
Trung bình
Sơ đồ phương pháp tiêm ethanol bào chế liposome
7
Hình 1.4
Sơ đồ hệ thống kim phun
9
Hình 1.5
Cấu trúc liposome Amphotericin B
10
Hình 3.1
Đồ thị biểu diễn tương quan giữa nồng độ AmB và
diện tích pic
22
Hình 3.2
Đồ thị biểu diễn sự thay đổi KTTP (A) và PDI (B)
trước và sau khi LTT
27
Hình 3.3
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến
hiệu suất quy trình
28
Hình 3.4
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB
đến hiệu suất quy trình.
30
Hình 3.5
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của đường kính kim đến
đặc tính của L-AmB
32
Hình 3.6
Đồ thị biểu diễn sự thay đổi của KTTP trước và sau
Thành phần công thức bào chế và các đặc tính của L-
AmB thu được
25
Bảng 3.6
Thành phần công thức bào chế L-AmB khi thay đổi tỷ
lệ Chol/lipid
26
Bảng 3.7
Ảnh hưởng của tỷ lệ Chol/lipid đến đặc tính của L-
AmB
27
Bảng 3.8
Thành phần công thức bào chế L-AmB khi thay đổi tỷ
lệ DSPG/AmB
29
Bảng 3.9
Ảnh hưởng của tỷ lệ DSPG/AmB lên các đặc tính của
L-AmB
30
Bảng 3.10
Công thức bào chế hỗn dịch L-AmB
31
Bảng 3.11
Ảnh hưởng của đường kính kim đến các đặc tính của
L-AmB
32
Bảng 3.12
Ảnh hưởng của thời gian khuấy trộn đến đặc tính của
L-AmB
33
tiêm ethanol” được tiến hành nhằm mục tiêu:
1. Bào chế liposome Amphotericin B bằng phương pháp tiêm ethanol.
2. Bước đầu bào chế thuốc tiêm đông khô liposome Amphotericin B.
2
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Amphotericin B
1.1.1. Công thức hóa học
1.1.2. Đặc tính lý - hóa
* Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [3], [14], [26].
- Độ tan: thực tế không tan trong nước, tan trong dimethyl sulphoxide (30-40
mg/ml) và trong propylene glycol, hơi tan trong dimethylformamid (2-4 mg/ml), rất
ít tan trong methanol [14]. AmB hầu như không tan trong nước (< 0,1 mg/ml ở
21
0
C), không tan trong cồn và trong chloroform. Dung dịch chế phẩm loãng nhạy
cảm với ánh sáng và bị mất hoạt tính ở pH thấp [3].
* Hóa tính:
Hóa tính chính của AmB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và
nhóm carboxylic tự do, do đó AmB có tính chất sau: tính lưỡng thân và lưỡng tính.
Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrochloric hoặc các dung dịch
kiềm. Dung dịch AmB trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm.
Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57-0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so
với 405 nm là 0,87-0,93 [3].
1.1.3. Tác dụng, dược lý, chỉ định, liều dùng
Trên mặt lâm sàng, AmB có thể chống lại Absidia spp., Aspergillus spp.,
Basidiobolus spp., Blastomyces dermatitidis, Candida spp., Coccidioides immitis,
Công thức phân
gây chết tế bào. Ái lực của AmB với ergosterol - sterol của màng tế bào nấm và
cholesterol - sterol của màng tế bào động vật có vú thể hiện ở hệ số ái lực (The
affinity constant - Kaff). Kaff của ergosterol và cholesterol lần lượt là: 1,7 x 10
6
M
-1
; 0,2 x 10
6
M
-1
. Vì vậy, AmB có ái lực với ergosterol cao hơn rất nhiều so với
cholesterol nên nó tác dụng mạnh lên tế bào nấm [19]. Tuy nhiên, AmB vẫn gắn với
sterol màng tế bào của người (chủ yếu cholesterol) nên giải thích được một phần
độc tính của thuốc đối với người [4].
Bởi hạn chế hấp thu qua đường tiêu hoá, AmB được dùng chủ yếu qua
đường tiêm tĩnh mạch. Liều dùng cho AmB thông thường: bắt đầu với liều 0,25
mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày. Trường hợp nặng, liều có thể cần tới
1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1 ngày. Các tác dụng phụ có dấu hiệu gia tăng khi
liều vượt quá 35 mg/ngày [4].
1.1.4. Tác dụng không mong muốn (thường gặp)
- Phản ứng chung: rét run và sốt, đau đầu, đau cơ hoặc khớp.
- Máu: thiếu máu đẳng sắc.
- Tiêu hóa: rối loạn tiêu hóa, đau bụng, đi ngoài, buồn nôn, nôn, chán ăn.
- Chuyển hóa: rối loạn điện giải, giảm kali huyết, giảm magnesi huyết.
- Tiết niệu: giảm chức năng thận kèm tăng creatinin và urê huyết [4], [29].
1.2. Liposome
1.2.1. Khái niệm
Liposome là một nhóm của hệ đưa thuốc tới đích, cấu tạo gồm một nhân
nước ở giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng
- Có nhiều thông số tác động đến kích thước, chất lượng của liposome trong
quá trình sản xuất dẫn đến khó kiểm soát sự đồng nhất giữa các lô mẻ, bên cạnh đó
chi phí thực hiện khá cao nên khó triển khai sản xuất lớn [9], [39].
- Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ
để hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe người sử dụng cũng như môi
trường [30].
1.2.3. Phương pháp bào chế liposome
1.2.3.1. Các phương pháp bào chế liposome
Có nhiều phương pháp bào chế liposome được sử dụng:
- Phương pháp hydrat hóa film (phương pháp Bangham).
- Phương pháp bốc hơi pha đảo.
- Phương pháp pha loãng ether.
- Phương pháp sử dụng kênh vi lỏng.
- Phương pháp đông khô
Trong đó phương pháp tiêm ethanol ngày càng được sử dụng rộng rãi trong
bào chế liposome do có nhiều ưu điểm nổi bật.
1.2.3.2. Bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol
a) Ưu, nhược điểm của phương pháp
* Ưu điểm
- Quy trình bào chế đơn giản, thực hiện dễ dàng và nhanh chóng hơn các
phương pháp khác, tính lặp lại cao, dễ đồng nhất lô mẻ [9], [16], [17].
- Thu được liposome kích thước nhỏ (SUV) mà không cần trải qua quá trình
làm giảm kích thước tiểu phân như đùn qua màng hay siêu âm, tránh sự oxy hóa
hay phân hủy PL, dược chất [13], [22], [23].
- Thích hợp nạp các dược chất khác nhau: các phân tử protein, cả DC thân dầu
và thân nước, vitamin DC được liposome hóa bằng phương pháp tiêm ethanol rất
6
đa dạng như kanamycin, enrofloxacin, cyprofloxacin, indomethacin, triamcinolone
[32], beclomethason với hiệu suất liposome hóa lên đến 93% [21]. DC có thể gắn
- Giai đoạn 3: Dưới điều kiện có sự phân tán năng lượng đồng nhất trong môi
trường bằng khuấy trộn hoặc siêu âm, các mảng lipid kép có xu hướng giảm diện
tích tiếp xúc với môi trường nước nhằm bảo toàn năng lượng tự do bề mặt, các
mảng lipid kép lớn dần lên và co lại thành cấu trúc hình cầu khép kín - liposome.
c) Quy trình bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol
Quy trình bào chế liposome bằng phương pháp tiêm ethanol được bố trí rất đơn
giản: lipid và các thành phần tạo màng được hòa tan trong ethanol với nồng độ phù
hợp, được tiêm nhanh vào pha nước thích hợp kết hợp khuấy trộn hoặc siêu âm ở tốc
độ phù hợp. DC được hòa tan dung dịch ethanol hoặc trong môi trường nước phụ thuộc
vào độ tan của nó. Do thay đổi dung môi, các SUV có kích thước khoảng 25 nm được
tạo thành. Siêu lọc để loại ethanol và tinh chế liposome [2], [9], [16], [21].
Hình 1.3. Sơ đồ phương pháp tiêm ethanol bào chế liposome
Hiệu suất và chất lượng liposome tạo thành phụ thuộc vào nhiều yếu tố: tỷ lệ
pha ethanol/pha nước; nồng độ PL trong dung dịch ethanol và trong pha nước; loại
8
pha nước được sử dụng (nước tinh khiết, đệm phosphat, đệm Hepes ), nhiệt độ của
pha nước, đường kính bơm kim tiêm, tốc độ khuấy trộn… [17], [18].
Dựa trên nguyên lý phương pháp tiêm ethanol được mô tả bởi Batzri và Korn
năm 1973 ngày càng có nhiều cải tiến để hạn chế các nhược điểm của phương pháp
tiêm ethanol truyền thống, tối ưu hóa quá trình tạo liposome, nạp thuốc và thích hợp
cho áp dụng quy mô lớn với chi phí thấp nhất.
Gentine Philippe và cộng sự (2011) đã tiến hành nghiên cứu một số dung
môi thân nước thay thế cho ethanol sử dụng trong phương pháp tiêm ethanol như
propanol, butanol, isopropanol, ethyl acetat… Kết quả cho thấy chỉ có isopropanol
tạo liposome có kích thước nhỏ (84,8 ± 5,5 nm), PDI nhỏ (0,224 ± 0,012) và không
phụ thuộc nhiều vào các yếu tố khảo sát như nồng độ PL, thể tích dung môi, tốc độ
bơm, tốc độ khuấy trộn. Tác giả cho rằng có thể dùng isopropanol để thay thế cho
ethanol trong sản xuất liposome [18].
Hình 1.4. Sơ đồ hệ thống kim phun [42].
Phương pháp tiêm ethanol còn được cải tiến bằng cách dùng màng tiếp
xúc: pha nước được bơm vào lòng màng tiếp xúc còn pha ethanol được nén thành
các tia nhỏ qua lỗ xốp của màng, liposome được tạo ra ngay lập tức khi lipid hòa tan
trong pha ethanol tiếp xúc với pha nước trong lòng màng. Hỗn dịch liposome tạo
thành được hứng vào bình hứng và khuấy trộn trong khoảng 15 phút (phụ lục 1).
Thiết bị này tạo ra liposome nhỏ kích thước dưới 100 nm và tương đối đồng nhất,
dễ triển khai ở quy mô lớn [9], [21]. Tác giả Chiraz Jaafar-Maalei đã dùng phương
pháp này để bào chế liposome indomethacin (hiệu suất liposome hóa đạt 63%) và
liposome beclomethason (hiệu suất liposome hóa đạt 93%) [21].
1.3. Liposome Amphoterin B
1.3.1. Cấu trúc liposome Amphotericin B
Thành phần của liposome Amphotericin B:
1. Hệ thống kim phun
2,3. Pha nước
4. Pha ethanol
5. Thiết bị nén khí nito
6. Bơm nhu động 10
C (HSPC và DSPG
lần lượt là 48
0
C, 54
0
C) đảm bảo liposome ổn định trong điều kiện sinh lý [12].
Cholesterol
Chol không tham gia tạo lớp kép mà tác dụng như một hệ đệm lỏng để điều
chỉnh thể chất của lớp lipid kép làm giảm tính thấm nước của liposome, làm tăng độ
vững chắc cho màng liposome, tăng độ ổn định của liposome, giảm khả năng rò rỉ
DC mang. Nếu không Chol thì lớp PL của liposome dễ tương tác với protein huyết
tương như albumin, transferrin, macroglobulin dẫn tới giảm độ ổn định của
liposome [9].
Trong thành phần của liposome chứa PL có nhiệt độ chuyển pha cao, Chol
giúp tiểu phân giảm được sự phá hủy của lipoprotein tỉ trọng cao (HDL). HDL sẽ
loại bỏ PL ra khỏi tiểu phân liposome, hậu quả làm phá vỡ cấu trúc màng lipid và rò
rỉ DC mang trong qua trình lưu thông của liposome trong tuần hoàn [19]. Ngoài ra,
trong L-AmB, Chol có ái lực tốt với AmB nên tạo liên kết với AmB góp phần đưa
DC vào pha dầu của cấu trúc liposome, giúp ổn định cấu trúc này, hạn chế rò rỉ DC
và giúp liposome vận chuyển AmB tới đích tác dụng. Chỉ khi nào tiếp xúc với sterol
của tế bào nấm - ergosterol thì AmB trong liposome mới được giải phóng do có ái
lực cao hơn với sterol này [33], [35].
* Dược chất
Bởi sự hình thành phức với DSPG và ái lực với Chol nên AmB được gắn vào
màng liposome trong quá trình bào chế liposome.
* Cơ chế giảm độc tính và tăng khả năng chấp nhận liều cao của L-AmB trên
bệnh nhân cho đến nay vẫn chưa thực sự được rõ ràng. Anya M. Hillery cho rằng do
liên kết chặt chẽ giữa DC với liposome, sự ổn định của tiểu phân, ái lực AmB với
cholesterol - màng tế bào người thấp hơn ergosterol và thời gian tuần hoàn L-AmB
trong máu kéo dài nên sự tương tác của AmB với tế bào người giảm, làm giảm độc
Tại bộ môn Bào chế Đại học Dược Hà Nội, đã thực hiện các nghiên cứu bào
chế L-AmB bằng nhiều phương pháp khác nhau.
Ths. Đào Thị Thùy Dung (2013) đã nghiên cứu bào chế L-AmB bằng 2
phương pháp bốc hơi pha đảo và hydrat hóa film đồng thời đánh giá được các yếu
tố thuộc về công thức, quy trình bào chế, môi trường phân tán và nồng độ lipid ảnh
13
hưởng đến các đặc tính của liposome. Với phương pháp bốc hơi pha đảo đã lựa
chọn được công thức có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lượng lipid là 3%; tỷ lệ
SPC:Chol là 5:5; môi trường phân tán là đệm phosphate pH 7,4; có hiệu suất
liposome hóa là 89,5%; KTTP 288 nm; PDI 0,262. Còn với phương pháp hydrat
hóa film đã lựa chọn được công thức có tỷ lệ % mol dược chất/tổng lipid là 3%; tỷ
lệ SPC:chol là 6:4; môi trường hydrat hóa là glucose 5%; hiệu suất liposome hóa
đạt 98,18%; liposome có KTTP 160,8 nm và PDI 0,288 [5].
Phạm Thúy Ngọc (2014) đã bước đầu nghiên cứu bào chế liposome AmB
bằng phương pháp tiêm ethanol và xác định được một số yếu tố thuộc về quy trình
bào chế: tỷ lệ thể tích pha ethanol/pha nước 8%, nhiệt độ pha nước khi phối hợp
60
0
C, tốc độ khuấy trộn 3900 vòng/phút. Tác giả đã lựa chọn công thức bào chế cho
10ml hỗn dịch: AmB 50 mg, HSPC 213 mg, Chol 52 mg đạt hiệu suất quy trình
khoảng 65,59%, KTTP 177,8-204,3 nm, PDI 0,2-0,15. Đồng thời đánh giá L-AmB
về hình thái cấu trúc: hình ảnh chụp TEM cho thấy số lớp liposome ít hơn 3 [10].
Mai Thị Thùy Linh (2014) tiến hành nghiên cứu bào chế L-AmB sử dụng tá
dược DSPG và HSPC bằng phương pháp hydrat hóa màng film, xây dựng công
thức bào chế và bước đầu tiến hành đông khô L-AmB. Tác giả đã lựa chọn công
thức bào chế: tỷ lệ 9% mol dược chất/tổng lượng lipid, tỷ lệ 40% mol Chol/tổng
lượng lipid, tỷ lệ HSPC/DSPG= 2/0,8, dung dịch hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5 kết
hợp với tá dược đông khô là mannitol cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích
thước hẹp (PDI < 0,2) và hiệu suất liposome hóa cao (khoảng gần 90%). Sử dụng
* Giai đoạn làm khô thứ cấp:
Ở giai đoạn này, lượng nước không đông lạnh, lượng nước hấp phụ trong
khối bột sẽ được loại ra khỏi sản phẩm.
Yêu cầu sản phẩm sau đông khô phải có các đặc tính: ở dạng bánh thuốc, ổn
định trong thời gian dài, thời gian hoà tan lại ngắn, duy trì được những đặc tính gốc
của dạng ban đầu (tính chất của dung dịch, cấu trúc của protein hay kích thước tiểu
phân của hỗn dịch) [8].
Cả quá trình ĐK và quá trình phân tán trở lại để tạo hỗn dịch liposome đều
gây những tác động có thể ảnh hưởng cấu trúc và tính nguyên vẹn của lớp màng kép
15
của liposome. Quá trình ĐK sẽ phá vỡ liên kết hydro hình thành giữa phân tử nước
và đầu phân cực của phân tử PL làm phá vỡ cấu trúc liposome, tạo thành các mảnh
lipid kép. Khi được phân tán lại trong môi trường nước, các mảnh lipid kép này sẽ
kết tập với nhau tạo tiểu phân có kích thước tăng lên đáng kể, đồng thời gây rò rỉ
DC mang. Để hạn chế hiện tượng này, người ta thường cho vào công thức đông khô
các loại đường như glucose, lactose, sucrose, trehalose… Chúng có 2 vai trò chính:
vừa là tá dược tạo khung cho bánh đông khô vừa có tác dụng bảo vệ cấu trúc
liposome (lyoprotectant) do tạo liên kết hydro với phospholipid thay thế nước, hạn
chế sự tá động của tinh thể đá lên lớp màng kép trong quá trình đông lạnh, đồng
thời bao bọc liposome ngăn cách chúng tương tác với nhau khi ở trạng thái rắn. Tỷ
lệ đường/lipid có thể là 5; 8 hay 10 tùy thuộc vào nồng độ lipid trong công thức
đông khô [38]. Quá nhiều các đường này có thể sẽ làm chậm hay gây nứt lọ trong
quá trình đông khô và làm chậm thời gian phân tán lại tạo hỗn dịch liposome [6],
[8]. Ngoài ra, trong công thức ĐK thường sử dụng thêm một lượng nhỏ mannitol
hay glycerol giúp duy trì sự đồng nhất của hỗn dịch sau ĐK [38].
Brigitte Stark và cộng sự (2010) tiến hành đánh giá khả năng bảo vệ của các
loại đường lên tính toàn vẹn của tiểu phân liposome - PEG hóa sau đông khô. Kết
quả cho thấy, nếu không sử dụng tá dược bảo vệ thì KTTP tăng lên đáng kể, ngược
lại KTTP thay đổi không có ý nghĩa trước và sau đông khô khi sử dụng đường với
Trung Quốc
NSX
3
Acetonitril dùng cho HPLC
Merck - Đức
NSX
4
Amphotericin B chuẩn
Dr.Ehrenstorfer - Đức
NSX
5
Amphotericin B
Trung Quốc
USP
6
Cholesterol
Sigma-Aldrich
NSX
7
Dinatrisuccinat hexahydrat
Trung Quốc
TKHH
8
Distearoyl phosphatidylglycerol
Lipoid- Mỹ
NSX
9
Đường sucrose
Fisher – Anh
BP
+ Bơm tiêm 10 ml/cc, 5 ml/cc với các đầu kim 20G×3
1/2
”, 22G×3
1/2
”,
25G×3
1/2
”, 27G×3
1/2
” (Vinahankook – Việt Nam).
Copyright: Tài liệu đại học ©