BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
LÊ NHO ĐÁN
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC
TIÊM ĐÔNG KHÔ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI – 2015
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI LÊ NHO ĐÁN
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ THUỐC
TIÊM ĐÔNG KHÔ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B
Người hướng dẫn:
1. TS. Trần Thị Hải Yến
2. ThS. Nguyễn Tuấn Quang
Nơi thực hiện:
1.1.1. Nguồn gốc 2
1.1.2. Công thức hóa học 2
1.1.3. Đặc tính lý hóa 2
1.1.4. Tác dụng dược lý 3
1.1.5. Dược động học 3
1.1.6. Chỉ định 3
1.1.7. Liều dùng 3
1.1.8. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 4
1.2. Liposome 4
1.2.1. Khái niệm 4
1.2.2. Thành phần của liposome 4
1.2.2.1. Vỏ liposome 4
1.2.2.2. Dược chất 5
1.2.3. Ưu, nhược điểm 6
1.2.3.1. Ưu điểm 6
1.2.3.2. Nhược điểm 6
1.2.4. Độ ổn định 6
1.2.5. Bào chế liposome 7
1.2.5.1. Các phương pháp bào chế liposome 7
1.2.5.2. Bào chế liposome bằng phương pháp hydrat hóa film 7
1.2.5.3. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome 7
1.3. Kỹ thuật đông khô 9
1.3.1. Khái niệm và ưu nhược điểm của phương pháp đông khô 9
1.3.2. Một số khái niệm khác 10
1.3.3. Các giai đoạn của quá trình đông khô. 10
1.3.3.1. Giai đoạn đông lạnh 10
1.3.3.1. Giai đoạn làm khô sơ cấp 12
1.3.3.2. Giai đoạn làm khô thứ cấp 12
1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng liposome đông khô 13
1.3.4.1. Yếu tố thuộc về công thức 13
3.2.1. Khảo sát tác dụng của tá dược bảo vệ trong quá trình đông lạnh 32
3.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ tá dược saccarose trong quá trình đông
khô …………………………………………………………………… 34
3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của yếu tố kỹ thuật 35
3.2.3. Quy trình bào chế L-AMB đông khô 37
3.2.4. Đánh giá lại một số đặc tính của L- AMB đông khô. 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 39 DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
Viết tắt
Từ/cụm từ đầy đủ
1
AMB
Amphotericin B
2
BP
Dược điển Anh
3
Chol
Cholesterol
4
DC
Dược chất
5
DĐVN
Dược điển Việt Nam
6
16
USP
Dược điển Mỹ DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu
Tên bảng biểu
Trang
Bảng 1.1.
Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
4
Bảng 2.1.
Nguyên liệu
17
Bảng 3.1.
KTTP và phân bố KTTP của các mẫu L-AMB sau khi hydrat
hóa
24
Bảng 3.2.
KTTP và phân bố KTTP trước và sau khi đùn tay.
25
Bảng 3.3.
KTTP, phân bố KTTP sau các khoảng thời gian siêu âm 30
giây, nghỉ 30 giây
26
Bảng 3.4.
KTTP, phân bố KTTP sau các khoảng thời gian siêu âm 1
phút, nghỉ 1 phút
Bảng 3.13.
Đặc tính của L- AMB đông khô
38
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ
Số hiệu
Tên hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1.
Thiết bị đồng nhất hóa và đùn áp suất cao
9
Hình 1.2.
Giản đồ pha trong quá trình đông khô
10
Hình 3.1.
Hình ảnh chụp TEM mẫu ban đầu (a) và sau khi làm giảm
KTTP bằng phương pháp đồng nhất hóa áp suất cao kết hợp
với đùn qua màng (b)
31
Hình 3.2.
Đồ thị biểu diễn KTTP và phân bố KTTP thu được từ các
phương pháp làm giảm KTTP
31
Hình 3.3.
Mẫu sau đông khô và phân tán lại
34
Hình 3.4.
Bánh đông khô có mặt 1% (a) và 2% (b) glycerin (kl/tt)
Amphotericin B là một dược chất thân dầu được chỉ định trong trường hợp
nhiễm nấm nặng toàn thân (đặc biệt ở người suy giảm miễn dịch) do hoạt tính
kháng nấm mạnh và phổ tác dụng rộng. Tuy nhiên thuốc rất kém tan trong nước nên
sinh khả dụng đường uống rất thấp, thải trừ rất chậm qua thận, gây tích lũy thuốc do
đó AMB gây độc cao với thận. Hiện nay, việc sử dụng liposome làm chất mang làm
tăng sinh khả dụng và thời gian tuần hoàn trong máu của AMB do đó mang lại
nhiều lợi ích trong việc hạn chế độc tính và tăng hiệu quả điều trị. Một số nghiên
cứu trước đây tại trường Đại học Dược Hà Nội đã tiến hành nghiên cứu kỹ thuật
bào chế liposome AMB bằng các phương pháp khác nhau như: hydrat hóa film,
tiêm ethanol. Tuy nhiên độ ổn định của liposome vẫn là mối quan tâm lớn do sự
thay đổi KTTP, phân bố KTTP, hàm lượng thuốc và sự kết tụ có thể xảy ra khi bảo
quản trong thời gian dài. Chính vì vậy trên cơ sở các kết quả nghiên cứu bào chế
trước đó chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bào chế thuốc tiêm đông khô
liposome Amphotericin B” nhằm mục tiêu:
1. Bào chế và làm giảm KTTP liposome AMB.
2. Xây dựng công thức và quy trình đông khô liposome AMB.
3. Đánh giá một số đặc tính của liposome AMB đông khô.
2
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. Amphotericin B
1.1.1. Nguồn gốc
Amphotericin B là một hỗn hợp của polyenes kháng nấm sản xuất bởi sự tăng
trưởng của một số chủng Streptomyces nodosus, bao gồm chủ yếu là
(1R,3S,5R,6R,9R,11R,15S,16R,17R,18S,19E,21E,23E,25E,27E,29E,
31E,33R,35S,36R,37S)-33-[(3-amino-3,6-dideoxy-β-D-mannopyranosyl) oxy] -1,3,
5,6,9,11,17,37-octahydroxy-15,16,18-trimethyl-13-oxo-14,39-dioxabicyclo [33.3.1]
nonatriaconta-19,21,23,25,27,29,31 - heptaene-36-carboxylic acid. Hàm lượng
không nhỏ hơn 750 IU/mg, tính theo chất khô [10].
1.1.2. Công thức hóa học
1.1.5. Dược động học
Dược động học của AMB thay đổi đáng kể phụ thuộc vào dạng dùng như AMB
quy ước (micell), phức amphotericin sulfate cholesteryl, phức AMB lipid hoặc
liposome AMB.
- Hấp thu: AMB không hấp thu được qua đường tiêu hóa và phải được dùng đường
tiêm.
- Phân bố: Hơn 90% thuốc gắn kết với protein huyết tương, chủ yếu là lipoprotein.
Thông tin về phân bố của AMB còn hạn chế. Để đạt được nồng độ trong dịch não
tủy có tác dụng kìm nấm, AMB phải được tiêm thường xuyên vào trong vỏ não.
Thuốc qua được nhau thai.
- Chuyển hóa: Chưa được làm rõ.
- Thải trừ: AMB được thải trừ rất chậm qua thận. Thời gian bán thải của liposome
AMB là 100-153 giờ [9].
1.1.6. Chỉ định
- Thuốc uống (viên, hỗn dịch) dùng tại chỗ để điều trị nhiễm nấm Candida albicans
ở miệng và đường tiêu hóa.
- Thuốc tiêm tĩnh mạch AMB thông thường dùng điều trị nhiễm khuẩn nấm toàn
thân do nấm Aspergillus, Blastomyces, Candida, Coccidioidesimmitis,
Cryptococcus, Histoplasma, Mucor, Paracoccidioides và Sporotrichum.
- Dạng liposome hoặc phức hợp với lipid: chỉ định cho những trường hợp đã điều trị
bằng AMB thông thường mà bị thất bại hoặc những trường hợp mà AMB thông
thường có thể gây độc cho thận hoặc suy thận [3].
1.1.7. Liều dùng
* Đường tiêm tĩnh mạch:
4
- AMB thông thường: từ liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối đa 1 mg/kg/ngày,
trường hợp nặng, liều có thể tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cách 1 ngày.
- AMB dạng liposome: từ liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3-4 mg/kg/ngày.
- Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày [3].
Amphotec
50 mg,
100 mg
Phức hợp AMB với
cholesteryl sulfate
(tỷ lệ mol 1:1)
Phức hợp
lipid
Bột đông
khô
4
Ambisome
50 mg
HSPC:DSPG:Chol:AMB
(tỷ lệ mol 2:0,8:1:0,4)
Liposome
Bột đông
khô
1.2. Liposome
1.2.1. Khái niệm
Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân nước ở
giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có
kích thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [1], [8].
1.2.2. Thành phần của liposome
1.2.2.1. Vỏ liposome
Vỏ liposome gồm 2 thành phần chính là phospholipid và cholesterol:
* Phospholipid: Phospholipid sử dụng trong liposome AMB bao gồm
phosphatidylcholin đậu nành hydrogen hóa (HSPC) và
distearoylphosphatidylglycerol (DSPG).
5
- AMB được gắn chủ động vào liposome trong quá trình tạo thành liposome bởi sự
hình thành các liên kết tĩnh điện với DSPG và liên kết với cholesterol trong thành
phần vỏ phospholipid.
1.2.3. Ưu, nhược điểm
1.2.3.1. Ưu điểm
- Liposome có thành phần cấu tạo và tính chất lí hóa tương tự màng sinh học. Do đó
được coi là hệ vận chuyển thuốc có tính tương hợp sinh học cao [32].
- Có thể mang được cả DC thân dầu và thân nước [8], [32].
- Có tác dụng bảo vệ DC; kéo dài tác dụng của thuốc [7].
- Giảm độc tính của thuốc [25].
- Có thể vận chuyển thuốc tới tế bào đích, thậm chí là nội bào [7], [8], [32].
1.2.3.2. Nhược điểm
- Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về vật lí, hóa học và sinh học [28].
- Nguyên liệu phải có độ tinh khiết cao, đắt nên giá thành chế phẩm cao [1].
- Các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa tan lipid
gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng và môi trường [28].
- Hầu hết các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí
nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn [28].
1.2.4. Độ ổn định
Trong quá trình bảo quản, liposome không bền cả về vật lý và hóa học.
- Về hóa học: Sự kém ổn định là do quá trình oxy hóa chuỗi acid béo không no của
phân tử phospholipid và quá trình thủy phân liên kết ester của phospholipid tạo ra
các lysophospholipid [16].
- Về vật lý: Sự kém ổn định là do quá trình thấm thuốc qua màng và sự có mặt của
các thành phần tích điện trên bề mặt gây hiện tượng kết tụ tiểu phân [16]. Sự ổn
định vật lý được đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số PDI, sự tích điện bề
mặt, tính vững chắc của lớp màng kép, sự rò rỉ của DC qua màng
Vì vậy, bào chế liposome ở dạng bột đông khô là hướng nghiên cứu để kéo dài
tuổi thọ của chế phẩm.
8
Cơ chế: Thường ép hỗn dịch liposome nhiều lớp qua màng để thu liposome
nhỏ một lớp. Liposome sẽ bị “bóc từng lớp một” cho đến kích thước mong muốn.
Khi bị nén qua lỗ lọc hình trụ, liposome có đường kính nhỏ hơn lỗ lọc dễ dàng đi
qua màng lọc. Liposome có kích thước lớn hơn đường kính lỗ lọc, một số sẽ bị biến
dạng để đi qua lỗ lọc và bị một số tác động của lực trượt sẽ bị “bóc” lớp vỏ ngoài
sau khi đi qua lỗ lọc [7].
Kỹ thuật đùn ép có nhiều ưu điểm: có thể được áp dụng cho nhiều loại lipid và
hỗn hợp, nhanh, chi phí thấp, có thể đùn trực tiếp liposome đa lớp thành đơn lớp
[18].
Đùn ép có 2 loại: đùn tay hoặc đùn ép dưới áp suất cao.
- Đùn tay
Đùn ép được thực hiện bằng cách sử dụng một hệ thống xylanh cầm tay trang
bị bộ giữ màng lọc với kích thước màng lọc phù hợp. Để có thể đùn ép qua lỗ lọc
200 nm, hỗn dịch liposome loãng phải được tuần tự đùn qua các màng lọc với kích
thước lỗ lọc lớn hơn [18].
- Đùn ép dưới áp suất cao
Với thiết bị có quy mô lớn hơn, liposome có thể được nén qua màng với áp
suất cao hơn, sử dụng khí nén là Nitơ (Hình 1.1).
* Siêu âm
Siêu âm là một trong những phương pháp phổ biến để làm nhỏ kích thước tiểu
phân của liposome. Có thể sử dụng siêu ẩm bể hoặc siêu âm que, tuy nhiên dùng
que dễ đưa tạp vào chế phẩm [7].
Nhược điểm: Có hiện tượng tăng nhiệt cục bộ trong quá trình siêu âm, hiệu
suất nạp thuốc giảm do rò rỉ dược chất trong quá trình siêu âm. So với phương pháp
đùn ép, phương pháp siêu âm không có sự đồng nhất giữa các lô mẻ [18].
* Đồng nhất hóa áp suất cao
Nguyên tắc hoạt động: Nén hỗn dịch qua khe hẹp có kích thước xác định
trong thiết bị đồng nhất hóa ở áp suất cao. Thường nén tuần hoàn nhiều vòng cho
* Nhiệt độ kết tinh (Eutectic temparature, Te): là nhiệt độ thấp nhất mà ở đó dung
dịch vẫn tồn tại ở dạng lỏng. Hay chính là điểm giao nhau giữa đường cong đóng
băng và đường cong độ tan [30].
Hình 1.2. Giản đồ pha trong quá trình đông khô.
* Nhiệt độ phá vỡ cấu trúc (Collapse Temparature, Tc): được định nghĩa là nhiệt độ
mà trên nhiệt độ đó các sản phẩm đông khô mất cấu trúc vĩ mô và sụp đổ trong
đông khô. Nhiệt độ phá vỡ cấu trúc thường được xác định là điểm băng bắt đầu tan
chảy được quan sát trên kính hiển vi đông khô [30].
* Nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh (Glass transition temperature, Tg’): Quá trình
chuyển hóa thủy tinh xảy ra khi nguyên liệu trải qua một sự thay đổi đáng kể về độ
nhớt khi qua một khoảng thay đổi nhỏ về nhiệt độ. Tg’ là giao điểm giữa đường
cong chuyển hóa thủy tinh và đường cong đông lạnh.
1.3.3. Các giai đoạn của quá trình đông khô.
Quá trình ĐK có thể được chia thành ba giai đoạn: đông lạnh, làm khô sơ cấp,
làm khô thứ cấp [11].
1.3.3.1. Giai đoạn đông lạnh
Trong quá trình đông lạnh chế phẩm, có thể xảy ra một trong các hiện tượng sau:
- Cách 1: Đơn giản nhất là trong quá trình làm lạnh, băng được hình thành. Khi đến
Te (nhiệt độ eutectic) một lượng chất tan đạt đến giới hạn độ tan và kết tinh khỏi
dung dịch. Sự kết tinh này gây loãng phần dung dịch còn lại làm hình thành nhiều
11
băng hơn, dẫn đến kết tinh nhiều chất tan hơn. Sản phẩm cuối cùng là hỗn hợp của
băng và chất tan kết tinh. Cách này chỉ xảy ở vài phần trăm các trường hợp.
- Cách 2: Trong hầu hết các trường hợp chất tan không kết tinh ở giới hạn độ tan,
băng tiếp tục được hình thành trong khi nhiệt độ giảm và dung dịch tiếp tục được cô
đặc cho đến khi nó nhớt đến mức chuyển hóa thành thủy tinh. Điều này xảy ra ở
một nhiệt độ đặc trưng gọi là nhiệt độ chuyển hóa thủy tinh (nhiệt độ chuyển kính)
Tg’. Đối với các sản phẩm xảy ra theo cách này, Tg’ là nhiệt độ mà băng bắt đầu
Trong đó:
dm/dt: Tốc độ thăng hoa nước đá (g/cm2/giờ).
Pice: Áp suất hơi bão hòa của nước đá tại nhiệt độ của buồng ĐK (mmHg).
Pc: Áp suất của buồng ĐK (mmHg).
Rp : Hệ số cản trở thăng hoa của sản phẩm.
Rs: Hệ số cản trở thăng hoa của nắp [30].
Các yếu tố chính ảnh hưởng đến hoạt tính của liposome trong quá trình này:
- Áp suất buồng đông khô càng thấp, tốc độ thăng hoa của dung môi càng nhanh
nhưng áp suất quá thấp có thể gây nhiễm các tạp dễ bay hơi từ bao bì và thiết bị vào
chế phẩm. Áp suất buồng ĐK càng cao, hiệu suất quá trình làm khô sơ cấp càng
giảm.
- Nhiệt độ làm khô càng cao thì Pice càng tăng, hiệu suất quá trình sấy sơ cấp càng
tăng. Tuy nhiên, nếu nhiệt độ làm khô lớn hơn nhiệt độ chuyển kính Tg’ (hệ vô định
hình) hoặc nhiệt độ eutectic Teu (hệ kết tinh) sẽ dẫn tới hiện tượng vỡ cấu trúc của
hệ. Kết quả là hàm ẩm tăng và giảm độ ổn định của chế phẩm.
- Thời gian làm khô không đủ để loại phần dung môi không liên kết cũng dẫn tới
phá vỡ cấu trúc của hệ khi chuyển sang giai đoạn làm khô thứ cấp.
1.3.3.2. Giai đoạn làm khô thứ cấp
Ở giai đoạn này, lượng nước không đông lạnh, hấp phụ trong khối bột sẽ được
loại bỏ bằng cách tiếp tục nâng nhiệt độ của buồng đông khô trong điều kiện áp suất
thấp để làm giảm hàm ẩm còn lại tới mức tối ưu, đảm bảo độ ổn định của chế phẩm
trong quá trình bảo quản. Nhiệt độ làm khô phải đảm bảo loại bỏ được phần nước
13
liên kết nhưng không làm ảnh hưởng đến đặc tính của liposome, thường từ 25-30
o
C
thế nước và thủy tinh hóa.
+ Giả thuyết thay thế nước: Các tá dược bảo vệ thay thế nước tương tác với
phospholipid thông qua liên kết hydro để giúp liposome không bị nứt vỡ trong quá
trình đông lạnh và hydrat hóa trở lại. Tá dược bảo vệ tương tác với đầu phân cực
của phospholipid giúp duy trì khoảng cách giữa các đầu phân cực và giảm lực Van
der Waals giữa các chuỗi acyl của phospholipid. Nhờ đó tá dược bảo vệ làm giảm
sự tương tác giữa nước và phospholipid rồi sau đó thay thế nước. Các liên kết hydro
giữa tá dược bảo vệ và lipid được hình thành trên bề mặt của lớp màng kép. Việc bổ
sung các disaccharide không làm thay đổi lớp cấu trúc kép và các disaccharide là
một sự thay thế tốt cho nước dưới điều kiện khan. Một phân tử đường có thể tương
tác với tối đa ba lipid khác nhau cùng lúc. Thứ tự ưu tiên các nhóm của lipid tạo
liên kết hydro với nhóm OH của đường là: phosphate, methyl choline, cacbonyl. Vì
vậy, nhóm phosphate trên lớp màng kép là vị trí có khả năng nhất mà đường tương
tác. Tóm lại, tương tác trực tiếp giữa phospholipid và tá dược bảo vệ qua liên kết
hydro đóng vai trò quan trọng trong quá trình ĐK liposome [15].
+ Giả thuyết thủy tinh hóa: Tá dược bảo vệ hình thành dạng thủy tinh hóa ổn
định giữ cố định liposome khi nước đóng băng trong quá trình đông lạnh. Cấu trúc
thủy tinh hóa có độ nhớt cao và tính di động thấp, cần năng lượng kích hoạt rất cao
để bất kỳ tương tác nào xảy ra do đó ngăn ngừa liposome kết tụ và bảo vệ màng
lipid kép khỏi bị hư hại bởi các tinh thể băng. Cấu trúc này cũng ức chế sự thay đổi
liên quan tới giai đoạn chuyển pha của lipid. Chính vì vậy nó có thể giảm bớt thiệt
hại do tinh thể nước đá, ngăn ngừa hiện tượng hợp nhất, kết tụ và tránh quá trình
chuyển pha [15].
1.3.4.2. Yếu tố thuộc về kỹ thuật:
- Tốc độ làm lạnh chậm (0,5
o
C/phút) cho hàm lượng DC được giữ lại cao hơn [31].
- Trong quá trình làm khô sơ cấp, nhiệt độ sản phẩm phải được điều chỉnh xuống
dưới nhiệt độ phá vỡ cấu trúc (Tc) của hệ [11].
15
pha dung môi hữu cơ là 1:5 tạo ra các liposome có đặc tính tốt nhất với kích thước
1,8 ± 0,2 µm (AMB 1) và 2,0 ± 0,3 µm (AMB 2), hiệu suất nạp thuốc 95,8 ± 1,5 %
16
(AMB 1) và 87,9 ± 1,3 (AMB 2). Trong các chất bảo vệ đã khảo sát, saccarose
được lựa chọn cho các nghiên cứu sau với tỷ lệ tối ưu lipid: saccarose là 1:5, sản
phẩm sau khi tạo dạng bột xông hít thì hiệu suất nang hóa là 22,5 ± 2,2 % (AMB 1)
và 16,8 ± 2,2 % (AMB 2). Liposome AMB tạo ra có tuổi thọ trên 1 năm, bảo quản ở
2-8 ºC [24].
1.4.2. Các nghiên cứu ở Việt Nam
Ngô Thị Bích Phượng đã nghiên cứu bào chế liposome AMB bằng phương
pháp bốc hơi pha đảo với các tá dược là SPC và Chol theo tỉ lệ mol 5:5, môi trường
hydrat hóa là đệm phosphate pH 7,4, tỷ lệ % dược chất/tổng lượng lipid là 3mol%
cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI< 0,3) và hiệu suất
liposome hóa cao (khoảng 90%) [5].
Mai Thị Thùy Linh đã nghiên cứu bào chế liposome AMB bằng phương pháp
hydrat hóa film với các tá dược theo tỷ lệ mol HSPC: DSPG: Chol = 2:0,8:1,9, tỷ lệ
dược chất/ tổng số mol lipid đạt 9 mol%, môi trường hydrat hóa là đệm citrat pH 5,5
cho KTTP nhỏ (dưới 300 nm), phân bố kích thước hẹp (PDI<0,2) và hiệu suất
liposome hóa cao (khoảng gần 90%) [4].
Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về ĐK L-AMB ở Việt Nam được công bố.
Copyright: Tài liệu đại học ©