BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
MAI THỊ THÙY LINH
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B SỬ DỤNG
TÁ DƯỢC DISTEAROYL
PHOSPHATIDYLGLYCEROL VÀ
PHOSPHATIDYLCHOLIN ĐẬU NÀNH
HYDROGEN HÓA
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
HÀ NỘI - 2014
BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
MAI THỊ THÙY LINH
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
AMPHOTERICIN B SỬ DỤNG
TÁ DƯỢC DISTEAROYL
PHOSPHATIDYLGLYCEROL VÀ
PHOSPHATIDYLCHOLIN ĐẬU NÀNH MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 2
1.1. Amphotericin B 2
1.1.1. Nguồn gốc 2
1.1.2. Công thức hóa học 2
1.1.3. Đặc tính lý hóa 2
1.1.4. Tác dụng dược lý 3
1.1.5. Dược động học 3
1.1.6. Chỉ định 4
1.1.7. Tác dụng không mong muốn (thường gặp) 4
1.1.8. Liều dùng 4
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường 5
1.2. Liposome 5
1.2.1. Khái niệm 5
1.2.2. Thành phần của liposome amphotericin B 6
1.2.3. Ưu nhược điểm 8
1.2.4. Độ ổn định 10
1.3. Bào chế liposome 11
1.3.1. Bào chế liposome thô bằng phương pháp hydrat hóa film 11
1.3.2. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome 11
1.3.3. Đông khô liposome 14
1.4. Một số nghiên cứu về liposome AMB 16
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
3.4.1. Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa và tá dược đông khô đến các đặc
tính của liposome AMB. 39
3.4.2. Đông khô liposome 41
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT: 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
Viết tắt
Từ/cụm từ đầy đủ
1
ABCD
Amphotericin B colloidal dispersion
2
ABLC
Amphotericin B lipid complex
3
AMB
Amphotericin B
4
BHA
Butylated hydroxyanisole
5
Liposome amphotericin B
15
NSX
Nhà xản xuất
16
PDI
Chỉ số đa phân tán (Polydispersity index)
17
PTFE
Polytetraflouroethylene
18
TKHH
Tinh khiết hóa học
19
USP
United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)
20
Z
average
Kích thước tiểu phân trung bình
DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU
Số hiệu
Tên bảng biểu
Trang
liposome.
32
Bảng 3.7.
Ảnh hưởng của tỉ lệ phospholipid tới đặc tính của
liposome
34
Bảng 3.8.
Ảnh hưởng của phương pháp làm nhỏ KTTP đến các đặc
tính của liposome.
36
Bảng 3.9.
Ảnh hưởng của dung dịch dùng hydrat hóa đến pH của
hỗn dịch liposome
37
Bảng 3.10.
Ảnh hưởng của dung dịch dùng hydrat hóa đến đặc tính
của liposome.
38
Bảng 3.11.
Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa và tá dược đông khô
tới đặc tính của liposome AMB.
40
Bảng 3.12.
Các đặc tính của liposome sau khi phân tán trở lại từ mẫu
đông khô.
41
Đường chuẩn của amphotericin B trong methanol và
phương trình hồi quy thực nghiệm
28
Hình 3.3.
Ảnh hưởng của tỉ lệ dược chất đến các đặc tính của
liposome AMB.
32
Hình 3.4.
Ảnh hưởng của tỉ lệ phospholipid đến đặc tính của
liposome.
34
Hình 3.5.
Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa đến các đặc tính của
liposome.
38
Hình 3.6.
Ảnh hưởng của dung dịch hydrat hóa và tá dược đông khô
tới đặc tính của liposome AMB.
40
Hình 3.7.
Sản phẩm đông khô sử dụng tá dược lactose, sucrose,
mannitol
42
1
1.1. Amphotericin B
1.1.1. Nguồn gốc
Amphotericin B là một kháng sinh polyene tự nhiên, được đưa vào sử dụng từ
năm 1955; và được phân lập lần đầu tiên năm 1959 từ Streptomyces nodosus bởi
Dutcher và cộng sự [10]. Cụ thể, Amphotericin B là một hỗn hợp của polyenes kháng
nấm sản xuất bởi sự tăng trưởng của một số chủng Streptomyces nodosus, bao gồm
chủ yếu là (1R,3S,5R,6R,9R,11R,15S,16R,17R,18S,19E,21E,23E,25E,27E,29E,
31E,33R,35S,36R,37S)-33-[(3-amino-3,6-dideoxy-β-D-mannopyranosyl) oxy] -1,3,
5,6,9,11,17,37-octahydroxy-15,16,18-trimethyl-13-oxo-14,39-dioxabicyclo [33.3.1]
nonatriaconta-19,21,23,25,27,29,31 - heptaene-36-carboxylic acid. Hàm lượng
không nhỏ hơn 750 IU/mg, tính theo chất khô [14].
1.1.2. Công thức hóa học
Công thức phân tử: C
47
H
73
NO
17
.
Khối lượng phân tử: 924 [14].
1.1.3. Đặc tính lý hóa
Lý tính:
- Bột kết tinh màu vàng hoặc vàng cam [3],[10],[14].
- Độ tan: thực tế không tan trong nước, hòa tan trong dimethyl sulphoxide và trong
propylene glycol, hơi tan trong dimethylformamid, rất ít tan trong methanol, thực
tế không tan trong cồn [14]. Amphotericin B hầu như không tan trong nước
(<0,1mg/ml ở 21
0
và nhóm carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau:
- Tính lưỡng tính và lưỡng thân [3].
- Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrocloric hoặc các dung dịch
kiềm [3].
- Dung dịch amphotericin B trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405
nm. Tỷ lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381
nm so với 405 nm là 0,87-0,93 [3].
1.1.4. Tác dụng dược lý
Amphotericin B là một kháng sinh chống nấm nhờ gắn vào sterol (chủ yếu là
ergosterol) ở màng tế bào nấm làm biến đổi tính thấm của màng [4],[20].
Amphotericin B cũng gắn với sterol bào chất của người (chủ yếu cholesterol) nên giải
thích được một phần độc tính của thuốc đối với người [4].
Trên mặt lâm sàng, amphotericin B có thể chống lại Absidia spp. , Aspergillus
spp. , Basidiobolus spp. , Blastomyces dermatitidis , Candida spp. , Coccidioides
immitis , Conidiobolus spp. , Cryptococcus neoformans , Histoplasma capsulatum ,
Mucor spp. , Paracoccidioides brasiliensis , Rhizopus spp. , Rhodotorula spp. , và
Sporothrix schenckii [20].
1.1.5. Dược động học
Dược động học của amphotericin B thay đổi đáng kể phụ thuộc vào dạng dùng
như amphotericin B quy ước (micell), phức amphotericin sulfate cholesteryl, phức
4
amphotericin B lipid hoặc liposome amphotericin B.
- Hấp thu: Amphotericin B không hấp thu được qua đường tiêu hóa và phải được
dùng đường tiêm.
- Phân bố: hơn 90 % thuốc gắn kết với protein huyết tương, chủ yếu là lipoprotein.
Thông tin về phân bố của amphotericin B còn hạn chế. Để đạt được nồng độ trong
dịch não tủy có tác dụng kìm nấm, amphotericin B phải được thường xuyên tiêm
- Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày.
Đường uống:
- Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100 mg/ml.
- Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1ml/lần ×4 lần/ngày, giữ thuốc trong
miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày.
- Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100 – 200 mg/ngày, 4 lần/ngày [4].
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
Bảng 1.2. Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường [25].
TT
Tên chế
phẩm
Hàm
lượng
Thành phần
Dạng cấu
trúc
Dạng bào
chế
1
Fungizone
50 mg
AMB với natri
deoxycholat
Micell
bột đông
khô
2
Abelcet
(ABLC)
100mg/
giữa được bao bọc bởi một vỏ phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm, có kích
thước thay đổi từ hàng chục nanomet đến hàng chục micromet [1],[2],[9],[27].
Liposome là một nhóm của hệ đưa thuốc tới đích, là hệ điều trị phát triển ở mức
cao hơn thuốc tác dụng kéo dài [1],[2]. (hình 1.1). 6
A: Bề mặt ưa nước của lớp vỏ lipid kép
B: Lớp kỵ nước của lớp vỏ lipid kép
C: Nhân nước bên trong có thể chứa dược
chất tan trong nước
D: Các dược chất kết tinh bên trong nhân
E: Các dược chất thân dầu trong lớp vỏ lipid
Hình 1.1. Cấu trúc của liposome
Liposome amphotericin B đã được
chứng minh là đã làm giảm độc tính, thuận
lợi cho sử dụng liều lượng lớn và hiệu quả
hơn [2],[25].
Hình 1.2. Cấu trúc liposome AMB
1.2.2. Thành phần của liposome amphotericin B
1.2.2.1. Vỏ liposome
Vỏ liposome gồm 2 thành phần chính là phospholipid và cholesterol.
Phospholipid
Phospholipid sử dụng trong liposome AMB bao gồm phosphatidylcholin đậu
nành hydrogen hóa (HSPC) và distearoylphosphatidylglycerol (DSPG).
không bão hòa theo cơ chế chuỗi gốc tự do. Nhưng các axit béo bão hòa cũng có thể
bị oxy hóa ở nhiệt độ cao [17]. Có thể cho thêm vào thành phần liposome chất chống
oxy hóa như α-tocoferol, BHA, BHT,… nhưng có thể sẽ làm mất ổn định vật lý của
liposome và tăng khả năng kết tụ [8],[37].
- Khả năng tích điện: phospholipid tích điện (phosphatidylglycerol, acid
phosphatidic,…) sẽ làm tăng thể tích khoang nước hoặc tạo nên liên kết tĩnh điện với
dược chất tích điện. Thay đổi điện tích trên bề mặt liposome có thể thay đổi đặc tính
dược động học và sự phân bố của liposome trong cơ thể [8].
8
- Nhiệt độ chuyển pha (T
C
): liên quan đến hiện tượng chuyển pha của
phospholipid. Ở dưới nhiệt độ chảy, vỏ phospholipid ở trạng thái gel có cấu trúc bền
chặt, khó thấm, còn ở trên nhiệt độ chảy, phospholipid chuyển sang trạng thái lỏng
với cấu trúc sắp xếp lỏng lẻo, dễ dò rỉ dược chất khi bào chế, bảo quản liposome [8].
Liposome sử dụng trong điều trị cần ổn định trong điều kiện sinh lý, do đó nên sử
dụng các phospholipid có T
C
> 37
0
C [12].
- Độ tinh khiết: tùy theo mục địch nghiên cứu và sử dụng mà yêu cầu nguyên
liệu có độ tinh khiết khác nhau.
Cholesterol
Cholesterol không tạo lớp kép mà tác dụng như một hệ đệm lỏng để điều chỉnh
thể chất của lớp lipid kép làm giảm tính thấm nước của liposome. Nếu không có
cholesterol thì lớp phospholipid của liposome dễ tương tác với protein huyết tương
chất: Khi dược chất được nang hóa trong liposome, cấu trúc đặc biệt của liposome
làm giảm lượng dược chất bị chuyển hóa khi qua gan và lượng lớn dược chất còn lại
vượt qua được các quá trình chuyển hóa này sẽ tạo hiệu quả tác dụng cao hơn [13],
[22], [35].
- Giảm độc tính của thuốc, ví dụ như: ở dạng bào chế liposome, AMB liên kết
bền chặt với lớp màng lipid do tạo thành phức hợp AMB – chol, làm giảm khả năng
liên kết với chol trên màng tế bào người làm giảm độc tính của thuốc. Chỉ khi thuốc
phân bố đến các tổ chức viêm nhiễm do ái lực của AMB với ergosterol cao hơn với
chol làm giải phóng AMB ra khỏi lớp màng lipid, hình thành phức hợp AMB -
ergosterol trên màng tế bào nấm và phát huy tác dụng của thuốc [28].
- Có thể dễ dàng thiết kế ra nhiều loại liposome có kích thước, thành phần
phospholipid và các đặc tính bề mặt khác nhau, do đó có thể phục vụ cho nhiều mục
đích khác nhau [19].
1.2.3.2. Nhược điểm
Mặc dù có rất nhiều ưu điểm nhưng hiện liposome vẫn chưa được sử dụng
rộng rãi do có một số nhược điểm sau:
- Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về mặt vật lí , hóa học và sinh
học [29]. Liposome là một hệ không đồng pha, luôn có khả năng kết tập của các tiểu
phân trong hệ dẫn đến sự không ổn định. Mặt khác nguyên liệu để làm lớp vỏ
liposome là các lipid rất dễ bị ảnh hưởng của các yếu tố: nhiệt độ, pH, vi sinh của môi
trường [2],[13].
10
- Nguyên liệu đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao, đắt tiền nên giá thành chế phẩm
cao [2],[13].
- Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để
hòa tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng và môi trường [36].
- Đa số các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí
thay đổi như thay đổi KTTP, phân bố KTTP, hàm lượng thuốc và sự kệt tụ có thể xảy
ra khi lưu trữ trong thời gian dài. Vì vậy, bào chế liposome ở dạng bột đông khô là
hướng đi mới để kéo dài tuổi thọ của chế phẩm [33].
1.3. Bào chế liposome
1.3.1. Bào chế liposome thô bằng phương pháp hydrat hóa film
Phương pháp này được Bangham đưa ra và phát triển từ năm 1965 và cho đến
nay vẫn là phương pháp được sử dụng nhiều để bào chế liposome vì tính tiện ích, dễ
thực hiện, không yêu cầu thiết bị công nghệ cao, dễ bổ sung cải tiến.
Phospholipid tạo vỏ và các thành phần khác được hòa tan trong hỗn hợp dung
môi hữu cơ thích hợp. Sau đó, dung môi hữu cơ được loại khỏi dung dịch bằng cách
bốc hơi trong một bình đáy tròn để tạo một tấm film khô bao gồm các thành phần
lipid phức tạp và các thành phần khác. Hydrat hóa film đã tráng để tạp liposome.
Dung dịch được dùng để hydrat hóa tốt nhất là natri clorua, hoặc đường dextrose hoặc
lactose [26].
Liposome được tạo ra bởi phương pháp này có thể có KTTP lớn và không
đồng nhất. Để đạt được mục đích điều trị, việc đồng nhất và giảm KTTP liposome là
cần thiết.
1.3.2. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome
Mục đích của quá trình này là tạo ra liposome có kích thước nhỏ và phân bố
kích thước hẹp, điều này giúp tăng độ ổn định về mặt vật lý, cải thiện hình thức cho
chế phẩm, đồng thời cho phép lọc loại khuẩn liposome và sử dụng liposome bằng
đường tiêm tĩnh mạch [31].
Liposome được làm giảm KTTP bởi các tác dụng của lực cắt. Các phương
pháp được sử dụng để làm giảm kích thước của liposome là dùng siêu âm hoặc đồng
nhất, hoặc bằng cách đóng băng và tan băng, thẩm tách một dung dịch có chứa chất
12
tẩy rửa từ lipids, hoặc các phương pháp khác. Kích thước của các hạt liposome, cho
Nguyên lí của phương pháp được mô tả như sau: hỗn dịch liposome được đùn
qua màng có các lỗ màng hình trụ, sắp xếp đồng trục, kích thước xác định, ở áp suất
vừa phải, nhiệt độ trên nhiệt độ chuyển pha T
c
của phospholipid và với số lần thích
hợp. Khi đó các tiểu phân có kích thước lớn hơn kích thước lỗ màng sẽ được làm nhỏ
khi đi qua qua màng, còn các tiểu phân kích nhỏ thì hầu như không thay đổi kích
thước khi qua màng, do đó thu được hỗn dịch liposome có kích thước đồng nhất
[18],[34].
Kỹ thuật đùn ép có nhiều ưu điểm: nó có thể được áp dụng cho nhiều loại lipid
và hỗn hợp, nhanh (thời gian đùn qua các màng khoảng 10 phút), chi phí thấp, có thể
đùn trực tiếp liposome đa lớp thành đơn lớp, và nó có thể tạo ra các liposome với
phạm vi kích thước từ 40 đến 150 nm [18],[21].
Đùn ép có 2 loại: đùn tuần tự bằng thiết bị cầm tay mini – extruder hoặc đùn
ép sử dụng áp suất cao.
a, Đùn tuần tự bằng thiết bị mini – extruder:
Đùn ép có thể được thực hiện bằng cách sử dụng một hệ thống xylanh cầm tay
trang bị bộ giữ màng lọc với kích thước màng lọc phù hợp. Để có thể đùn ép qua lỗ
lọc 200 nm, dung dịch liposome loãng phải được tuần tự đùn qua các màng lọc với
kích thước lỗ lọc lớn hơn. Sau đó, quá trình đùn ép dùng áp lực cao có thể được sử
dụng để có thể đấy dung dịch qua màng lọc có đường kính 100 nm và nhỏ hơn.
Tuy nhiên, phương pháp này bị giới hạn bởi áp lực mà xylanh và bộ lọc có thể
chịu được, như cũng như áp lực có thể đẩy được bằng tay. Cụ thể, với nồng độ
phospholipid dưới 20 mg/ml và kích thước lỗ lọc lớn hơn 200 nm thì có thể đẩy dễ
dàng bằng tay. Nhược điểm khác là khó đẩy qua màng có kích thước lỗ lọc nhỏ do
hạn chế về lực đẩy bằng tay cũng như khả năng chịu áp lực của thiết bị. Ngoài ra, thể
tích mẫu có thể bào chế bằng phương pháp này thường hạn chế do quy mô của bộ
Giai đoạn đông lạnh:
Là giai đoạn đầu tiên của quá trình đông khô, ở giai đoạn này phần lớn nước
được tách ra khỏi dược chất và tá dược, hệ tách thành nhiều pha. Kết thúc giai đoạn
này sẽ tạo ra trạng thái kết tinh, vô định hình hoặc kết tinh kết hợp với vô định hình.
Giai đoạn làm khô sơ cấp:
Kết quả của quá trình làm khô sơ cấp thể hiện ở độ dày của lớp băng giảm
xuố1ng còn độ dày của sản phẩm khô tăng lên (hình 1.5).
Ghi chú: H.1.1a: Dung dịch cần đông khô chứa trong
lọ thủy tinh, “đậy hờ” nút cao su. H.1.1b: Dung dịch
đông lạnh chuyển sang trạng thái đá. H.1.1c: Giai
đoạn làm khô sơ cấp: nước bốc hơi từ đá. H.1.1d: giai
đoạn làm khô thứ cấp, hình thành khối bột xốp.
H.1.1e: đậy nắp cao su, kết thúc quá trình đông khô.
Hình 1.5: Sơ đồ quá trình đông khô
Nước đá tạo thành trong giai đoạn đông lạnh sẽ thăng hoa trực tiếp ở điều kiện
áp suất của buồng đông khô dưới áp suất hơi của nước đá và nhiệt độ của giá đỡ trong
khoảng từ – 30
0
C đến + 10
0
C.
Giai đoạn làm khô thứ cấp:
Ở giai đoạn này, lượng nước không đông lạnh, lượng nước hấp phụ trong khối
bột sẽ được loại ra khỏi sản phẩm.
Mục tiêu của giai đoạn làm khô thứ cấp là giảm hàm ẩm còn lại tới mức tối
ưu, thường dưới 1 đến 2 % để đảm bảo độ ổn định của chế phẩm trong quá trình bảo
quản.
HSPC, DSPG, cholesterol bằng phương pháp hydrat hóa màng film: AMB phân tán
trong hỗn hợp dung môi methanol/chloroform được thêm vào dung dịch DSPG đã
acid hóa. HSPC và cholesterol được hòa tan vào hỗn hợp dung môi
methanol/chloroforom và được bổ sung vào dung dịch DSPG – AMB. Dung dịch thu
được bao gồm AMB và các thành phần tạo vỏ được mang đi phun sấy tạo thành dạng
bột phun sấy khô. Hydrat hóa bột phun sấy trên để thu được hỗn dịch liposome. Hỗn
dịch liposome được làm giảm KTTP bằng cách lọc qua bộ lọc có kích thước lỗ màng
0,22 nm. Nồng độ của AMB trong hỗn dịch thu được là 1,86 mg/ml, được xác định
bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Đường kính liposome trung
Copyright: Tài liệu đại học ©