BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THUỶ
NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
MANG PHỨC AMPHOTERICIN B
VỚI CYCLODEXTRIN

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2015

BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

PHẠM THỊ THUỶ

NGHIÊN CỨU BÀO CHẾ LIPOSOME
MANG PHỨC AMPHOTERICIN B
VỚI CYCLODEXTRIN

Người hướng dẫn:
TS. Trần Thị Hải Yến
Nơi thực hiện:
Bộ môn bào chế MỤC LỤC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƯƠNG 1 : TỔNG QUAN 2
1.1. Amphotericin B 2
1.1.1. Nguồn gốc 2
1.1.2. Công thức hóa học 2
1.1.3. Đặc tính hoá lý 2
1.1.4. Tác dụng dược lý 3
1.1.5. Dược động học 4
1.1.6. Chỉ định 4
1.1.7. Tác dụng không mong muốn 5
1.1.8. Liều dùng 5
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của amphotericin B trên thị trường 5
1.2. Liposome chứa phức hợp cyclodextrin 6
1.2.1. Phức hợp cyclodextrin- amphotericin B 6
1.2.2. Liposome chứa phức hợp cyclodextrin- amphotericin B 8
1.3. Bào chế liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 12
1.3.1. Bào chế phức hợp amphotericin B-cyclodextrin 12
1.3.2. Bào chế liposome thô chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 12
1.3.3. Đồng nhất và giảm kích thước tiểu phân liposome 13
1.4. Một số nghiên cứu về liposome chứa phức hợp amphotericin B-
cyclodextrin 14
CHƯƠNG 2 : ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15
2.1. Đối tượng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phương tiện nghiên cứu 15
3.3.2. Phân tích nhiệt vi sai phức hợp amphotericin B- cyclodextrin 33
3.4. Nghiên cứu bào chế liposome chứa phức hợp amphotericin B- cyclodextrin . 35
3.4.1. Đánh giá hình thức, hình thái, kích thước tiểu phân, thế zeta của mẫu
liposome chứa phức hợp 35
3.4.2. Đánh giá hiệu suất liposome hoá và hàm lượng dược chất trong liposome 36
3.4.3. Đánh giá giải phóng in vitro 38
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 41
DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
TT
Viết tắt
Từ/cụm từ đầy đủ
1
α-CD
Anphacyclodextrin
2
β-CD
Beta cyclodextrin
3
HPβCD
Hydroxyl propyl beta cyclodextrin
4
AMB
Amphotericin B
5
CD
Cyclodextrin
6

16
TKHH
Tinh khiết hoá học
17
USP
United State Pharmacopoeia (Dược điển Mỹ)
18
Z
average
Kích thước tiểu phân trung bình

DANH MỤC BẢNG BIỂU
Số hiệu
Tên bảng biểu
Trang
Bảng 1.1.
Một số chế phẩm tiêm của AMB trên thị trường
6
Bảng 2.1.
Nguyên liệu
15
Bảng 3.1
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tá dược HPβCD tới phương
pháp đo quang UV-VIS
25
Bảng 3.2
Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tá dược lipid tới phương

chứa phức hợp.
35
Bảng 3.11
Kết quả sự khác biệt về hiệu suất liposome hoá giữa mẫu
liposome thường và liposome chứa phức hợp.
36
Bảng 3.12
Kết quả sự khác biệt về hàm lượng AMB giữa các mẫu
liposome AMB thường và liposome chứa phức hợp AMB-
CD.
37
Bảng 3.13
Kết quả đánh giá giải phóng invitro của liposome AMB
thường và liposome chứa phức hợp AMB-CD.
38

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ
Số hiệu
Tên hình vẽ, đồ thị
Trang
Hình 1.1.
Công thức hoá học của AMB.
2
Hình 1.2.
Cấu trúc liposome.
8
Hình 1.3.

Đồ thị đánh giá giải phóng in vitro liposome chứa phức
AMB-CD và liposome AMB thường.
39
1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Amphotericin B là một trong những kháng sinh chống nấm thế hệ đầu tiên, nó
bắt đầu được đưa vào sử dụng năm 1957. Trong nhiều năm, amphotericin B vẫn là một
thuốc chống nấm hiệu quả nhất để điều trị nấm toàn thân. Tuy nhiên, do có nhiều hạn
chế như là dược chất thân dầu, không tan trong nước, có nhiều tác dụng phụ nghiêm
trọng, đặc biệt là tác dụng phụ trên thận gây khó khăn trong việc ứng dụng trong lâm
sàng.
Để tăng hiệu quả điều trị cũng như hạn chế các tác dụng phụ nghiêm trọng của
thuốc, hàng loạt nghiên cứu về các hệ mang thuốc mới ra đời. Dạng chế phẩm tiêm ban
đầu của aqmphotericin B là dạng micell (chế phẩm Fungizone). Tuy nhiên ở dạng bào
chế này, amphotericin B không bền trong hệ tuần hoàn và nhanh chóng chuyển từ dạng
miccell sang dạng lipoprotein gây độc cho tế bào vật chủ, đặc biệt là độc tính trên thận.
Tiếp đến, dạng bào chế liposome của amphotericin B thể hiện nhiều ưu điểm song hàm
lượng amphotericin B sử dụng thấp, chỉ khoảng 9 mol % so với tổng lipid. Sự kết hợp
amphotericin B với cyclodextrin tạo thành phức hợp, đưa phức hợp vào khoang nước
của liposome là một hướng nghiên cứu mới đầy triển vọng. Dạng bào chế này có thể
tận dụng những ưu điểm đồng thời khắc phục được yếu điểm hàm lượng dược chất
thấp của liposome nhằm nâng cao hiệu quả điều trị, giảm độc tính, tăng liều sử dụng
của amphotericin B.
Để ứng dụng cyclodextrin làm chất mang thuốc và cải thiện độ tan của thuốc
trong nước, triển khai đề tài “ Nghiên cứu bào chế liposome mang phức aphotericin B
với cyclodextrin “ nhằm mục tiêu :
1. Xây dựng được qui trình bào chế phức hợp cyclodextrin- amphotericin B.
2. Bào chế được liposome mang phức hợp cyclodextrin- amphotericin B.
3. Đánh giá được một số đặc tính: kích thước tiểu phân, phân bố kích thước tiểu

Lý tính
- Bột kết tinh màu vàng hoặc da cam [3].
- Độ tan: AMB hầu như không tan trong nước (<0,1mg/ml ở 21
0
C), không tan
trong chloroform hay ethanol. Nó hòa tan trong dimethyl sulphoxide (DMSO) (30-40
mg/ml) và dimethylformamide (DMF) (2-4 mg/ml), tan được trong methanol [2].
Hoá tính
Hóa tính chính của AMB là của hệ dây nối đôi luân phiên, nhóm amin và nhóm
carboxylic tự do, do đó AMB có tính chất sau:
- Tính lưỡng tínhvà lưỡng thân.
- Tạo muối hơi tan trong nước khi tác dụng với acid hydrocloric hoặc các dung
dịch kiềm.
- Dung dịch AMB trong methanol có 3 cực đại hấp thụ ở 362, 381 và 405 nm. Tỷ
lệ độ hấp thụ ở 362 nm so với 381 nm là 0,57- 0,61, tỷ lệ độ hấp thụ ở 381 nm so với
405 nm là 0,87-0,93 [2].
1.1.4. Tác dụng dược lý
Cơ chế tác dụng: Cơ chế tác dụng của AMB, cũng như của các polyen khác, dựa
trên sự liên kết giữa đuôi kỵ nước của AMB với đuôi ergosterol trên màng tế bào nấm,
tạo các kênh trên màng tế bào, làm thay đổi tính thấm và tính khử cực của màng tế bào,
làm rò gỉ các chất bên trong tế bào ra ngoài và cuối cùng làm chết tế bào nấm. AMB
cũng có thể liên kết với các cholesterol trên màng tế bào người, điều này là nguyên
nhân chính gây tác dụng phụ nghiêm trọng của AMB. Ái lực của AMB với ergosterol
màng lớn hơn với cholesterol màng nên AMB thể hiện tác dụng chống nấm chủ yếu
nhưng vẫn tiềm tàng tác dụng phụ nghiêm trọng, đặc biệt là tổn thương thận với các
biểu hiện: suy thận, tăng creatinin và ure huyết, rối loạn chuyển hoá, tăng kali máu…
AMB có tác dụng kìm nấm đối với một số loại nấm như: Absidia, Aspergillus,
Basidiobolus, Blastomyces dermatitidis, Candida… Nồng độ ức chế tối thiểu đối với
các loại nấm này là 0,03- 1 mcg/ml.
4

- Dạng liposome hoặc phức hợp lipid: chỉ định cho trường hợp điều trị thất bại
bằng AMB thông thường hoặc trong trường hợp AMB có thể gây độc cho thân hoặc
gây suy thận[4].
1.1.7. Tác dụng không mong muốn
- Phản ứng chung: sốt, rét run, nôn, đau đầu, đau cơ khi mới tiêm truyền.
- Độc với thận: giảm sức lọc cầu thận, hoại tử thận.
- Tác dụng không mong muốn khác: thiếu máu, độc với gan tim, giảm K
+
và
Mg
2+
huyết… [4].
1.1.8. Liều dùng
Đường tiêm tĩnh mạch:
- AMB quy ước (Fungizone): bắt đầu với liều 0,25 mg/kg/ngày, tăng dần tới tối
đa 1mg/kg/ngày, trường hợp nặng, liều có thể cần tới 1,5 mg/kg/ngày hoặc cho cách 1
ngày.
- AMB dạng liposome: bắt đầu với liều 1 mg/kg/ngày, tăng dần tới 3- 4
mg/kg/ngày.
- Dạng phức hợp phospholipid: thường dùng với liều 5 mg/kg/ngày.
Đường uống:
- Viên 10 mg hoặc hỗn dịch chứa 100mg/ml.
- Nhiễm nấm Candida ở miệng: hỗn dịch dùng 1 ml/lần × 4 lần/ngày, giữ thuốc
trong miệng ít nhất 1 phút trước khi nuốt, viên tan trong miệng dùng 4 lần/ngày.
- Nhiễm nấm Candida ở ruột: 100- 200 mg/ngày, 4 lần/ngày [4].
1.1.9. Một số chế phẩm tiêm của amphotericin B trên thị trường


mg/kg/ngày
2
Abelcet
100
mg/20
ml
DMPC:
DMPG :AMB
(tỷ lệ mol 2
lipid là 7:3)
Phức hợp
lipid
35 –
50
Hỗn
dịch
5
mg/kg/ngày
3
Amphotec
50 mg,
100
mg
Phức hợp
AMB với
cholesteryl
sulfate
Phức hợp
lipid
50

việc phát triển các công thức thuốc lỏng, ứng dụng đặc tính quan trọng của
cyclodextrin là khả năng bao lấy các phân tử khách có kích thước và hình dạng phù
hợp với khoang kị nước làm tăng độ tan của các phân tử khách, tạo ra phức hợp
cyclodextrin- amphotericin B [23].
Cơ chế tạo thành phức hợp: động lực của sự hình thành phức hợp là sự giải
phóng ra các phân tử nước giàu enthalpy từ khoang. Các phân tử nước sẽ được thay thế
bởi các phân tử thuốc kị nước có mặt trong dung dịch để hình thành liên kết không
phân cực và giảm sức căng của vòng cyclodextrin dẫn đến một trạng thái năng lượng
thấp hơn, ổn định hơn [11].
Khả năng hình thành phức hợp phụ thuộc vào 2 yếu tố chính: sự phù hợp về
kích thước và hình dạng không gian giữa phân tử cyclodextrin với phân tử dược chất
hoặc một số nhóm chức quan trọng của phân tử dược chất; sự tương tác nhiệt động lực
học giữa các thành phần của hệ thống (phân tử cyclodextrin, phân tử dược chất, dung
môi).
Các hoạt động có tác động thúc đẩy sự thay đổi trạng thái cân bằng để hình
thành phức hợp:
- Sự dịch chuyển các phân tử nước phân cực từ khoang không phân cực của phân
tử cyclodextrin.
- Việc tăng số lượng các liên kết hydro do việc giải phóng các phân tử nước từ
khoang không phân cực ra môi trường dung môi.
- Giảm tương tác đẩy giữa các phân tử thuốc kị nước với môi trường nước.
- Sự gia tăng tương tác kị nước khi mà phân tử thuốc kị nước được chèn vào
khoang kị nước của phân tử cyclodextrin.
Thời gian cần thiết để đạt được đến trạng thái cân bằng cuối cùng của quá trình
hình thành phức hợp thường khá dài [11].
8

1.2.2. Liposome chứa phức hợp cyclodextrin- amphotericin B
1.2.2.1. Khái niệm về liposome
Liposome là dạng đặc biệt của vi nang và siêu vi nang, gồm một nhân nước ở

lipid

Hình 1.2: Cấu trúc của liposome[5]
9 Hình 1.3: Phân tử HSPC và DSPG[5].
HSPC và DSPG tham gia quá trình tạo thành lớp lipid kép. Ngoài ra, HSPC có
khả năng ức chế các quá trình peroxyd hóa lipid giúp màng lipid bền vững hơn, hạn
chế thủng màng gây rò rỉ dược chất, DSPG đóng vai trò quan trọng trong cơ chế hình
thành của liposome AMB bằng cách tạo phức với AMB bởi lực hút tĩnh điện ở pH 1-3
trong 1 dung môi không proton [15], [25].
Cholesterol
Cholesterol không tạo lớp kép mà tác dụng như một hệ đệm lỏng để điều chỉnh
thể chất của lớp lipid kép làm giảm tính thấm nước của liposome. Do đặc tính về cấu
trúc phân tử và độ tan, cholesterol lấp vào các khoang của phospholipid kép làm tăng
độ vững chắc cho màng liposome [6].
Ngoài ra, trong liposome AMB, cholesterol có ái lực tốt với AMB nên tạo liên
kết với AMB góp phần đưa dược chất vào pha dầu của cấu trúc liposome, giúp ổn định
cấu trúc này, hạn chế rò rỉ dược chất và giúp liposome vận chuyển AMB tới đích tác
dụng [16], [25].
Dược chất
AMB được phân bố trong cả 2 khoang thân dầu và thân nước của liposome
Trong khoang thân dầu, AMB được gắn chủ động vào liposome trong quá trình
tạo thành liposome bởi sự hình thành các liên kết tĩnh điện với DSPG và liên kết với
cholesterol trong thành phần vỏ phospholipid.
10

Trong khoang thân nước, AMB nằm trong phức hợp AMB- CD được gắn chủ
động vào liposome trong quá trình hydrat hoá màng film.

- Độ ổn định thấp: liposome kém ổn định cả về mặt vật lí , hóa học và sinh học
[13].
- Nguyên liệu đòi hỏi phải có độ tinh khiết cao, đắt tiền nên giá thành chế phẩm
cao [1],[7].
- Đa số các phương pháp bào chế liposome đều sử dụng dung môi hữu cơ để hòa
tan lipid gây tác động bất lợi đến sức khỏe nguời sử dụng và môi trường [20].
- Đa số các phương pháp bào chế liposome chỉ thích hợp ở quy mô phòng thí
nghiệm, rất khó để sản xuất ở quy mô lớn [13].
1.2.2.4. Độ ổn định
Một trong những lý do làm cho liposome chưa được đưa vào sản xuất hàng loạt
là vấn đề về độ ổn định của chế phẩm. Trong quá trình bảo quản, liposome không bền
cả về mặt vật lý và hóa học [6].
Hóa học:
Sự ổn định hóa học của phospholipid được xem xét trên 2 phương diện là sự
oxy hóa và sự thủy phân. Các quá trình này bị ảnh hưởng bởi pH, nhiệt độ, nồng độ
đệm, ion kim loại, sự tích điện của lớp phospholipid kép…. Bảo quản ở nhiệt độ thấp,
bảo vệ tránh ánh sáng và oxy môi trường được cho là sẽ làm chậm quá trình oxy hóa.
[6],[14].
Vật lý:
Sự ổn định vật lý được đánh giá trên các tiêu chí về KTTP, chỉ số PDI, sự tích
điện bề mặt, tính vững chắc của lớp màng kép, sự thẩm thấu của màng phospholipid
(hay chính là sự rò rỉ của dược chất qua màng) [14].
12

Độ ổn định của liposome là mối quan tâm lớn cho việc lưu trữ lâu dài. Một số
thay đổi như thay đổi KTTP, phân bố KTTP, hàm lượng thuốc và sự kệt tụ có thể xảy
ra khi lưu trữ trong thời gian dài [24].
1.3. Bào chế liposome chứa phức hợp amphotericin B-cyclodextrin
1.3.1. Bào chế phức hợp amphotericin B- cyclodextrin
Phương pháp bào chế phức hợp được sáng chế năm 1989 bởi các nhà khoa học

Đùn ép là một biện pháp làm giảm KTTP, sử dụng áp lực vừa phải để đẩy các
liposome trong dung dịch qua các màng lọc polycarbonate tiêu chuẩn với kích thước
màng xác định [19].
Đùn tuần tự bằng thiết bị mini – extruder:
Đùn ép có thể được thực hiện bằng cách sử dụng một hệ thống xylanh cầm tay
trang bị bộ giữ màng lọc với kích thước màng lọc phù hợp. Để có thể đùn ép qua lỗ lọc
200 nm, dung dịch liposome loãng phải được tuần tự đùn qua các màng lọc với kích
thước lỗ lọc lớn hơn. Sau đó, quá trình đùn ép dùng áp lực cao có thể được sử dụng để
có thể đẩy dung dịch qua màng lọc có đường kính 100 nm và nhỏ hơn.
Tuy nhiên, phương pháp này bị giới hạn bởi áp lực mà xylanh và bộ lọc có thể
chịu được, như cũng như áp lực có thể đẩy được bằng tay. Cụ thể, với nồng độ
phospholipid dưới 20 mg/ml và kích thước lỗ lọc lớn hơn 200 nm thì có thể đẩy dễ
dàng bằng tay. Nhược điểm khác là khó đẩy qua màng có kích thước lỗ lọc nhỏ do hạn
chế về lực đẩy bằng tay cũng như khả năng chịu áp lực của thiết bị. Ngoài ra, thể tích
mẫu có thể bào chế bằng phương pháp này thường hạn chế do quy mô của bộ dụng cụ
nhỏ[19].
14
Hình 1.4: Thiết bị đùn ép mini extruder[5].
1.4. Một số nghiên cứu về liposome chứa phức hợp amphotericin B-
cyclodextrin
Chakraborty và cộng sự đã bào chế liposome chứa phức hợp AMB-HPβCD bằng
phương pháp tiêm ethanol. Phức hợp AMB-CD được bào chế bằng phương pháp trộn
khô, HPβCD và AMB được trộn lẫn, sau đó đem đi nghiền bi, hỗn hợp rắn sau đó được
hoà tan trong đệm photphat pH 7,4 để tạo thành hỗn dịch. Hỗn dịch thu được sau đó
đem ly tâm lạnh, để loại bỏ phần dược chất tự do. Dung dịch thu được sau li tâm sẽ
dùng làm dung dịch hydrat hoá cho liposome. EPC và cholesterol được hoà tan trong
ethanol, sau đó dung dịch phức hợp được thêm vào tạo thành hỗn hợp lipid-ethanol-

TKHH
4
HP-β-cyclodextrin
Trung Quốc
TKHH
5
Cholesterol
Trung Quốc
TKHH
6
Phosphatidylcholin đậu nành đã
hydrogen hóa (hydrogenated soy
phosphatidylcholin)
Lipoid – Đức
NSX
7
Distearoyl phosphatidylglycerol
Lipoid – Đức
NSX
8
Chloroform
Labscan – Thái Lan
NSX
9
Methanol
Trung Quốc
TKHH
10
Nước cất pha tiêm
Việt Nam


 Hệ thống thiết bị phân tích kích thước Zetasizer nano ZS90 (Malvern – Anh).
 Thiết bị đùn mini extruder (Eastern Scientific – Mỹ).
 Bể siêu âm Ultrasonic LC 60H.
 Máy đo quang Hitachi U – 1800 (Nhật Bản).
 Máy thử hoà tan ERWEKA DT600 (Đức).
 Máy lọc tiếp tuyến tuyến MicroKros® Filter Modules (Spectrumlab- Mỹ).
 Cân phân tích Satorius BP121S, máy đo pH InoLab, tủ sấy, tủ lạnh, cân kỹ
thuật, các dụng cụ thủy tinh, lọ thủy tinh trung tính.
2.2. Nội dung nghiên cứu
- Xây dựng phương pháp định lượng AMB trong phức hợp và hỗn dịch liposome.
- Xây dựng qui trình bào chế phức hợp AMB-CD và khảo sát các yếu tố trong qui
trình và công thức bào chế ảnh hưởng đến đặc tính của phức hợp AMB-CD.
- Bào chế liposome chứa phức hợp AMB-CD và đánh giá các đặc tính của
liposome: KTTP, phân bố KTTP, hiệu suất liposome hoá, giải phóng in vitro.
2.3. Phương pháp nghiên cứu
2.3.1. Qui trình bào chế phức hợp amphotericin B- cyclodextrin
Qui trình bào chế phức hợp AMB-CD như sau:
Cân và hoà tan CD trong khoảng 16,5 ml nước cất, sau đó chỉnh pH dung dịch
đến pH = 12 bằng dung dịch NaOH 1 N (dung dịch 1).
Cân và hoà tan hoàn toàn AMB trong dung dịch 1 (dung dịch 2).
Đưa dung dịch 2 vào ngăn mát tủ lạnh, sau 1 khoảng thời gian ủ thích hợp, đưa
trở về nhiệt độ phòng.
Chỉnh pH dung dịch 2 đến 5,5 bằng dung dịch H
3
PO
4
1N.
Li tâm với tốc độ 6000 vòng/phút, thời gian là 10 phút.
Gạn lấy dịch li tâm, lọc qua màng lọc cenluloacetat 0,2 µm.