B Y T







 I  2015






LIPOSOME D

em hoàn thành tốt đề tài của mình.
Hà Nội, tháng 5 năm 2015
Sinh viên Ngô Thị Lan
MC LC
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN 2
1.1. Doxorubicin 2
1.1.1. Công thức, tính chất lý hóa 2
1.1.2. Dƣợc động học, cơ chế tác dụng, chỉ định, các chế phẩm trên thị trƣờng 2
1.2. Đại cƣơng về liposome 3
1.2.1. Khái niệm, cấu tạo 3
1.2.2. Phân loại 4
1.2.3. Những nghiên cứu trong nƣớc về liposome 8
1.3. Liposome biến đổi bằng cách PEG hóa 9
1.3.1. Khái niệm PEG hóa 9
1.3.2. Ƣu, nhƣợc điểm của liposome PEG hóa 9
1.3.3. Đặc tính của PEG 10
1.3.4. Ảnh hƣởng của thành phần PEG lên liposome 11
1.3.5. Phƣơng pháp gắn PEG vào liposome 13
1.3.6. Một số nghiên cứu về liposome doxorubicin PEG hóa trên thế giới 14
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu, nguyên vật liệu và phƣơng tiện nghiên cứu 16
2.1.1. Đối tƣợng nghiên cứu 16
2.1.2. Nguyên vật liệu 16
2.1.3. Phƣơng tiện nghiên cứu 17
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 17
2.2.1. Phƣơng pháp bào chế liposome doxorubicin 17

Dƣợc điển Việt Nam
4
DOX
Doxorubicin
5
DOX.HCl
Doxorubicin hydroclorid
6
DSPC
1,2-Distearoyl-sn -Glycero-3-Phosphocholin
7
DSPE-
PEG
2000

(N-(carbonyl-methoxypolyethylene glycol 2000)-1,2-distearoyl-
sn-glycero-3-phosphoethanolamine sodium salt)
8
EE
Hiệu suất liposome hóa
9
EPR
Hiệu ứng tăng tính thấm và thời gian lƣu
10
Glu
Glucose
11
HEPES
Dung dịch đệm N-2-hydroxy ethyl piperazin – N – 2 – ethan
sulfonic acid

pHSLs
[pH-sensitive (acidic-triggered) liposomes] - liposome nhạy
cảm với pH
22
PP
Phosphat
23
SPC
Phosphatidylcholin dầu đậu nành
24
TCCS
Tiêu chuẩn cơ sở
25
TKKH
Tinh khiết hóa học
26
TLs
[Thermosensitive (heat-triggered) liposomes] - liposome nhạy
cảm với nhiệt
27
Tt/tt
Thể tích/thể tích

DANH MNG
.
Các nguyên vật liệu được sử dụng
16
.
Kết quả đo mật độ quang các mẫu dung dịch DOX ở bước sóng
233 nm và 481 nm (pH 4)

.
Mối tương quan giữa mật độ quang và nồng độ
23
H.
Hình ảnh chụp TEM của ba công thức C1, C2, C3
27
.
Đồ thị biểu diễn ảnh hưởng của pH và loại đệm tới hiệu suất
liposome hóa
29
.
Đồ thị biểu diễn sự thay đổi hiệu suất liposome hóa của 2 công
thức sử dụng môi trường ngoài HEPES 7,5 và phosphat 7,5
30
.
Hình thức sau 28 ngày của hai mẫu HEPES 7,5 và phosphat
7,5
31
.
Đồ thị biểu thị ảnh hưởng của tá dược đẳng trương tới hiệu suất
liposome hóa
32
.
Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M1 sau 6 tháng
33
.
Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M2 sau 6 tháng
34
.
Đồ thị biểu diễn độ ổn định của công thức M3 sau 6 tháng

nghiên cứu bƣớc đầu đã đạt đƣợc những kết quả khích lệ, tuy nhiên cho đến thời
điểm hiện tại mới chỉ dừng lại ở việc bào chế liposome quy ƣớc với 2 thành phần là
phospholipid và cholesterol. Liposome quy ƣớc rất dễ bị bắt giữ bởi đại thực bào và
nhanh chóng thanh thải khỏi hệ tuần hoàn. Chƣa có nghiên cứu nào về việc sử dụng
dẫn chất polyme nhƣ PEG để tăng thời gian tuần hoàn và giảm tốc độ thanh thải của
liposome. Hơn nữa các nghiên cứu cũng đang gặp khó khăn trong việc nâng cao độ
ổn định cho chế phẩm. Để giải quyết các vấn đề này đề tài 
liposome  đƣợc thực hiện với hai mục tiêu chính:
1. Bào chế và khảo sát một số yếu tố ảnh hƣởng đến chất lƣợng hỗn dịch
liposome doxorubicin PEG hóa 2 mg/ml.
2. Theo dõi độ ổn định của liposome doxorubicin PEG hóa trong vòng 6 tháng
2

 TNG QUAN
1.1. Doxorubicin
1.1.1. 

Công thức phân tử: C
27
H
29
NO
11
.HCL.
Khối lƣợng phân tử: 579,99 [30], [31].

- Tên khoa học: (8S, 10S)-10-[(3-Amino-2,3,6-trideoxy- trideoxy-α-L-lyxo-
hexopyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(2-hydroxyacetyl)-1-
methoxy-5,12-naphthacenedion [30].
- Tính chất: Tinh thể hay bột vô định hình màu vàng cam, không mùi. Dung dịch 5

này vẫn còn đƣợc tranh cãi [15], [31].
1.1.2.3. Chỉ định
Ung thƣ vú, u xƣơng ác tính (sarcom xƣơng) và u xƣơng Ewing, u mô mềm, u khí
phế quản, u lympho ác tính cả hai dạng Hodgkin và không Hodgkin, ung thƣ biểu
mô tuyến giáp (carcinoma tuyến giáp). Ung thƣ đƣờng tiết niệu và sinh dục: ung thƣ
tử cung, ung thƣ bàng quang, ung thƣ tinh hoàn. Khối u đặc ở trẻ em: Sarcom cơ
vân, u nguyên bào thần kinh, u Wilm, bệnh leucemi cấp [1].
1.1.2.4. Các chế phẩm trên thị trường
Thuốc tiêm dung dịch doxorubicin 2 mg/ml: Adorucin, Adriamycin, Adrim.
Thuốc tiêm liposome doxorubicin: Caelyx, Doxil, Lipo-dox, Myocet.
Bột đông khô pha tiêm 10 mg, 20 mg, 50 mg, 150 mg: Adriblastina, Doxorubicina.
1.2.  liposome
1.2.1. 
Là một hệ mang thuốc gồm một nhân nƣớc ở giữa đƣợc bao bọc bởi một vỏ
phospholipid gồm một hay nhiều lớp đồng tâm có kích thƣớc thay đổi từ hàng chục
nanomet đến hàng chục micromet [6], [7], [8], [25].
4 1.1. C[11]
1.2.2. 
1.2.2.1. Theo kích thước và số lớp
Gồm các loại: Liposome đa lớp đồng trục (MLV), liposome kép (liposome trong
liposome – MVV), liposome đơn lớp lớn (LUV), liposome đơn lớp nhỏ (SUV),
liposome đơn lớp khổng lồ (GUV), liposome đa lớp nhỏ (OLV) [12], [32], [33].

1.2. c mt s loi liposome [5]
1.2.2.2. Theo cấu tạo, thành phần
Liposome quy ước
Là liposome có cấu tạo lớp vỏ chủ yếu là phospholipid và cholesterol. Liposome

tính thấm và thời gian lƣu) do đƣợc kiểm soát trong suốt quá trình điều trị, thuốc
đƣợc giải phóng rất nhanh trong các mạch máu của khối u, sau đó là sự hấp thu
nhanh chóng của các tế bào xung quanh. Ngoài ra, thuốc đƣợc phân phối tới khối u
ở dạng tự do, góp phần cải thiện sinh khả dụng và khả năng xâm nhập khối u.
6

Nhƣợc điểm chính khi sử dụng liposome loại này là không hiệu quả trong điều trị
khối u đã di căn vì sử dụng TLs đòi hỏi phải có hiểu biết chính xác về vị trí khối u
[14]. Tại thời điểm hiện nay công ty Celsion Corporation (USA) đã bào chế thành
công thuốc tiêm liposome doxorubicin nhạy cảm nhiệt độ (ThermoDox) và đang
thử nghiệm lâm sàng pha III trên bệnh nhân ung thƣ gan và pha II trên bệnh ung thƣ
vú [7].
Liposome nhạy cảm ánh sáng (light-sensitive liposome)
Liposome có thể đƣợc tạo thành với các lipid nhạy cảm với ánh sáng. Các tác nhân
nhạy cảm ánh sáng nhƣ dẫn chất porphyrin, chlorins, phthalocyanines tạo ra oxy
nguyên tử sau khi phơi nhiễm ánh sáng và đƣợc sử dụng để kích thích tiêu diệt các
tế bào ung thƣ. Liposome nhạy cảm ánh sáng đƣợc ứng dụng nhiều trong điều trị
những khối u nông [14].
Liposome nhạy cảm pH [pH-sensitive (acidic-triggered) liposomes – pHSLs]
Đƣợc bào chế từ các phospholipid nhạy cảm với pH thấp (< 7), dƣới tác động của
pH acid trong nội bào hoặc ở khối u, lớp vỏ liposome sẽ bị phá vỡ và giải phóng
dƣợc chất ra khỏi liposome. Hệ phân phối thuốc chỉ có thể bị phá vỡ trong
endosomes/lysosomes, giải phóng dƣợc chất theo cơ chế dung hợp với màng tế bào.
Ví dụ điển hình cho liposome loại này là các liposome có thành phần lớp vỏ gồm
dioleylphosphoethanolamine (DOPE) và cholesterylhemisuccinate (CHEMS).
Những thành phần này gây ra sự mất ổn định màng liposome ở pH acid yếu, cho
phép hợp nhất với màng endosome/lysosome và giải phóng thuốc vào trong tế bào
chất [14].
Liposome có từ tính (Magnetic liposomes –MLs)
Các phân tử sắt oxid Fe

phospholipid trung hòa có nhiệt độ chảy cao, đƣợc bao bề mặt bằng các phân tử
polyme thân nƣớc nhƣ PEG, vì vậy liposome có cấu trúc không gian cồng kềnh nên
tránh đƣợc sự nhận diện của quá trình opsonin hóa làm tăng thời gian lƣu trú trong
hệ tuần hoàn. Với kích thƣớc nhỏ (100 – 200 nm) liposome dễ dàng xâm nhập vào
mô ung thƣ mà không qua đƣợc thành mạch của mô lành. Đây đƣợc gọi là hiệu ứng
tăng tính thấm và thời gian lƣu (EPR). Liposome tuần hoàn dài vận chuyển thuốc
theo cơ chế thụ động dựa trên thời gian lƣu trú lâu trong hệ tuần hoàn của liposome
và tính thấm cao của thành mạch mô ung thƣ [7].
Liposome vận chuyển chủ động (active targeted liposome): Đƣợc chức năng hóa
bề mặt bằng các phối tử (ligand) đƣợc nhận biết bởi các thụ cảm (receptor) trên bề
mặt tế bào mô đích. Những liposome này đƣợc nghiên cứu để vận chuyển chủ động
đến mô ung thƣ. Tế bào ung thƣ sản sinh ra rất nhiều các protein, hormon, enzym có
tính kháng nguyên và những kháng nguyên này sẽ đƣợc nhận biết bởi các kháng thể
tƣơng ứng. Trên bề mặt tế bào ung thƣ có chứa gấp nhiều lần kháng nguyên cũng
8

nhƣ thụ cảm so với các mô lành. Ví dụ nhƣ thụ cảm của các yếu tố tăng trƣởng
(folat receptor, transferrin receptor), protein trên bề mặt tế bào nội mô ung thƣ [7].
1.2.3. 
, ThS. Nguyễn Văn Lâm đã nghiên cứu và đƣa ra đƣợc công
thức và quy trình bào chế cho thuốc tiêm liposome DOX 2 mg/ml. Liposome đƣợc
bào chế bằng phƣơng pháp hydrat hóa film với thành phần màng lipid gồm SPC và
Chol (7 : 3, tỉ lệ mol), giảm kích thƣớc tiếu phân bằng siêu âm, đổi môi trƣờng
ngoài liposome là amoni sulfat bằng hệ thống lọc tiếp tuyến tự động, tạo ra các
liposome có sự chênh lệch pH hai bên màng. Sau đó bơm hỗn dịch này vào các lọ
thủy tinh có chứa bột đông khô của DOX và ủ ở 50
o
C trong 15 phút. Kết quả tạo ra
liposome DOX có kích thƣớc dƣới 200 nm, hiệu suất liposome hóa trên 80%. Đánh
giá tác dụng của liposome DOX trên khối u động vật cho thấy ƣu thế vƣợt trội của

gian lƣu hành trong tuần hoàn tăng nên thời gian tập trung ở mô đích tăng nhờ hiệu
ứng EPR [23], [24], [27], [28].
1.3.2.  
m c
- Ƣu điểm nổi bật nhất là giảm mạnh hấp thu vào MPS (hệ đại thực bào đơn nhân)
và kéo dài thời gian tuần hoàn do đó cải thiện đƣợc sự phân bố vào các mô đƣợc
tƣới máu [16], [19]. Blume và các cộng sự đã làm sáng tỏ đƣợc thời gian tuần hoàn
trong máu tăng là do giảm tƣơng tác giữa các liposome với các protein trong huyết
tƣơng và các protein trên bề mặt tế bào [19]. Liposome biến đổi bề mặt bằng cách
PEG hóa sẽ hình thành một lớp nƣớc bao quanh liposome do tƣơng tác giữa polyme
– PEG và phân tử nƣớc, nhờ đó mà ngăn cản đƣợc hiện tƣợng opsonin hóa [26],
[29].
- Chuỗi PEG trên bề mặt liposome cũng giúp tránh đƣợc hiện tƣợng kết tụ các
liposome nên cải thiện đƣợc độ ổn định công thức. Needham và các cộng sự (1992)
đã chứng minh rằng sự có mặt của PEG trên bề mặt liposome tạo ra lực đẩy lớn
giữa các lớp màng kép, lực này thắng đƣợc lực hút Van der Waals do đó liposome
sẽ ổn định hơn nhờ tránh đƣợc lực gây kết tụ [17], [19].
10

- Khác với liposome quy ƣớc, dƣợc động học của liposome PEG hóa không phụ
thuộc vào liều. Việc tăng liều sử dụng ít làm tăng tốc độ thanh thải của thuốc, tốc độ
thanh thải chỉ tăng nhanh trong trƣờng hợp liều rất thấp [13].
- Độc tính trên tim, suy tủy, rụng tóc và nôn giảm đáng kể so với doxorubicin
truyền thống khi dùng với liều đạt hiệu quả tƣơng đƣơng [19].

- Việc PEG hóa không giúp liposome hoàn toàn tránh khỏi sự hấp thu của các tế bào
thuộc hệ thống lƣới nội mô. Moghimi và Szebeni (2003) đã kiểm tra một cách chính
xác những cơ chế để đạt đƣợc thời gian tuần hoàn kéo dài của các liposome “ngụy
trang”. Nghiên cứu cho thấy liposome PEG hóa không hoàn toàn trơ về mặt sinh
học và đã có một số bằng chứng cho thấy rằng polyme có thể gây ra hoạt hóa hệ

động chuỗi PEG cũng tăng đáng kể khi cholesterol bị loại bỏ khỏi lớp màng kép ở
nồng độ trên 20 %mol [10].
Ảnh hưởng của khối lượng phân tử PEG
- Việc sử dụng phƣơng pháp phổ cộng hƣởng từ hạt nhân
1
H NMR đã chứng minh
`phân tử lƣợng của PEG trong PEG-lipids đƣợc gắn lên bề mặt liposome có ảnh
hƣởng đến độ linh động của chuỗi PEG tại bề mặt liposome. Khối lƣợng phân tử
PEG tăng sẽ làm tăng độ linh động trên bề mặt liposome [10].
- Trong hầu hết các trƣờng hợp, chuỗi PEG dài hơn sẽ làm tăng thời gian tuần hoàn
trong máu tốt hơn. Allen và cộng sự (1991) đã báo cáo rằng nồng độ liposome trong
máu cao hơn khi sử dụng liposome SM/PC/Chol/DSPE-PEG với khối lƣợng phân
tử PEG lớn hơn (PEG
1900
, PEG
5000
) so với liposome chứa PEG-lipid với PEG chuỗi
ngắn hơn (ví dụ PEG
750,
PEG
120).
Sử dụng PEG
2000
thu đƣợc gấp đôi lƣợng lipid còn
lại trong huyết tƣơng so với công thức có PEG phân tử lƣợng 350 tới 750 [19].
- Một số nghiên cứu gần đây đã đánh giá đƣợc ảnh hƣởng độ dài chuỗi PEG của các
liposome đƣợc PEG hóa lên thời gian bán thải ở invivo. Dos Santos và các cộng sự
đã thấy rằng các liposome đƣợc PEG hóa với 5 %mol PEG
350
, PEG

Ảnh hưởng của mật độ PEG.
- Mật độ phân tử PEG xác định mức độ che phủ và khoảng cách giữa các phân tử
đƣợc gắn vào liposome và xác định hình dạng PEG trên bề mặt liposome
- Walkey và cộng sự đã đánh giá tác dụng của mật độ PEG lên tốc độ thanh thải và
hiện tƣợng opsonin hóa liposome. Kết quả cho thấy mức độ opsonin hóa có tỉ lệ với
kích thƣớc liposome và mật độ phân tử PEG trên bề mặt, với mật độ PEG cao (>
0,75 PEG/nm
2
) khả năng ức chế quá trình opsonin hóa lên tới 99% so với các
liposome không PEG hóa. Các liposome với mật độ PEG hóa thấp (< 0,16
PEG/nm
2
) đƣợc hấp thu thông qua cơ chế phụ thuộc vào huyết tƣơng còn các
liposome với mật độ PEG hóa cao (> 0,64 PEG/nm
2
) lại độc lập với huyết tƣơng,
tức là bất cứ protein huyết tƣơng nào hấp phụ lên liposome cũng không ảnh hƣởng
đến quá trình hấp thu liposome [10].
- Phân tử PEG đƣợc gắn trên bề mặt của liposome làm giảm mạnh lực hút Van der
Waals và tăng lực đẩy giữa các liposome. Việc tăng nồng độ PEG làm giảm kết tụ,
giảm dần kích thƣớc liposome và cuối cùng hòa tan hoàn toàn LUV vào trong các
micell ở 30 %mol DSPE-PEG. Kích thƣớc của liposome giảm dần khi tăng nồng
độ DSPE-PEG %mol ngoại trừ 7 ± 2 %mol [15].
- Đối với liposome lƣợng PEG tối ƣu bao phủ lên bề mặt liposome nằm trong
khoảng 5 %mol và 9 %mol của PEG
2000
. Ở nồng độ đó mỗi chuỗi polyme ở dạng
cấu trúc hình nấm (mushroom) liên kết yếu với nhau tạo nên sự che phủ toàn bộ bề
mặt liposome để ngăn cản hiện tƣợng opsonin hóa. Dƣới khoảng này, độ che phủ bề
13

2000
(20 %mol) [20].
Hiện nay việc sử dụng PEG
2000
nồng độ 5 %mol đƣợc chấp nhận để đạt đƣợc
thời gian tuần hoàn trong máu tối ƣu. Đây cũng là loại PEG đƣợc sử dụng nhiều
nhất trong các chế phẩm liposome PEG hóa lƣu hành trên thị trƣờng. Tuy nhiên
việc sử dụng PEG
2000
chủ yếu dựa trên sự lựa chọn ngẫu nhiên chứ không phải dựa
trên các lý luận khoa học.
1.3.5. 
Có nhiều cách để gắn PEG vào liposome, trong đó có ba cách điển hình sau:
- Dùng phƣơng pháp vật lý để hấp thụ polyme vào bề mặt của liposome.
- Hợp nhất các PEG-lipid trong quá trình bào chế liposome.
14

- Gắn các nhóm phản ứng tạo liên kết đồng hóa trị lên bề mặt của các liposome đã
tạo thành trƣớc [19].
1.3.6. u  

Neus Lozano và cộng sự đã công bố nghiên cứu về liposome-ICG DOX PEG hóa
gắn kháng thể hƣớng đích đơn dòng (Indocyanine green – ICG). Liposome đƣợc
bào chế bằng phƣơng pháp hydrat hóa film. HSPC/Chol/DSPE-PEG
2000

(56,3:38,2:5,5; tỉ lệ phần trăm mol) đƣợc hòa tan trong chloroform/methanol (4:1,
tt/tt), dung môi đƣợc bốc hơi dƣới áp suất giảm bằng thiết bị cất quay. Lớp film
mỏng đƣợc hydrat hóa với dung dịch dextrose có chứa ICG (có thêm DOX nếu cần
tạo liposome-ICG DOX PEG hóa). Giảm kích thƣớc tiểu phân bằng cách đông chảy

ung thƣ. DDA-LDOX có thời gian tuần hoàn dài trong dòng máu và có mối liên hệ
đặc biệt với tế bào ung thƣ. Nó cũng có tác dụng chống ung thƣ rất mạnh trên chuột
đƣợc cấy M5076 ovarian sarcoma, điều này xảy ra cả với tế bào đã kháng với DOX.
Hơn nữa các liposome này có khả năng duy trì nồng độ DOX trong tế bào ung thƣ
trong một thời gian dài. Những kết quả này đã cho thấy những lợi ích về tác dụng
chống ung thƣ của DDA-liposome trên tế bào M5076 ovarian sarcoma. Nghiên cứu
đã mở ra một hƣớng mới trong việc sử dụng dẫn chất polyme cho việc chữa trị
chống lại những tế bào ung thƣ đã kháng thuốc [29].
Qua một số nghiên cứu trên ta thấy rằng xu hƣớng hiện nay trên thế giới là
tập trung phát triển các liposome biến đổi bề mặt hoặc biến đổi thành phần cấu tạo
vỏ. Bào chế các dạng liposome biến đổi nhằm tăng tính hƣớng đích, giải phóng
thuốc có kiểm soát góp phần tăng tác dụng điều trị, giảm kháng thuốc và tác dụng
phụ.

16

 U


- Liposome PEG hóa.
- Liposome DOX PEG hóa.

Bng 2.1. t lic s dng
STT
Tên nguyên liệu
Nguồn gốc
Tiêu chuẩn
1
Doxorubicin hydroclorid
Ấn Độ

USP
9
Kali dihydrophosphat
Trung Quốc
TKHH
10
Dinatri hydrophosphat
Trung Quốc
TKHH
11
Triton X100 (Octylphenolpoly –
(ethylen glycolether)
Amresco Ohio-Mỹ
TKHH
12
Túi thẩm tích
Spectrum laboratory-Mỹ
TCCS
13
Natri hydroxid
Trung Quốc
TKHH
14
Acid hydroclorid
Trung Quốc
TKHH
15
Natri clorid
Trung Quốc
TKHH