ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

TỐNG THỊ THU CÚC

GÓP PHẦN NGHIÊN CỨU CƠ CHẾ PHẢN ỨNG ESTERASE
BẰNG PHƯƠNG PHÁP HÓA TIN Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý
Mã số: 60.44.01.19 DỰ THẢO TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ HÓA HỌC

Hà Nội – 2015

Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Khoa học Tự nhiên

trong cơ thể sống: phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym
acetylcholinesterase. Phản ứng được mô phỏng bằng các phương pháp
hóa tin để làm rõ những yếu tố xác định hoạt tính của enzym.
Lý do lựa chọn đề tài
Ngày nay, cùng với sự hoàn thiện của các phương pháp tính
hóa lượng tử, sự xâm nhập của hóa học lý thuyết vào lĩnh vực xúc tác
enzym cũng ngày càng phát triển. Nghiên cứu hệ xúc tác enzym để
làm sáng tỏ bản chất hóa học của các phản ứng trong cơ thể sống đang
được nhiều nhà khoa học quan tâm. Một khi các phương pháp lý thuyết
thành công trong lĩnh vực này sẽ định hướng cho việc điều chỉnh, can
thiệp vào các quá trình diễn ra trong cơ thể sống trước khi thử nghiệm
trực tiếp trên cơ thể, hạn chế được rủi ro, nguy hiểm.
Đến nay, các phương pháp lý thuyết nghiên cứu hệ xúc tác
enzym đang trong quá trình hoàn thiện, vì vậy việc tiếp cận để cải tiến
các phương pháp này là một hướng phát triển được ưu tiên vì nó sẽ tạo
ra một bước nhảy vọt trong hóa lý thuyết, đưa lý thuyết tiến gần hơn
đến thực nghiệm.
Trong nhóm esterase, acetylcholinesterase là enzym có hoạt
tính cao và tham gia trực tiếp vào quá trình truyền dẫn xung thần kinh.
Bằng thực nghiệm, tác giả Harry C. Froede và Irwin B. Wilson đã sử
dụng phương pháp nguyên tử đánh dấu
3
H để khảo sát cơ chế của phản
ứng thủy phân acetylcholine nhờ xúc tác acetylcholinesterase và đề
xuất cơ chế acylenzym. Với mong muốn góp phần làm sáng tỏ cơ chế
đã được đề xuất từ thực nghiệm, chúng tôi sử dụng phương pháp hóa
tin trong đề tài "Góp phần nghiên cứu cơ chế phản ứng esterase
bằng phương pháp hóa tin".
2


- Về mặt thực tiễn: Những đặc điểm biến đổi về mặt cấu trúc
và năng lượng phản ứng có thể gợi mở cho những ứng dụng mô phỏng
sinh học và điều chỉnh, can thiệp vào các quá trình xảy ra trong cơ thể
sinh vật.
Những điểm mới của luận án
- Trong luận án, tác giả đã sử dụng các phương pháp hóa tin
để khảo sát chi tiết phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym ở cá
đuối điện và ở người, phân tích, so sánh phản ứng ở hai trường hợp kể
trên để phân định vai trò của các yếu tố cấu trúc đối với hoạt tính của
enzym và chỉ rõ quá trình tạo phức với enzym đã hình thành.
- Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của một số chất ức chế đến phản
ứng bằng kĩ thuật protein docking và phương pháp QM/MM. Kết quả
cho thấy rằng 6 chất được khảo sát đều có khả năng neo đậu tại hốc
phản ứng để thực hiện chức năng ức chế của mình.
- Từ các số liệu thu được bằng các phương pháp hóa tin đã
khẳng định lại cơ chế đề xuất từ thực nghiệm là có cơ sở.
Bố cục của luận án
MỞ ĐẦU
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
CHƯƠNG 2. NGUỒN DỮ LIỆU VÀ CÔNG CỤ TÍNH TOÁN
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
KẾT LUẬN
KIẾN NGHỊ VỀ NHỮNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO
CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC CỦA TÁC GIẢ LIÊN QUAN
ĐẾN LUẬN ÁN

4

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan đối tượng nghiên cứu

vậy, hoạt tính xúc tác của mỗi đơn vị acetylcholinesterase trong các
dạng cấu trúc này tương đương nhau. Do đó, trong luận án enzym được
mô phngr ở dạng monome.
1.1.2. Cơ chế của phản ứng xúc tác enzym
Với acetylcholinesterase, kết quả thực nghiệm xác nhận sự tạo
phức giữa enzym và cơ chất. Cơ chất trước tiên phản ứng với tâm xúc
tác nằm trên Ser200 ở cá đuối điện hoặc Ser203 ở người để tách ra
choline, sau đó tâm xúc tác đã bị acetyl hóa sẽ tái tạo lại bằng cách
phản ứng với phân tử nước. 6

1.1.3. Một số chất ức chế đối với acetylcholinesterase
Donepezil Galantamin Tacrin
Neostigmin Physostigmin Rivastigmin
1.2. Tình hình nghiên cứu
Cấu trúc của enzym đã được xác định bằng phương pháp
nhiễu xạ tia X và được lưu trũ trong ngân hàng cơ sở dữ liệu protein.
Nhiều chất ức chế acetylcholinesterase đã được thử nghiệm
lâm sàng, và đưa vào sử dụng để điều trị các chứng bệnh như
Alzheimer, Parkinson, tăng nhãn áp, … trong đó có các chất đã nêu ở
phần 1.1.3.
Harry C. Froede và Irwin B. Wilson bằng thực nghiệm đã đưa
ra bằng chứng về cơ chế acylenzym với Ser200/203 đóng vai trò tác
nhân nucleophin và His440/447 đóng vai trò xúc tác axit – bazơ.
1.4. Tổng quan phương pháp nghiên cứu
1.4.1. Phương pháp cơ học phân tử
Trong phương pháp cơ học phân tử, phân tử được mô hình
như hệ các quả cầu và lò xo, gồm các nguyên tử được giữ với nhau

2.1. Nguồn dữ liệu
Cấu trúc enzym ở cá đuối điện và ở người được lấy từ ngân
hàng cơ sở dữ liệu protein, với mã lần lượt là 1EVE và 4EY4. Các
aminoaxit bị thiếu được bổ sung dùng phần mềm Acelrys Discovery
Studio 4.0 Visualizer và GaussView 5.0.8 và tối ưu lại dùng trường
lực Amber.
2.2. AutoDock Vina 1.1.1
AutoDock Vina được dùng để khảo sát docking. Trong
AutoDock Vina các thông số của hàm đánh giá được đặt sẵn từ kết quả
khớp với ngân hàng cơ sở dữ liệu PDB. Thuật toán tìm kiếm được sử
dụng là lặp đi lặp lại các bước đột biến và tối ưu cục bộ theo tiêu chuẩn
Metropolis.
2.3. Gaussian 09W và GaussView 5.0.8
Gaussian là phần mềm tính toán hóa học được sử dụng rộng
rãi, kết hợp với GaussView để hỗ trợ giao diện đồ họa. Các tính toán
QM/MM trong luận án được thực hiện trên Gaussian 09W.
Phân vùng QM bao gồm phân tử acetylcholine, tâm xúc tác
Ser200 ở cá đuối điện hoặc Ser203 ở người, nhánh của His440 ở cá
đuối điện hoặc His447 ở người, phần còn lại của phân tử enzym được
tính theo phương pháp MM (hình 2.4).
9 Hình 2.4. Phân vùng QM, MM cho hệ phản ứng thủy phân
acetylcholine nhờ xúc tác acetylcholinesterase

10

CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.1. Kết quả khảo sát docking cho cơ chất acetylcholine

12

Hình 3. 12. Cấu trúc tối ưu Tp_INT2
Trên hình 3.13 là cấu trúc tối ưu của trạng thái tách choline
Tp_INT3. Trong cấu trúc Tp_INT3, nguyên tử H(14) chuyển từ
His440 sang liên kết với O(26), liên kết C(24) – O(26) đã đứt hẳn. Hình 3.13. Cấu trúc tối ưu Tp_INT3
13

Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp giai đoạn tạo phức Tp_TS1
(hình 3.15) được khoanh vùng bằng cách quét thế theo khoảng cách
C(24) – O(6) từ trạng thái Tp_INT1 đến Tp_INT2.
Hình 3.15. Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp
giai đoạn tạo phức Tp_TS1

Năng lượng hoạt hóa của giai đoạn tạo phức ở cá đuối điện là
4.581 kcal/mol.
Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp giai đoạn tách choline Tp_TS2
(hình 3.18) được khoanh vùng bằng cách quét thế theo khoảng cách
N(11) và H(14) từ trạng thái Tp_INT2 đến Tp_INT3. Năng lượng hoạt
hóa của giai đoạn tách choline ở cá đuối điện là 7.598 kcal/mol.
14

Hình 3.18. Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp
giai đoạn tách choline Tp_TS2
Trên hình 3.19 là sơ đồ biến đổi năng lượng chung cho 2 giai
đoạn. Năng lượng hoạt hóa cho giai đoạn acyl hóa ở cá đuối điện là
4.581 kcal/mol.

Hình 3. 27. Cấu trúc tối ưu Ho_INT1
17

Hình 3.30. Cấu trúc Ho_INT2
Hình 3. 31. Cấu trúc Ho_INT3
Trong cấu trúc Ho_INT1, khoảng cách giữa C(24) và O(8) là
2.666 Å, lớn hơn khoảng cách tương ứng trong cấu trúc Tp_INT1.
Phân tử acetylcholine cũng bị kéo giãn và momen lưỡng cực tăng từ
6.626 Debye lên 9.606 Debye. Trong trạng thái phức Ho_INT2, sự
18

biến đổi độ dài liên tại tâm phản ứng nằm giữa trạng thái Tp_INT2 và
Tp_TS2.
Cấu trúc các trạng thái chuyển tiếp Ho_TS1 và Ho_TS2 được
khoanh vùng và thể hiện lần lượt trên hình 3.33 và 3.35.
Hình 3.33. Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp giai đoạn tạo phức
ở người Ho_TS1
Hình 3.35. Cấu trúc trạng thái chuyển tiếp giai đoạn tách choline
ở người Ho_TS2
19

Sơ đồ biến đổi năng lượng cho giai đoạn tạo phức và tách
choline ở người được biểu diễn trên hình 3.36.
Hình 3.36. Sơ đồ biến đổi năng lượng của quá trình tạo phức và
tách choline ở người
Năng lượng hoạt hóa cho giai đoạn acyl hóa ở người là 11.943
kcal/mol, cao hơn so với trường hợp ở cá đuối điện.
Tương tự như trường hợp ở cá đuối điện, đối với enzym ở
người, vòng Trp86 có vai trò neo giữ gốc amoni bậc 4 trong phân tử
acetylcholine để phân tử có định hướng thuận lợi trên tâm xúc tác.

Hình 3.52. Các vị trí gắn kết thuận lợi của Donepezil lên
acetylcholinesterase ở người
3.3.2. Kết quả docking của Galantamin
Galantamin gắn kết thuận lợi tại hốc phản ứng của
acetylcholinesterase ở cá đuối điện với mức năng lượng gắn kết -9.7
kcal/mol.
Với acetylcholinesterase ở người, Galantamin ghi nhận được
các trạng thái gắn kết thuận lợi tại hốc phản ứng và các hõm α, β, γ.
Năng lượng gắn kết thấp nhất với Galantamin trong hốc phản ứng là -
9.0 kcal/mol.
3.3.3. Kết quả docking của Tacrin
Tacrin gắn kết thuận lợi trong hốc phản ứng của enzym ở cá
đuối điện với mức năng lượng -8.6 kcal/mol.
Ở người, mức năng lượng gắn kết thấp nhất của Tacrin là -8.7
kcal/mol khi Tacrin nằm trong hốc phản ứng. Tacrin còn gắn kết thuận
lợi gần hõm α.
3.3.4. Kết quả docking của Neostigmin
22

Neostigmin gắn kết thuận lợi tại hốc phản ứng của enzym ở
cá đuối điện và ở người với mức năng lượng lần lượt là -7.5 kcal/mol
và -6.7 kcal/mol. Ở người, Neostigmin còn gắn kết thuận lợi tại hõm
α, γ.
3.3.5. Kết quả docking của Physostigmin
Physostigmin gắn kết thuận lợi tại hốc phản ứng của enzym ở
cá đuối điện và ở người với năng lượng lần lượt là -8.7 kcal/mol và -
7.7 kcal/mol. Với enzym ở cá đuối điện còn ghi nhận các trạng thái
gắn kết tại hõm α; với enzym ở người, ghi nhận các trạng thái gắn kết
tại hõm α, γ.
3.3.6. Kết quả docking của Rivastigmin

2. Làm rõ các yếu tố quyết định hoạt tính xúc tác của
acetylcholinesterase:
+ Acetylcholine hình thành cấu trúc phức với enzym tại tâm
xúc tác trên Ser200 trong trường hợp ở cá đuối điện hoặc Ser203 trong
trường hợp ở người;
+ Các aminoaxit His440 (ở cá đuối điện) hay His447 (ở người)
đều đóng vai trò là xúc tác axit – bazơ;
+ Trp84 (ở cá đuối điện), Trp86 (ở người) có vai trò neo giữ
gốc amoni bậc bốn của acetylcholine để cơ chất có định hướng thuận
lợi trên tâm xúc tác;
+ Phần còn lại của acetylcholinesterase đóng vai trò làm bộ
khung, đồng thời tạo trường điện tích ổn định cấu trúc phức và quyết
định mức độ phản ứng.
3. Đánh giá sơ bộ ảnh hưởng của một số chất ức chế (bao gồm
Donepezil, Galantamin, Tacrin, Neostigmin, Physostigmin,
Rivastigmin) đến phản ứng thủy phân acetylcholine nhờ enzym ở cá
đuối điện và ở người: cả 6 chất đều có khả năng gắn kết thuận lợi tại