BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

------  ------

PHẠM THỊ HẢO
Mã sinh viên: 1101150

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH
HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT NHYDROXYPROPENAMID MANG
KHUNG 3-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-2OXOINDOLIN HOẶC 3SPIRO[1,3]DITHIOLAN-2OXOINDOLIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

------  ------

PHẠM THỊ HẢO
Mã sinh viên: 1101150

TỔNG HỢP VÀ THỬ TÁC DỤNG SINH
HỌC CỦA MỘT SỐ DẪN CHẤT NHYDROXYPROPENAMID MANG
KHUNG 3-SPIRO[1,3]DIOXOLAN-2OXOINDOLIN HOẶC 3SPIRO[1,3]DITHIOLAN-2OXOINDOLIN
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn
DS. Đỗ Thị Mai Dung
Nơi thực hiện

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH LỤC CÁC HÌNH
DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
ĐẶT VẤN ĐỀ

1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

2

1.1. HISTON DEACETYLASE

2

1.1.1. Khái niệm histon deacetylase

2

1.1.2. Phân loại các HDAC:

2

1.1.3. Cơ chế tác động của HDAC đến ung thư

3

1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC



1.3.2.2. Thay đổi cầu nối

10

1.3.2.3 Thay đổi cả phần cầu nối và nhóm khóa hoạt động

12

1.4. CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG NƯỚC
13
CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

15

2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ

15


2.1.1. Hóa chất

15

2.1.2. Thiết bị, dụng cụ

15

2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU


3.1.1. Tổng hợp hóa học

21

3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết

29

3.1.3. Xác định cấu trúc

30

3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

35

3.2.1. Thử tác dụng ức chế HDAC

35

3.2.2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro

36

3.3. BÀN LUẬN

37

3.3.1. Hóa học


TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
13

C-NMR

: Cộng hưởng từ hạt nhân 13C (Carbon nuclear magnetic
resonance)

1

H-NMR

: Cộng hưởng từ hạt nhân 1H (proton nuclear magnetic
resonance)

DCM

: Dicloromethan

DMF

: Dimethyl formamid

HDAC


T°nc

: Nhiệt độ nóng chảy

TLC

: Phương pháp sắc ký lớp mỏng

TSA

: Trichostatin A

TsOH

: Acid p-toluensulfonic

IC50

: Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Phân loại HDAC

3

Bảng 1.2. Phân loại các chất ức chế HDAC

4


Bảng 3.7: Kết quả nồng độ ức chế tối thiểu IC50 HDAC của các dẫn chất IVa-d

36

Bảng 3.8: Kết quả thử hoạt tính kháng tế bào ung thư của các dẫn chất IVa-d

37

Bảng 3.9: Kết quả thử hoạt tính của các acid hydroxamic có khung 3hydroxyimino-2-oxoindolin và 3-methoxyimino-2-oxoindolin

40

Bảng 3.10: Kết quả thử hoạt tính của các acid hydroxamic mang cầu nối
heptanamid

41

Bảng 3.11: Kết quả thử hoạt tính của các dẫn chất N-hydroxypropenamid mang
khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin khác

41


DANH LỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Mô tả hoạt động của HDAC

2

Hình 1.2. Mô hình chất ức chế HDAC


12

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học và kết quả thử hoạt tính sinh học của các acid
hydroxamic mang nhân purin

12

Hình 1.11. Cấu trúc chung của một số dãy chất đã được nghiên cứu tại bộ môn Hóa
Dược

13

Hình 3.1: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC của các dẫn chất IVa-c

35

Hình 3.2: Hình ảnh 3D của các khung cấu trúc

42


DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung

21

Sơ đồ 3.2: Quy trình tổng hợp chất IIa

21


đời và cho đến gân đây FDA đã cấp phép cho panobinostat (Farydak) với chỉ định
điều trị u tủy.
Trên nền tảng đó, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược trường Đại học
Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất định hướng ức
chế HDAC cho kết quả khả quan. Những nghiên cứu gần đây cho thấy khi thiết kế
nhóm nhận diện bề mặt của các acid hydroxamic bằng vòng thơm như 3spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin thu được nhiều hợp chất rất triển vọng [25]. Bên
cạnh đó, việc thay cầu nối mạch thẳng của acid hydroxamic bằng cầu nối có chứa
nhân thơm cũng thu được một số ứng viên có hoạt tính kháng ung thư cao hơn, đồng
thời có tác dụng chọn lọc trên HDAC [16, 21]. Dựa trên cơ sở này, chúng tôi tiếp tục
thiết kế các dẫn chất mang khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin, đồng thời khảo
sát hợp chất mang khung 3-spiro[1,3]dithiolan-2-oxoindolin với cầu nối 3-phenyl-2propenamid và tiến hành đề tài: “Tổng hợp và thử độc tính tế bào của một số dẫn
chất N-hydroxypropenamid mang khung 3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin
hoặc 3-spiro[1,3]dithiolan-2-oxoindolin” với hai mục tiêu:
1.

Tổng

hợp

N-hydroxy-3-(4-((2'-oxospiro[[1,3]dioxolan-2,3'-indolin]-1'-

yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid cùng 2 dẫn chất và N-hydroxy-3-(4-((2'oxospiro[[1,3]dithiolan-2,3'-indolin]-1'-yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid
2. Thử hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro và tác dụng ức chế HDAC của
các chất tổng hợp được.


2

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN
1.1. HISTON DEACETYLASE


Đặc điểm

men liên quan
I

HDAC1, 2, 3, 8

RPD3

- Được gọi là những

II

HDAC4, 5, 6, 7, 9, 10

hda1

HDAC “kinh điển”;

IV

HDAC11

III

SIRT1-7

- Phụ thuộc Zn2+
Sir2

Dựa vào cấu trúc hóa học, hiện nay các chất ức chế HDAC được chia thành 6
nhóm [38, 40].
STT
1

Bảng1.2. Phân loại các chất ức chế HDAC
Nhóm chất ức chế
Một số đại diện
HDAC
Acid hydroxamic

2

Acid carboxylic

3

Aminobenzamid


5

4

Peptide vòng

5

Epoxyketones


Hầu hết các chất ức chế HDAC đều có cấu trúc chung bao gồm 3 phần nhóm
hoạt động bề mặt, cầu nối carbon và vùng gắn kim loại đều ảnh hưởng đến hoạt tính
của chất.
-

Ảnh hưởng của nhóm khóa hoạt động:


7

Nhóm khóa hoạt động liên quan tới hiệu lực của enzyme HDAC, nhóm này có
thể là các aryl hoặc vòng thơm khác. Các nghiên cứu cho thấy vòng thơm lớn có tác
dụng tốt hơn vòng thơm nhỏ. Các cyclopeptid thiên nhiên mang vòng lớn cho tác
dụng ức chế chọn lọc HDAC nhóm I.
Trichostatin A (TSA) là một trong những hydroxamat thiên nhiên đầu tiên
được phát hiện với khả năng ức chế HDAC ở IC50 nhỏ hơn 10 nM đồng thời ức chế
chọn lọc các HDAC nhóm IIa gấp 300 lần. Từ đó có thể thấy sự có mặt của nhóm thế
ở nhóm khóa hoạt động trong công thức của TSA có thể cho tác dụng ức chế HDAC
tốt hơn đáng kể [23].
-

Ảnh hưởng của nhóm gắn kẽm:

Trong cấu trúc acid hydroxamic thì nhóm gắn kẽm chính là nhóm chức acid
hydroxamic và là phần quan trọng quyết định khả năng ức chế HDAC. Khi so sánh
ba thuốc trên lâm sàng: vorinostat, entinostat và acid valproic tương ứng là
hydroxamat, benzamid và carboxylat, kết quả giá trị IC50 thay đổi đáng kể lần lượt
là: 0,110-0,370 mM, 2 mM và 50 mM. Từ đó cho thấy nhóm chức hydroxamic rất
phù hợp với tác dụng ức chế HDAC [23]. Nhiều nghiên cứu phân tích cấu trúc của
nhóm gắn kẽm cũng giải thích cho tác dụng ức chế mạnh HDAC của các acid

- Năm 2003, một loạt các acid hydroxamic mang khung indol amid được tổng
hợp bởi Yujia Dai và cộng sự. Những chất này đã thể hiện hoạt tính ức chế HDAC
mạnh và tác dụng chống tăng sinh trên 2 dòng tế bào ung thư tổ chức xơ và ung thư
mô mềm vú [10].

1
Hình 1.3. Cấu trúc hóa học của acid hydroxamic mang khung indol amid
- Năm 2008, Dr. Alan P. Kozikowski và cộng sự đã nghiên cứu tổng hợp acid
hydroxamic mang cấu trúc độc đáo, trong đó nhóm 2,4'-diaminobiphenyl hoặc
phenylthiazol được gắn một cách thích hợp với gốc acid amin tạo nên nhóm nhận
diện bề mặt có đặc tính khác biệt [18].

Hình 1.4. Các acid hydroxamic mang khung 2,4'-diaminobiphenyl hoặc
phenylthiazol


9

Kết quả thử hoạt tính sinh học đã chỉ ra tác dụng vượt trội của các chất trên so
với các acid hydroxamic mang các amino acid ban đầu, các hợp chất này cũng có tác
dụng ức chế mạnh HDAC và có thể ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư tuyến
tụy.
- Cũng năm 2008, nhóm nghiên cứu khác của Đức gồm Stefan Schäfer và cộng
sự đã tổng hợp các acid hydroxamic mang khung phenylalanin và thử hoạt tính của
chúng trên HDAC1 và HDAC6. Các nghiên cứu về liên quan cấu trúc – tác dụng của
biarylalanin ức chế HDAC cho thấy chúng khả năng ức chế chọn lọc HDAC1 và
HDAC6. Hơn nữa, nghiên cứu còn chi ra các thành phần cấu trúc góp phần tăng tính
chọn lọc như: cầu nối carbon và nhóm thế 3 dị vòng, nhưng hợp chất chọn lọc nhất
là hợp chất trung gian với cấu trúc bromophenylalanin [31]. Như vậy, nhóm khóa
hoạt động chứa nhiều dị vòng hoặc có nhóm thế halogen có thể làm tăng tính chọn

11

Hình 1.7. Acid hydroxamic mang khung 3-phenyl-N-hydroxy-2-propenamid
- Cũng sử dụng cầu nối phenylpropenamid, Young Shin Cho và cộng sự đã
tiến hành tổng hợp một dãy các acid hydroxamic với nhóm khóa hoạt động chứa nhân
3-piperidin-3-ylindol, sự kết hợp này đã tạo ra một cấu trúc thích hợp cho sự tương
tác với HDAC, từ đó đem lại hoạt tính sinh học cao [30].

Hinh 1.8. Cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của các acid hydroxamic chứa
nhân 3-piperidin-3-ylindol
Kết quả nghiên cứu cho thấy hợp chất có cầu nối phenyl propenamid không
nhóm thế trên vòng thơm cho hiệu quả ức chế HDAC cao.
- Dựa trên khung cấu trúc cơ bản của SAHA, năm 2005, Antonello Mai và
cộng sự đã công bố dãy hợp chất acid hydroxamic mang khung aryloxopropenyl
pyrrolyl là những chất đầu tiên ức chế chọn lọc HDAC II (gấp 7-78 lần so với TSA
và SAHA) [21].


12

Hình 1.9. Acid hydroxamic mang khung aryloxopropenyl pyrrolyl
Như vậy các nghiên cứu đã chỉ ra rằng các chất ức chế HDAC có cầu nối mang
vòng thơm có hoạt tính tăng lên đáng kể, đặc biệt acid hydroxamic mang khung
phenylpropenamid đã được chứng minh cho tác dụng ức chế tăng sinh tế bào ung thư
vú mạnh hơn SAHA [22].
1.3.2.3 Thay đổi cả phần cầu nối và nhóm khóa hoạt động
- Năm 2014, Junghua Wang và cộng sự đã phát triển dãy các acid hydroxamic
có cấu trúc nhóm khóa hoạt động chứa nhân purin. Trong nghiên cứu này, các hợp
chất có gắn 1-3 methylen vào nhân purin cho hoạt tính rất thấp. Tuy nhiên, khi gắn
thêm vòng thơm vào vị trí C2 của nhân purin thì hiệu lực ức chế HDAC tăng đến 60


0.23

Hình 1.10. Cấu trúc hóa học và kết quả thử hoạt tính sinh học của các acid
hydroxamic mang nhân purin


13

Kết quả thử thử hoạt tính sinh học cho thấy tác dụng ức chế HDAC 1 và 2 của
những chất này tốt hơn so với SAHA (IC50= 0,14 mmol/L), đặc biệt chúng có tác
dụng tốt chống tăng sinh tế bào khối u, bao gồm MDA-MB231, KG1, PC3 và U937.
1.4. CÁC ACID HYDROXAMIC ĐƯỢC THIẾT KẾ TỔNG HỢP TRONG
NƯỚC
Cùng với xu hướng chung của thế giới, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược
- Trường Đại học Dược Hà Nội đã và đang thiết kế, tổng hợp, khảo sát tác dụng sinh
học của một số acid hydroxamic mới hướng ức chế histon deacetylase bằng cách thay
đổi nhóm khóa hoạt động và cầu nối dựa trên cấu trúc của SAHA (hình 1.11) [24].

Hình 1.11. Cấu trúc chung của một số dãy chất đã được nghiên cứu tại bộ môn
Hóa Dược
Kết quả cho thấy nhiều chất tổng hợp được có tác dụng rất tốt khi thử khả năng
ức chế HDAC và độc tính tế bào in vitro trên một số dòng tế bào ung thư [24, 25]
(bảng 1.3). Các nghiên cứu cũng cho thấy việc sử dụng dị vòng làm nhóm khoá hoạt
động và phenylpropenamid làm cầu nối đã tạo ra các chất đầy triển vọng.


14

Bảng 1.3. Tác dụng sinh học của một số acid hydroxamic được thiết kế, tổng

13c
0,201
3,136
2,879
3,227
SAHA

Ghi chú: 1 Nồng độ ức chế 50% hoạt động deacetyl hoá của HDAC; 2Nồng độ gây ra sự giảm 50%
số lượng tế bào, số liệu được lấy trung bình ba kết quả với độ lệch dưới 10%.

Các kết quả trên đã tạo nền tảng cho khóa luận phát triển hướng nghiên cứu
bằng cách kết hợp cầu nối phenyl propenamid mới nhóm khóa hoạt động mang khung
3-spiro[1,3]dioxolan-2-oxoindolin. Kết quả cụ thể sẽ được trình bày trong các phần
tiếp theo của khóa luận.


15

CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG
VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ
2.1.1. Hóa chất
Các hóa chất, dung môi dùng trong quá trình thực nghiệm là loại dùng trong
tổng hợp được nhập từ công ty Merck hoặc Sigma-Aldrich. Các hóa chất này được
sử dụng trực tiếp không qua tinh chế thêm. Bao gồm:
- Các isatin:

- Methyl 3-(4-(bromoethyl)phenyl)prop-2-enoat

+ Isatin

- Máy khối phổ Agilent 6310 Ion Trap


16

- Máy sắc ký khối phổ phân giải cao: LTQ Orbitrap XLTM, Khoa Hóa - trường
Đại học Khoa Học Tự Nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội.
- Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân Bruker AV-500 MHz, Viện Hóa học Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
2.2.1. Tổng hợp hóa học
- Tổng hợp 4 dẫn chất:
 N-hydroxy-3-(4-((2'-oxospiro[[1,3]dioxolan-2,3'-indolin]-1'yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid
 N-hydroxy-3-(4-((5'-cloro-2'-oxospiro[[1,3]dioxolan-2,3'-indolin]-1'yl)methyl)phenyl)prop -2-enamid
 N-hydroxy-3-(4-((7'-cloro-2'-oxospiro[[1,3]dioxolan-2,3'-indolin]-1'yl)methyl)phenyl)prop2-enamid
 N-hydroxy-3-(4-((2'-oxospiro[[1,3]dithiolan-2,3'-indolin]-1'yl)methyl)phenyl)prop-2-enamid
- Kiểm tra độ tinh khiết
- Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được
2.2.2. Đánh giá tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được
- Thử tác dụng ức chế HDAC.
- Thử độc tính trên một số tế bào ung thư: ung thư đại tràng (SW620), ung thư
biểu mô tuyền tiền liệt (PC-3), ung thư tuyến tụy (AsPC-1).
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Tổng hợp hóa học
2.3.1.1. Tổng hợp
- Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để
tổng hợp các dẫn chất theo thiết kế.
- Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC).
2.3.1.2. Kiểm tra độ tinh khiết
Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng TLC và đo nhiệt độ nóng chảy.