BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

HỒ NGỌC PHÚ
MÃ SINH VIÊN: 1101410

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ
THỬ TÁC DỤNG
GÂY ĐỘC TẾ BÀO MỘT SỐ DẪN
CHẤT MỚI
LAI HÓA KHUNG BENZIMIDAZOL VÀ
1,3,4-OXADIAZOL
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI - 2016


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI
----------

HỒ NGỌC PHÚ
MÃ SINH VIÊN: 1101410

NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP VÀ
THỬ TÁC DỤNG
GÂY ĐỘC TẾ BÀO MỘT SỐ DẪN
CHẤT MỚI
LAI HÓA KHUNG BENZIMIDAZOL
VÀ 1,3,4-OXADIAZOL

các thầy giáo cô giáo đã dạy dỗ tôi trong suốt 5 năm học vừa qua.
Lời cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè và đặc biệt là các
bạn cùng nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Tổng hợp Hóa Dược – Bộ Môn Công
Nghiệp Dược đã gắn bó, động viên, khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và
nghiên cứu này.
Hà Nội, ngày 12 tháng 5 năm 2016
Sinh viên
Hồ Ngọc Phú


MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ....................................................................................... 2
1.1.

Khái quát về benzimidazol ............................................................................. 2

1.2.

Tổng quan về tác dụng sinh học của các dẫn chất lai hóa Benzimidazol

và Oxadiazol .............................................................................................................. 4
1.2.1. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm ............................................................ 4
1.2.2. Tác dụng kháng ung thư: ........................................................................... 7
1.2.3. Tác dụng chống viêm: ..............................................................................10
1.2.4. Tác dụng chống oxi hóa ............................................................................12

2.3.3.3. Các dòng tế bào ung thư ......................................................................23
2.3.3.4. Phương pháp tiến hành Phép thử sinh học xác định tính độc tế bào
(cytotoxic assay) ..............................................................................................23
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ................................ 25
3.1. Tổng hợp hóa học ..............................................................................................25
3.1.1. Tổng hợp 2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol (1) ...............................................26
3.1.2. Tổng hợp Ethyl 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat (2) ...............27
3.1.3. Tổng hợp 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (3) ............28
3.1.4.

Tổng hợp

1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-ethyl-1H-

benzo[d]imidazol (4) ...........................................................................................29
3.1.5. Tổng hợp Ethyl-2-([5-{(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}1,3,4-oxadiazol-2-yl]thio)acetat (4a) ..................................................................30
3.1.6. Tổng hợp 2-([5-{(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}-1,3,4oxadiazol-2-yl]thio)acetamid (4b) .......................................................................31
3.2. Kiểm tra độ tinh khiết .......................................................................................32
3.3. Xác định cấu trúc của các chất tổng hợp được.................................................33
3.3.1. Kết quả phân tích phổ hồng ngoại (IR) ......................................................33
3.3.2. Kết quả phân tích phổ khối lượng (MS) .....................................................34


3.3.3. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (1H-NMR) .............34
3.3.4. Kết quả phân tích phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (13C-NMR) .................36
3.4. Thử tác dụng sinh học ....................................................................................... 38
3.5. Bàn luận .............................................................................................................38
3.5.1. Về tổng hợp hóa học ..................................................................................38
3.5.2. Về cấu trúc phân tử ....................................................................................41
3.5.3. Về thử hoạt tính sinh học ...........................................................................44


C-NMR

resonance)
DMF

Dimethylformamid

DMSO

Dimethyl sulfoxid

ECA

Ethylcloroacetat

EtOH

Ethanol

G

Gam

GP

Phần trăm tăng trưởng (Growth percent)

GI50



MS

Phổ khối (Mass spectrometry)

MCF7

Dòng tế bào ung thư vú

n-BuOH

n-Butanol


Rf

Hệ số lưu giữ (Retention factor)

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

T0nc

Nhiệt độ nóng chảy


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 2.1. Danh mục các dung môi, hóa chất .............................................................18
Bảng 2.2. Danh mục các thiết bị, dụng cụ ..................................................................19

Hình 3.1 Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất lai hóa giữa 1H-benzo[d]imidazol và 1,3,4oxadiazol ........................................................................................................ 25
Hình 3.2. Sơ đồ tổng hợp 2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol (1) .................................. 26
Hình 3.3. Sơ đồtổng hợp ethyl 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetat (2) .... 27
Hình 3.4. Sơ đồ tổng hợp 2-(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)acetohydrazid (3) 28
Hình 3.5. Sơ đồ tổng hợp 1-[(2-mercapto-1,3,4-oxadiazol-5-yl)methyl]-2-ethyl (4)
....................................................................................................................... 29
Hình 3.6. Sơ đồ tổng hợp Ethyl-2-([5-{(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}1,3,4-oxadiazol-2-yl]thio)acetat (4a) .............................................................. 30
Hình 3.7. Sơ đồ tổng hợp 2-([5-{(2-ethyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)methyl}-1,3,4oxadiazol-2-yl]thio)acetamid (4b) .................................................................. 31
Hình 3.8. Cơ chế phản ứng ngưng tụ giữa o-phenyldiamin với acid propionic ...... 39


Hình 3.9. Cơ chế phản ứng tạo vòng Oxadiazol .................................................... 40
Hình 3.10. Sự chuyển dạng hỗ biến của hợp chất 4 ............................................... 40
Hình 3.11. Cơ chế phản ứng tổng hợp chất 4a ...................................................... 41
Hình 3.12. Cơ chế phản ứng tổng hợp chất 4b ...................................................... 41


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Xã hội phát triển, con người ngày càng quan tâm đến vấn đề chăm sóc sức
khỏe thì vai trò của ngành y dược ngày càng trở nên quan trọng trong đời sống, nhu
cầu sử dụng thuốc trong phòng ngừa và chữa trị ngày càng lớn. Là một nước đang
phát triển, Việt Nam tuy đã đạt được nhiều thành tựu tích cực trong cải thiện việc
khám chữa bệnh cho người dân, nhưng vẫn còn gặp phải nhiều khó khăn, mức sống
bình quân thấp, khả năng chi trả cho y tế còn hạn chế, trong khi giá thuốc nhập khẩu
lại cao gấp hàng chục lần so với mặt bằng chung ở trong nước. Tất cả những điều
này đòi hỏi ngành Dược trong nước phải tự mình sản xuất và cung ứng các loại
thuốc mới để hạ giá thành sản phẩm, nâng cao chất lượng chữa bệnh cho người dân.
Vì vậy, việc tìm kiếm thuốc mới là rất cần thiết. Hướng nghiên cứu và phát triển

cho điện tử làm tăng tác dụng sinh học. Năm 1991, dẫn chất benzimidazol được
tổng hợp ở vị trí N-H của benzimidazol bởi nhóm cho điện tử bằng sự thế propyl,
acetamid, thio , thiazol-amino, tetramethyl piperidin trên pyridin với kết quả cho tác
dụng chống loét tốt.
Do sự tương đồng với cấu trúc của purin, khả năng kháng khuẩn của
benzimidazol được giải thích bởi sự cạnh tranh với purin, kết quả là ức chế sự tổng
hợp acid nucleic và protein của vi khuẩn.
Một số oxadiazol-1H-benzo[d]imidazol khác cũng được nghiên cứu có hoạt
lực kháng khuẩn, kháng nấm [28, 29].


3

BENZIMIDAZOL

Thuốc kháng
Histamin

Artemizol

Thuốc ức chế
bơm Proton

Thuốc trợ
tim

Omeprazol

Thuốc trị
giun sán

do khả năng phản ứng đa dạng và cấu trúc đặc biệt của nó đem lại [9, 11, 16, 22].
Các dẫn xuất của oxadiazol được sử dụng trong các thị trường như
Raltegravir, Nosapidil, Furamizol,… (Xem hình 1.4).


4

Hình 1.4. Các thuốc là dẫn chất của oxadiazol
Nhìn vào tầm quan trọng của 2 cấu trúc benzimidazol và oxadiazol, người ta
nghĩ rằng sẽ có giá trị để thiết kế và tổng hợp một số dẫn xuất benzimidazol mới
mang oxadiazol và tìm ra những tác dụng sinh học tiềm năng của chúng.
1.2 . Tổng quan về tác dụng sinh học của các dẫn chất lai hóa Benzimidazol và
Oxadiazol
1.2.1 Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Năm 2009, K.F. Ansari cùng cộng sự đã tổng hợp được một số dẫn chất 1Hbenzo[d]imidazol mang khung oxadiazol (1a÷1l) (xem hình 1.5), sau đó thử tác
dụng ức chế in vitro vi sinh vật theo phương pháp pha loãng liên tiếp. Tác dụng
kháng khuẩn được thử với 3 dòng Gram(+): Staphylococcus aureus ATCC 29213,
Bacillus subtilis MTCC 121, Streptococcus mutans MTCC 890 và 3 dòng vi khuẩn
Gram(-) là: Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa MTCC 741,
Salmonella typhi MTCC733. Ciprofloxacin và ampicillin được sử dụng làm thuốc
đối chiếu. Trong khi đó tác dụng chống nấm được thử với nấm: Candida albicans
MTCC 1637, Aspergillus niger, Aspergillus flavus với thuốc đối chiếu là
amphotericin B [7].

Hình 1.5. Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol được tổng hợp bởi Ansari
Kết quả cho thấy các chất tổng hợp được đều có tác dụng kháng khuẩn tốt
với nồng độ ức chế tối thiểu MIC
thể hiện tác dụng mạnh nhất với MIC=25µg/ml.
Cũng trong năm 2012, nghiên cứu của Salahuddin cùng cộng sự trong việc
tổng hợp và đánh giá tác dụng sinh học các dẫn chất 1,3,4-oxadiazol mang khung
1H-benzo[d]imidazol trên các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Escherichia
coli, và nấm men Candida albicans, Aspergillus flavus, thực hiện theo phương pháp
khuếch tán trên thạch (ofloxacin và ketoconazol được dùng làm thuốc đối chiếu)
[24](Hình 1.7).

Hình 1.7. Các dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol trong nghiên cứu của Salahuddin
Kết quả thu được cho thấy hầu hết các hợp chất đều có tác dụng kháng
khuẩn, trong đó các chất 4d, 4f, 4h có tác dụng mạnh nhất chống lại vi khuẩn E.
coli ở nồng độ 100 μg/ml, các hợp chất 4d, 4f, 4l hoạt động tốt chống lại S. aureus
cũng ở nồng độ này.
Về khả năng chống nấm, các chất tổng hợp 4d, 4f, 4l có hoạt tính mạnh nhất
chống lại nấm A. flavus và C. albicans ở nồng độ 100 μg/ml. Thử nghiệm cho thấy
các hợp chất có các nhóm thế hút điện tử: -NO2; -Br; -Cl trên vòng oxadiazol đều
không cho tác dụng với E. coli và S. aureus, ngược lại với nhóm thế -CH3 lại có tác
dụng mạnh nhất. Thêm vào đó nghiên cứu cũng chỉ ra rằng dẫn chất có chứa nhóm
thế -Cl, -NO2, -Br, -CH3 trên vòng oxadiazol cho tác dụng rất khả quan trên chủng
nấm A. flavus và C. albicans.
Gần đây nhất, năm 2014, N. C.Desai cùng G. M.Kotadiya đã tổng hợp được
một số dẫn chất 1H-benzo[d]imidazol mang khung 1,3,4-oxadiazol, đồng thời thử


7

tác dụng ức chế sinh vật in vitro theo phương pháp pha loãng (xem hình 1.8). Tác
dụng kháng khuẩn được thử với 2 dòng vi khuẩn Gram(+): Staphylococcus aureus,
Staphylococcus pyogenes, 3 dòng vi khuẩn Gram(-): Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa. Tác dụng kháng nấm được thử với 3 dòng: Candida

[(Ti - Tz) / (C – Tz)] × 100 nếu Ti ≥ Tz
[(Ti - Tz) / Tz] × 100

nếu Ti < Tz

Thí nghiệm được đánh giá qua phần trăm tăng trưởng (growth percent- GP)
của tế bào ung thư. Kết quả cho thấy hợp chất 1c cho kết quả hoạt động mạnh nhất
với 72,85 phần trăm tăng trưởng (GP) và tác dụng mạnh nhất trên dòng ung thư vú
MDA-MB-468 và tế bào u sắc tố SK-MEL-28 (GP lần lượt là 36,23 và 47,56). Hợp
chất 1d cũng cho tác dụng cao với dòng ung thư phổi không tiểu bào NCI-H522


9

(GP = 32,73) và tế bào ung thư thận UO-31 (GP=40,53). Các hợp chất còn lại cho
tác dụng kém hơn với GP từ 84,91-96,59 [24].
Cũng trong năm 2012, một nghiên cứu khác được thực hiển bởi Asif Husain
và các cộng sự từ Ấn Độ và Hàn quốc nhằm nghiên cứu và tổng hợp các hợp chất
benzimidazol lai hóa với oxadiazol và triazol-thiadiazol. Các hợp chất tổng hợp sau
đó được đem thử hoạt tính chống ung thư tại Viện ung thư quốc gia Mỹ với nồng độ
thử duy nhất là 10µM trên 60 dòng tế bào ung thư: bệnh bạch cầu, ung thư phổi, đại
tràng, vú, buồng trứng, thận, tuyến tiền liệt [14].

Hình 1.10. Các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol được tổng hợp trong
nghiên cứu của Asif Husain
Kết quả của nghiên cứu cho thấy các dẫn chất benzimidazol lai hóa
oxadiazol cho tác dụng chống ung thư tốt hơn dẫn chất lai hóa triazol-thiadiazol.
Tác dụng chống ung thư được tăng lên bởi sự có mặt của các nhóm hút điện tử như
–Br ở các vị trí trên vòng thơm. Hợp chất 3j có hai nhóm thế -Br ở vị trí ortho làm
tăng tính nhạy cảm trên tế bào (70,63%). Trong khi đó các nhóm đẩy điện tử như –


11

được thử tác dụng chống viêm bằng phương pháp sử dụng mô hình giảm phù chân
chuột [20].

Hình 1.12. Các dẫn chất benzimidazol lai hóa oxadiazol trong nghiên cứu của
AnkitaRathore
Hầu hết các chất có khả năng ức chế COX, và ức chế COX-2 chọn lọc hơn
COX-1. Trong các hợp chất tổng hợp được, 6l là chất có tác dụng ức chế COX-2
mạnh và chọn lọc nhất (IC50=8,2µM). Các chất 6h, 6j, 6k có tác dụng ức chế trung
bình (IC50=22,6; 11,6 và 14,3µM). Nghiên cứu đã chỉ ra tác dụng ức chế phụ thuộc
vào tính chất điện tử của các nhóm thế. Các nhóm hút điện tử làm tăng khả năng ức
chế và chọn lọc COX-2. Các hợp chất 6m-r có các nhóm thế đẩy điện tử nên có
hiệu lực ức chế kém hơn các chất có nhóm thế hút điện tử như 6g-l (IC50=61,6 tới
>100µM). Thứ tự chọn lọc của các nhóm thế p-NO2>p-F>o-NO2>p-Cl>o-F>oCl>p-OCH3>o-OCH3>o-CH3>p-OH>p-CH3>o-OH. Các hợp chất 6a-e thể hiện khả
năng ức chế COX-2 trung bình (IC50=20,0–56,1µM).
Trong 18 hợp chất tổng hợp, 6 chất được đem thử hoạt tính chống viêm, kết
quả có 3 hợp chất cho thấy có tác dụng chống viêm hứa hẹn so với thuốc đối chứng
indomethacin. Chất 6l thể hiện tác dụng chống viêm tốt nhất 68,4%. Các chất 6b, 6j
cũng thể hiện khả năng chống viêm đáng chú ý (59,2% và 65,2%) so với
indomethacin là 57,9%. Từ kết quả thu được có thể kết luận rằng, các chất có khả
năng ức chế COX-2 tốt cũng cho hiệu quả chống viêm đầy hứa hẹn (Xem bảng 1.1).


12

Bảng 1.1. Tỉ lệ ức chế viêm của các chất trong nghiên cứu của Ankita Rathore
Hợp chất



50,5 ± 1,2

56,7 ± 2,0

6l

52,6 ± 1,1

68,4 ± 0,5

Indomethacin

50,0 ± 2,4

57,9 ± 1,9

1.2.4 Tác dụng chống oxi hóa
Năm 2007, Ayhan-Kılcıgil và các cộng sự đã thực hiện các thí nghiệm tổng
hợp một số dẫn chất benzimidazoltừ nhân o-phenylendiamin/4,5-diclo-1,2phenylendiamin.


13

Hình 1.13. Sơ đồ tổng hợp các dẫn chất Benzimidazol trong nghiên cứu của AyhanKılcıgil
Năm dẫn chất 16-20 và 23 sau đó được thử tác dụng chống oxi hóa trong
nghiên cứu in vitro bằng phương phápxác định microsom NADPH-phụ thuộc mức
độ ức chế peroxid hóa lipid (LP), các hoạt động của microsom ethoxyresorufin Odeethylase (EROD). BTH là chất chống oxi hóa cổ điển được sử dụng là chất so
sánh với các dẫn chất benzimidazol khi thí nghiệm trên mức độ ức chế peroxid hóa
lipid (LP) ở gan chuột. Cafein được so sánh với các dẫn chất ở tác dụng ức chế trên