BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Võ Dương Thanh

SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO
TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN)
IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Thành phố Hồ Chí Minh - 2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH

Võ Dương Thanh

SỰ TẠO MÔ SẸO VÀ DỊCH TREO TẾ BÀO
TỪ CÂY SƯA (DALBERGIA TONKINENSIS PRAIN)
IN VITRO

Chuyên ngành

: SINH HỌC THỰC NGHIỆM

Mã số

: 60 42 30


Cảm ơn tất cả những người thân, những người bạn đã luôn ở bên cạnh tôi,
dõi theo và động viên em trong suốt quá trình học tập.
Cuối cùng, con xin chân thành cảm ơn ba mẹ và anh chị,cả cu Bin nữa đã
luôn yêu thương, động viên và tạo điều kiện tốt nhất cho con hoàn thành chương
trình học tập.
Một lần nữa, tôi xin chân thành biết ơn!
TP Hồ Chí Minh, tháng 4 năm 2013
Võ Dương Thanh


MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Lời cảm ơn
Mục lục
Danh mục chữ viết tắt
Danh mục các hình
Danh mục các bảng
MỞ ĐẦU ................................................................................................................... 1
Chương1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 2
1.1. Khái quát về cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain)....................................... 2
1.1.1. Phân loại .................................................................................................... 2
1.1.2. Sự phân bố ................................................................................................. 2
1.1.3. Đặc điểm sinh học ..................................................................................... 2
1.1.4. Giá trị ......................................................................................................... 3
1.1.5. Tình trạng .................................................................................................. 3
1.1.6. Những nghiên cứu về cây Sưa................................................................... 3
1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật ........................................................................ 4
1.2.1. Khái niệm sự phát sinh hình thái thực vật ................................................. 4
1.2.2. Sự phát sinh cơ quan và phát triển phôi hợp tử ......................................... 5
1.2.2.1. Mô phân sinh ngọn chồi và sự phát triển chồi ....................................... 5

2.2.7. Đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật ............................... 33
2.2.7.1. Ly trích ................................................................................................. 33
2.2.7.2. Phân đoạn và đo hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật
nội sinh.................................................................................................... 35
2.2.8. Áp dụng kết quả sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng
thực vật trong quá trình tạo mô sẹo ........................................................ 36
2.2.9. Sự tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo ............................................................ 37
2.2.9.1. Khảo sát khối lượng mô sẹo ảnh hưởng đến sự tạo dịch treo tế bào
của cây Sưa in vitro ................................................................................ 37


2.2.9.2. Khảo sát nồng độ các chất điều hoà tăng trưởng thực vật ảnh hưởng
đến quá trình tạo dịch treo tế bào từ mô sẹo của cây Sưa in vitro .......... 38
2.2.10. Phân tích số liệu .................................................................................... 38
Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................ 39
3.1. Kết quả ........................................................................................................... 39
3.1.1. Nuôi cấy tạo cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) in vitro ................. 39
3.1.2. Sự tạo mô sẹo .......................................................................................... 39
3.1.2.1. Sự tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro......................................................... 39
3.1.2.2. Sự tăng trưởng của mô sẹo ................................................................... 55
3.1.2.3. Quan sát hình thái giải phẫu mô sẹo .................................................... 57
3.1.2.4. Sự thay đổi cường độ hô hấp của các mẫu cấy trong quá trình tạo
mô sẹo ..................................................................................................... 64
3.1.2.5. Sự thay đổi hoạt tính các chất điều hòa tăng trưởng thực vật nội
sinh trong quá trình tạo mô sẹo .............................................................. 65
3.1.2.6. Áp dụng kết quả sự thay đổi hoạt tính các chất điều hoà tăng trưởng
thực vật trong quá trình tạo mô sẹo ........................................................ 66
3.1.3. Sự phát sinh cơ quan ............................................................................... 67
3.1.3.1. Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo............................................................ 67
3.1.3.2. Hình thái giải phẫu khối mô sẹo trong quá trình phát sinh cơ quan .... 70

3.2.12. Sự tạo dịch treo tế bào ........................................................................... 85
Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 87
4.1. Kết luận .......................................................................................................... 87
4.2. Đề nghị ........................................................................................................... 87
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 88
PHỤ LỤC ................................................................................................................ 95


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT

2,4-D

: 2,4- dichlorophenoxyacetic acid

ABA

: abscissic acid

BA

: N6-Benzyladenine

CĐHTTTV : chất điều hoà tăng trưởng thực vật
DNA

: deoxyribonucleic acid

GA

: gibberelline

TDZ

: thidiazuron

VU

: Vulnerable (bị đe doạ, sắp nguy cấp)


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình1.2. Sơ đồ tổng quát chỉ các vùng mô phân sinh ngọn ....................................... 5
Hình 1.3. Sự tổ chức của vùng phát sinh hình thái để tạo mô phân sinh rễ ................ 8
Hình 1.4. Sự thành lập rễ (với AIA 10-6 M) và mô sẹo (với 2,4-D 10-6) từ mảnh
lá Sansevieria (Bùi Trang Việt 2000). ..................................................... 13
Hình 1.5. Các giai đoạn chính của sự thu nhận phôi thể hệ. ..................................... 17
Hình 1.6. Cấu trúc phân tử một số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm
auxin ........................................................................................................ 19
Hình 1.7. Cấu trúc phân tử một số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm
cytokinin. ................................................................................................. 23
Hình 1.8. Cấu trúc phân tử một số chất điều hoà tăng trưởng thực vật nhóm
gibberelline. ............................................................................................. 26
Hình 1.9. Cấu trúc phân tử abscissic acid. ................................................................ 27
Hình 1.10. Cấu trúc phân tử etylene ......................................................................... 28
Hình 2.2. Mẫu cấy cây Sưa 1 tuần tuổi để tạo mô sẹo. ............................................. 30
Hình 2.3. Sơ đồ li trích và cô lập các chất điều hoà tăng trưởng thực vật nội sinh .. 34
Hình 2.4. Mẫu cấy cây Sưa 1 tuần tuổi để tạo mô sẹo. ............................................. 36
Hình 3.1. Cây Sưa con nảy mầm in vitro sau 1 tuần trên môi trường MS............... 39
Hình 3.2. Các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của cây Sưa in vitro trên
môi trường MS sau 1 tuần, không hình thành mô sẹo. ............................ 40
Hình 3.3.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của

2,4-D 1mg/l. ............................................................................................. 45
Hình 3.13.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của
cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
2,4-D 2mg/l. ............................................................................................. 46
Hình 3.14.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của
cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
2,4-D 3mg/l. ............................................................................................. 46
Hình 3.15.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của
cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung


2,4-D 1mg/l và BA 0,1mg/l. .................................................................... 47
Hình 3.16.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của
cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l. ....................................................................... 47
Hình 3.17.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của
cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
2,4-D 2mg/l và BA0,5mg/l. ..................................................................... 48
Hình 3.18.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của
cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l. ....................................................................... 48
Hình 3.19.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của
cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l. ....................................................................... 49
Hình 3.20.Mô sẹo phát triển từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp) của
cây Sưa in vitro sau 2 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung
2,4-D 3mg/l và BA 0,5mg/l. .................................................................... 49
Hình 3.21.Mô sẹo có nguồn gốc từ các mẫu cấy khúc cắt thân non (trụ hạ diệp)
của cây Sưa in vitro sau 3 tuần nuôi cấy trên môi trường MS có bổ
sung 2,4-D 1mg/l. .................................................................................... 50

Hình 3.32.Lát cắt ngang thân non (trụ hạ diệp) cây Sưa in vitro 1 tuần tuổi............ 57
Hình 3.33. Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro trên môi trường
MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 3 ngày, có sự phản phân
hóa của các tế bào nhu mô và sự phân chia của tế bào tượng tầng (mủi
tên). .......................................................................................................... 57
Hình 3.34. Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro trên môi trường
MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 5 ngày, các tế bào mô
sẹo đang phân chia để hình thành khối mô sẹo. ...................................... 58
Hình 3.35. Lát cắt ngang mẫu cấy tạo mô sẹo từ cây Sưa in vitro trên môi trường
MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 7 ngày, các tế bào mô
sẹo đang tách rời nhau. ............................................................................ 58


Hình 3.36. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có
bổ sung 2,4-D 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng
không ổn định và kéo dài. ........................................................................ 59
Hình 3.37. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có
bổ sung 2,4-D 2mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng
không ổn định và kéo dài. ........................................................................ 59
Hình 3.38. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có
bổ sung 2,4-D 3mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có hình dạng
không ổn định và kéo dài. ........................................................................ 60
Hình 3.39. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có
bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có
hình dạng không ổn định và kéo dài. ....................................................... 60
Hình 3.40. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có
bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 1mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có
hình dạng không ổn định. ........................................................................ 61
Hình 3.41. Hình thái tế bào mô sẹo cây Sưa in vitro trên các môi trường MS có
bổ sung 2,4-D 2mg/l và BA 0,5mg/l sau 3 tuần nuôi cấy, các tế bào có

0,1mg/l và BA 3mg/l sau 6 tuần, cơ quan đang phát triển. ..................... 69
Hình 3.53. Các cấu trúc sơ khởi chồi hình thành trên môi trường MS có bổ sung
NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l...................................................................... 70
Hình 3.54. Sơ khởi chồi kéo dài trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l
và BA 3mg/l. ............................................................................................ 70
Hình 3.55. Cơ quan chồi phát triển và hình thành hệ mạch dẫn trên môi trường
MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l. ........................................... 71
Hình 3.56.Cơ quan chồi phát triển mạnh và hình thành látrên môi trường MS có
bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l. ....................................................... 71
Hình 3.57. Cơ quan chồi phát triển mạnh hoàn thiện trên môi trường MS có bổ
sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l. ............................................................ 72
Hình 3.58. Sự thay đổi cường độ quang hợp của mô sẹo trên môi trường tạo cơ
quan MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian. ........... 73


Hình 3.59. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo trên môi trường tạo cơ quan
MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian. .................... 74
Hình 3.60. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV nội sinh của khối mô sẹo nuôi
cấy tạo cơ quan trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA
3mg/l theo thời gain nuôi ......................................................................... 75
Hình 3.61. Dich treo ở nghiệm thức 2,0 gam mô sẹo phát triển trên môi trường
MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần. ............................. 76
Hình 3.62. Dich treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo phát triển trên môi trường
MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần. ............................. 77
Hình 3.63. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 2,0 gam mô sẹo trên môi
trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần. ................ 77
Hình 3.64. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo trên môi
trường MS có bổ sung 2,4-D 3mg/l và BA 1mg/l sau 1 tuần. ................ 78
Hình 3.65. Cụm tế bào trong dịch treo ở nghiệm thức 500 mg mô sẹo trên môi
trường MS có bổ sung 2,4-D 1mg/l và BA 0,5mg/l sau 1 tuần. ............. 79

Bảng 3.6. Sự thay đổi cường độ quang hợpcủa mô sẹo trên môi trường tạo cơ
quan MS có bổ sung 2,4-D 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian. ........... 73
Bảng 3.7. Sự thay đổi cường độ hô hấp của mô sẹo trên môi trường tạo cơ quan
MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA 3mg/l theo thời gian. .................... 74
Bảng 3.8. Sự thay đổi hoạt tính các CĐHTTTV nội sinh của khối mô sẹo nuôi
cấy tạo cơ quan trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,1mg/l và BA
3mg/l theo thời gian nuôi cấy. ................................................................. 75


1

MỞ ĐẦU
Cây Sưa (Dalbergia tonkinensis Prain) là loài cây gỗ quý, hiếm, có giá trị
kinh tế cao. Gỗ thuộc loại nặng, cứng, có vân đẹp, không bị mối mọt và có mùi
thơm đặc biệt ( Đỗ Văn Bản và cs 2009).Chính vì vậy gỗ Sưa được dùng để đóng
đồ đạc gia đình cao cấp, làm đồ mỹ nghệ và chạm khắc. Cây có tán đẹp, hoa thơm
nên được trồng làm cây đường phố và vườn hoa (Bộ Khoa học và Công nghệ Việt
Nam 1996).
Trong y học cổ truyền của Việt Nam và Trung Quốc, nhiều loài trong chi
Dalbergia đã được sử dụng để chữa trị các bệnh về xương khớp, tiêu hoá, mụn
nhọt, ngoại thương xuất huyết (Võ Văn Chi 1999).Những năm gần đây, giới thương
gia Trung Quốc đổ xô săn lùng gỗ Sưa, giá gỗ Sưa rất đắt, vào thời điểm “ sốt”
nhất, giá 1kg gỗ Sưa lên đến hàng chục triệu đồng, thậm chí đến 11 tỉ đồng/m3.
Chính vì vậy gỗ Sưa đang bị khai thác quá mức.
Cây Sưa được ghi nhận trong danh mục sách đỏ Việt Nam và được chính phủ
Việt Nam quy định trong nhóm IA của nghị định 32/2006/NĐ-CP ngày 30 tháng 3
năm 2006 là loại đặc biệt quý hiếm và có nguy cơ đe dọa tuyệt chủng. Theo đánh
giá của hiệp hội bảo tồn thiên nhiên thế giới, cây Sưa hiện nay là VU A1 cd – sắp
nguy cấp (UICN 1997).
Đề tài “Sự tạo mô sẹo và dịch treo tế bào từ cây Sưa (Dalbergia

Phân Họ

: Faboideae

Chi

: Dalbergia

Loài

: Dalbergia tonkinensis Prain

Cây Sưa còn được gọi là Trắc thối (Võ Văn Chi 2003).
1.1.2. Sự phân bố
Ở Việt Nam, cây Sưa phân bố ở các tỉnh: Vĩnh Phúc, Hòa Bình, Hà Tây,
Ninh Bình, Phú Yên, Khánh Hòa, Đồng Nai, Gia Lai. Trên thế giới, cây Sưa có mặt
ở Trung Quốc (đảo Hải Nam). Cây có tán đẹp, hoa thơm nên được trồng làm cây
đường phố và vườn hoa (Bộ Khoa học và Công nghệ Việt Nam 1996).
1.1.3. Đặc điểm sinh học
Cây Sưa (Dalbergia tonkinesis Prain) thuộc gỗ nhỡ, rụng lá, cao 15 – 20 m,
đường kín thân 0,5 – 0,7 m. Vỏ màu xám trắng, thịt vàng, dày 3 mm (Bộ khoa học
và công nghệ Việt Nam 1996)
Gỗ Sưa có dác và lõi phân biệt. Gỗ dác có màu xám và vàng nhạt. Gỗ lõi có
nhiều màu sắc, từ đỏ vàng đến nâu hồng hơi tím, thường có sọc màu sẫm tạo thành
vân rất đẹp cả trên 3 mặt cắt. Tia gỗ nhỏ và hẹp, có cấu tạo tầng. Gỗ sưa có mùi
thơm rất đặc biệt mà gỗ trắc và cẩm lai không có. Trên mặt cắt ngang phần gỗ lõi
vừa mới cắt ngang thường thấy có chất nhựa màu nâu đỏ đùn ra. Gỗ sưa chủ yếu có
lỗ mạch đơn đến kép ngắn 2-3 (gỗ trắc, cẩm lai có mạch kép 5-7). Chất nhựa chứa
trong mạch nhiều, màu nâu đỏ đến nâu vàng. Mô mền không dính mạch thường tụ


Tại một số trại cây giống, cây Sưa được nhân giống bằng hom, với điều kiện:


4
phải có giàn phun sương, hom đánh tẻ và sử dụng một số chất kích thích ra rễ như
IBA, NAA (Trần Vinh 2007).
Trên thế giới cũng như Việt Nam những nghiên cứu về cây Sưa chưa được
công bố. Tài liệu về cây Sưa không nhiều và chưa chuyên sâu.
Những nghiên cứu mớivề cây Sưa:
Xác định trình tự đoạn gen tRNA – Leu cho hai loài cây gỗ Sưa (Dalbergia
tonkinensis) và cây gỗ Trắc đỏ (Dalbergiacochinchinensis ) phục vụ việc phân loại
mẫu vật tại bảo tàng thiên nhiên Việt Nam. Kết quả nghiên cứu đã xác định được
trình tụ nucleotide thuộc gen tRNA – Leu (trnL) cho loài D.tonkinensis Việt Nam
và D.cochinchinensis Việt Nam có độ dài là 476bp và 432bp (tương ứng) và mức
độ tương đồng di truyền 99,8%. Mức độ tương đồng di truyền hai loài Dalbergia
của Việt Nam với 13 loàiDalbergia khác trên thế giới dao động từ 94,6% (giữa
D.tonkinensis Việt Nam và D. foliolosa; D.cochinchinensis Việt Nam và D.
foliolosa) đến 100% (giữa D. decipularis và D. frutescens) (Vũ Thị Thu Hiền và cs
2009).
Những kết quả nghiên cứu ban đầu về thành phần hoá học isoflavon và
dihydrophenanthren của cây Sưa (Dalbergia tonkinensis). Đây là lần đầu tiên khung
dihydrophenanthren được tìm thấy trong chi Dalbergia(Trần Anh Tuấn và cs 2009).
1.2. Sự phát sinh hình thái thực vật
1.2.1. Khái niệm sự phát sinh hình thái thực vật
Sự phát sinh hình thái thực vật là quá trình phát triển của cơ thể thực vật, tế
bào, mô, cơ quan theo thời gian, thông qua sự phân chia, sự tăng trưởng và sự phân
hóa tế bào. Bao gồm các quá trình (Bùi Trang Việt 2000):
+ Phát sinh mô (histogenesis)
+ Phát sinh cơ quan (organogenesis)
+ Phát sinh phôi (embryogenesis)