VIỆN ĐẠI HỌC MỞ HÀ NỘI
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
-------***-------

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
Đề tài:
NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN BỘ CHỦNG VI SINH VẬT CÓ
HOẠT TÍNH PROBIOTIC ỨNG DỤNG TRONG SẢN XUẤT MEN
TIÊU HOÁ CHO VẬT NUÔI

Người hướng dẫn : PGS.TS. Phạm Thị Tâm
Sinh viên thực hiện

: Đỗ Phương Thảo

Lớp

: 12-02

Hà Nội – 2016


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPViện Đại Học Mở Hà NộiKhoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small
gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: 6.13",
Right + Not at 6.33"
Formatted: Font: 14 pt

LỜI CẢM ƠN


MỤC LỤC ........................................................................................................ 1
MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small
gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: 6.13",
Right + Not at 6.33"
Formatted: Font: 19 pt
Formatted: Line spacing: 1.5 lines
Field Code Changed
Formatted

... [1]

Formatted

... [2]

Formatted

... [3]

Formatted

... [4]

1.1.1. Lịch sử probiotic............................................................................. 3

Formatted


... [10]

1.4. Tiêu chuẩn lựa chọn chủng vi sinh vật probiotic............................. 10

Formatted

... [11]

1.4.1. Lựa chọn các chủng probiotic ..................................................... 10

Formatted

... [12]

1.4.2. Các chủng vi sinh vật dùng phổ biến trong probiotic .............. 11

Formatted

... [13]

1.4.3. Công thức chế phẩm probiotic ................................................ 1211

Formatted

... [14]

1.4.4. Yêu cầu an toàn đối với các chủng vi sinh vật probiotic .......... 12

Formatted


Formatted

... [21]

2.2. Nguyên liệu .......................................................................................... 17

Formatted

... [22]

2.2.1. Hóa chất ......................................................................................... 17

Formatted

... [23]

PHẦN 1 – TỔNG QUAN ................................................................................ 3
1.1. Lịch sử và định nghĩa probiotic........................................................... 3

1.2. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức

1.5. Tình hình nghiên cứu và sử dụng probiotic trên thế giới và Việt
nam .............................................................................................................. 13
1.5.1. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm
probiotic trên thế giới ............................................................................ 13
1.5.2. Tình hình nghiên cứu sản xuất và sử dụng các chế phẩm

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo



Formatted

... [31]

Formatted

... [32]

Formatted

... [33]

Formatted

... [34]

2.3.2. Các phương pháp định tính và định lượng............................ 3028

Formatted

... [35]

Formatted

... [36]

2.3.2.1. Định tính axit lactic (đối với vi khuẩnLactobacillus sp.)......... 3028

Formatted


... [43]

Formatted

... [44]

.................................................................................................................. 3735

Formatted

... [45]

Formatted

... [46]

Formatted

... [47]

Formatted

... [48]

Formatted

... [49]

Formatted


Formatted

... [58]

Formatted

... [59]

Formatted

... [60]

Formatted

... [61]

Formatted

... [62]

Formatted

... [63]

Formatted

... [64]

Formatted


Lactobacillus sp.và Bacillus subtilis................................................... 2221
2.3.1.1. Vi khuẩn Lactobacillus sp......................................................... 2221

2.3.3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp ........................ 3130

3.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn có hoạt tính probiotic .................... 4542
3.2.1.Sàng lọc các chủng vi khuẩn Lactobacillus sp. có hoạt tính
probiotic .............................................................................................. 4542
3.2.1.1. Đánh giá khả năng sản sinh axit ....................................... 4542
3.2.1.2. Đánh giá khả năng sản sinh bacteriocin ........................... 4643
3.2.2. Sàng lọc các chủng vi khuẩn Bacillussubtiliscó hoạt tính
probiotic .............................................................................................. 4845
3.2.2.1. Đánh giá khả năng sản sinh enzym ................................... 4845
3.3. Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp lên khả năng sinh trưởng
của các chủng vi sinh vật được lựa chọn ............................................. 5148
3.3.1. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh
trưởng của vi khuẩn lactobacillus sp. ............................................... 5148
3.3.1.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy...................................... 5148
3.3.1.2. Ảnh hưởng của muối mật trong môi trường nuôi cấy...... 5249
3.3.2. Ảnh hưởng của các điều kiện nuôi cấy lên khả năng sinh
trưởng của vi khuẩn Bacillus subtilis ............................................... 5350
Sinh viên: Đỗ Phương Thảo


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPViện Đại Học Mở Hà NộiKhoa Công nghệ sinh học
3.3.2.1. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy...................................... 5350
3.3.2.2. Ảnh hưởng của muối mật trong môi trường nuôi cấy...... 5451
3.4. Phát triển chế phẩm........................................................................ 5451
3.4.1. Kết quả về điều kiện sấy và bảo quản chế phẩm men tiêu hóa
.............................................................................................................. 5451

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Left

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPViện Đại Học Mở Hà NộiKhoa Công nghệ sinh học

DANH MỤC BẢNG

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small
gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: 6.13",
Right + Not at 6.33"
Formatted: Font: 16 pt
Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li

Bảng 1.1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis và Dysbiosis cùng các đặc điểm
đặc trưng của chúng........................................................................................ 7
Bảng 1.2: Tóm tắt cơ chế tác động chủ yếu của các chủng probiotic ...... 12
lên vật chủ ...................................................................................................... 12

Field Code Changed

Bảng 1.3: Tóm tắt một số thông tin của một vài sản phẩm probiotic có

Bảng 3.10: Đánh giá tiềm năng probiotic của men tiêu hóa chứa
Lactobacillus sp. và Bacillus subtilis ......................................................... 5754

Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Indent: Left: 0", Line spacing:
Multiple 1.3 li
Formatted: Normal, Line spacing: Multiple
1.3 li, Tab stops: Not at 6.1"

Formatted: Font: 14 pt, Do not check spelling
or grammar

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPViện Đại Học Mở Hà NộiKhoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small
gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: 6.13",
Right + Not at 6.33"

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Minh hoạ cơ chế tác động của probiotic .................................. 109

Formatted: Line spacing: Multiple 1.3 li
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted

... [72]

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted

... [73]

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Font: 14 pt

Formatted: Font: 14 pt
Formatted: Left

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo

... [76]

... [77]


Viện Đại Học Mở Hà NộiKHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPKhoa Công nghệ sinh học

Formatted: Border: Bottom: (Thick-thin small
gap, Auto, 3 pt Line width), Tab stops: 6.13",
Right + Not at 6.33"
Formatted: Font: 7 pt

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

Formatted: Font: 16 pt, Bold

Formatted: Font: 4 pt, Bold

Kligler Iron Agar

KIA

Trypticase Soya Aga

TSA


Formatted: Tab stops: Not at 6.33"
Formatted: Font: 14 pt

MỞ ĐẦU

Formatted: Font: 16 pt
Formatted: Top: 1.16"

Tính cấp thiết
Ngành chăn nuôi không đóng vai trò then chốt trong nền kinh tế toàn
cầu nhưng lại có nhiều ý nghĩa về chính trị - xã hội. Nó chiếm 40% tổng sản
phẩm trong ngành nông nghiệp, giải quyết việc làm cho hơn 1,3 tỉ người lao
động và sinh kế của hơn 1 tỉ người dân song ở các nước nghèo. Đối với nước
ta chăn nuôi là một trong hai lĩnh vực kinh tế quan trọng trong ngành nông
nghiệp. Thức ăn là yếu tố quan trọng nhất giúp tăng năng suất vật nuôi.
Trong dinh dưỡng động vật, việc tăng cường sức khoẻ hệ thống tiêu
hoá của vật nuôi thông qua những tác động tới hệ vi sinh vật đường ruột được
coi là một giải pháp rất hữu hiệu. Hệ vi sinh vật đường ruột của vật nuôi rất
phong phú về chủng loại và số lượng, những biến động về cơ cấu, số lượng
các loài vi sinh vật đường ruột là một trong những nguyên nhân chủ yếu dẫn
đến những rối loạn trong tiêu hoá và hấp thu. Bởi vậy, việc sử dụng các biện
pháp kỹ thuật thông qua thức ăn và nuôi dưỡng nhằm tạo nên một thế cân
bằng tối ưu giữa các loài vi sinh vật đường ruột theo hướng có lợi cho vật chủ
đã và đang là hướng nghiên cứu được các nhà nghiên cứu trong và ngoài nước
quan tâm. Có nhiều biện pháp để cải thiện quan hệ cân bằng giữa các nhóm vi
khuẩn có lợi và có hại trong đường tiêu hoá của gia súc, gia cầm. Biện pháp
cổ điển được ứng dụng rộng rãi từ những năm 1950 của thế kỷ trước là sử
dụng kháng sinh liều thấp. Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn
chăn nuôi ngày càng bị hạn chế (kể từ ngày 01 tháng 01 năm 2006, các nước

Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Tab stops: Not at 6.33"
Formatted: Font: 14 pt

năm, một trong các đồ uống lên men – đặt tên là “Yakult” từ sữa được cho là
hỗ trợ sức khỏe đường ruột (intestinal health) được sản xuất. Khái niệm chung
probiotics được chấp nhận ở Châu Á trong nhiều năm khi các sản phẩm lên
men từ sữa probiotic đầu tiên được giới thiệu ở Châu Âu những năm của thập
niên 80[28].
Ngày nay, các sản phẩm probiotic có chứa Bifidobacteria hoặc
Lactobacillus được tiêu thụ rộng rãi và phổ biến trên khắp thế giới như những
nguồn thực phẩm chính giúp tăng cường sức khỏe cho con người cũng như
vật nuôi.
1.1.2. Định nghĩa probiotic
Theo ngôn ngữ Hi Lạp, probiotic có nghĩa là “vì sự sống”. Thuật ngữ
probiotic được Parker đề nghị sử dụng lần đầu tiên vào năm 1974 để chỉ
“những vi sinh vật và những chất làm cân bằng hệ vi sinh vật ruột” (Fuller,
1989). Từ đó đến nay thuật ngữ probiotic đã được cả thế giới sử dụng để chỉ
những chế phẩm vi sinh vật sống hữu ích khi được đưa vào cơ thể động vật
thông qua thức ăn hoặc nước uống tạo nên những ảnh hưởng có lợi cho vật
chủ. Kể từ khi xuất hiện, khái niệm probiotic vẫn chưa có một định nghĩa
thống nhất. Tuy nhiên, hiện có hai định nghĩa được cho là phản ánh khá đầy
đủ bản chất của probiotic và được sử dụng nhiều trong các ấn phẩm khoa học:
(i) theo Fuller (1989), probiotic là “chất bổ sung vi sinh vật sống vào thức ăn
giúp cải thiện cân bằng của hệ vi sinh vật đường tiêu hóa theo hướng có lợi
cho vật chủ”; (ii) theo tổ chức Y tế thế giới (WHO, 2001), probiotic là “các vi
sinh vật sống khi đưa vào cơ thể theo đường tiêu hoá với một số lượng đủ sẽ
đem lại sức khoẻ tốt cho vật chủ”.
1.2. Hệ vi sinh vật đường ruột và tác động của hệ vi sinh vật đến sức khỏe

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo

Page 6

Formatted: Right: -0.02", Border: Top:
(Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width),
Tab stops: Not at 6.13"


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPViện Đại Học Mở Hà Nội
Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Tab stops: Not at 6.33"
Formatted: Font: 14 pt

và đặc biệt là gây nên tình trạng kháng thuốc ngày càng gia tăng của các vi
khuẩn gây bệnh trên người và vật nuôi. Hiện nay, khối liên minh châu Âu
(EU) đã cấm sử dụng kháng sinh để bổ sung vào thức ăn như chất kích thích
sinh trưởng từ ngày 01 tháng 01 năm 2006. Để vượt qua những thách thức đó,
đã có rất nhiều những nghiên cứu nhằm tìm ra tác nhân để thay thế kháng sinh
nhưng an toàn với vật nuôi. Một trong những tác nhân tìm ra đó là probiotic.
Bảng 1.1: Tóm tắt trạng thái Eubiosis và Dysbiosis cùng các đặc điểm

Formatted: Level 5, Space Before: 0 pt

đặc trưng của chúng
Trạng thái Eubiosis

Trạng thái Dysbiosis


Sinh viên: Đỗ Phương Thảo

Formatted: Right: -0.02", Border: Top:
(Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width),
Tab stops: Not at 6.13"

Page 7


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPViện Đại Học Mở Hà Nội
Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Tab stops: Not at 6.33"
Formatted: Font: 14 pt

- Thay đổi cấu trúc quần thể vi sinh vật đường ruột theo chiều hướng có
lợi cho vật chủ.
- Tăng cường khả năng miễn dịch.
- Giảm phản ứng viêm.
- Ngăn cản sự xâm nhập và ức chế sự phát triển của vi khuẩn gây bệnh.
- Tăng sản xuất các axit béo bay hơi.
- Tăng cường quá trình sinh tổng hợp các vitamin nhóm B.
- Tăng hấp thu chất khoáng.
- Làm giảm cholesterol huyết thanh.
- Làm tăng năng suất vật nuôi.
- Giảm hàm lượng amoniac và urê trong chất thải.
Ngoài ra probiotic còn rất an toàn với động vật và thân thiện với môi
trường. Vì là chất bổ sung vi sinh vật sống hữu ích, việc sử dụng probiotic sẽ
không tạo ra các chất tồn dư trong các sản phẩm chăn nuôi có hại cho sức
khỏe người tiêu dùng.


Cạnh tranh loại trừ: các
sinh vật probiotic khóa
chặt các vị trí thụ cảm
do đó loại trừ được các
vi sinh vật gây bệnh

Các vi sinh vật probiotic
cư ngụ và nhân lên trong
ruột, ngăn cản sự bám

Page 9

Formatted: Line spacing: single
Formatted Table

Formatted: Right: -0.02", Border: Top:
(Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width),
Tab stops: Not at 6.13"


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPViện Đại Học Mở Hà Nội
Khoa Công nghệ sinh học
cảm trên bề mặt ruột,
độc tố được loại trừ

vào niêm mạc và các
thụ cảm trên ruột và
phá hủy chúng


ức chế sự phát triển của các vi khuẩn gây bệnh trong đường tiêu hóa của động
vật có ý nghĩa rất quan trọng. Sự kìm hãm được thực hiện theo những cách
sau: cạnh tranh chất dinh dưỡng, sản xuất độc tố và các sản phẩm trao đổi
(các axit béo bay hơi, các chất giống kháng sinh...), cạnh tranh vị trí bám dính
ở niêm mạc ruột và kích thích hệ thống miễn dịch ruột (Fuller, 1989; Gibson
và Fuller, 2000; Rolfe, 2000; S.C. Knight và cs, 2009).
Nhiều nghiên cứu bổ sung chế phẩm probiotic trên lợn và gà cho thấy
có đáp ứng tích cực (Henrich và ctv, 2006): tăng cường khả năng miễn dịch ở
lợn con; tăng tỷ lệ tiêu hóa các chất dinh dưỡng; tăng hiệu quả sử dụng thức
ăn...). Bên cạnh đó cũng có nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ hiệu quả không rõ
Sinh viên: Đỗ Phương Thảo

Page 14

Formatted: Right: -0.02", Border: Top:
(Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width),
Tab stops: Not at 6.13"


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆPViện Đại Học Mở Hà Nội
Khoa Công nghệ sinh học

Formatted: Tab stops: Not at 6.33"
Formatted: Font: 14 pt

rệt của việc bổ sung các chế phẩm probiotic trên lợn (Breston và ctv, 1995):
không quan sát thấy ảnh hưởng tích cực của probiotic (Lactobacillus) bổ sung
trong khẩu phần cho lợn cái và đực thiến ở giai đoạn lợn choai và vỗ béo;
Có rất nhiều ý kiến khác nhau khi giải thích sự khác biệt của các kết
quả nghiên cứu, nhưng ý kiến được nhiều nhà khoa học thống nhất là các chế


6 x 105

Ferment

Trung Quốc

109

Nấm men

Formatted: Line spacing: single
Formatted Table

4 x 107
105

105

107

Formatted: Space Before: 0 pt, After: 0 pt
Formatted: Right: -0.02", Border: Top:
(Thin-thick small gap, Auto, 3 pt Line width),
Tab stops: Not at 6.13"

Sinh viên: Đỗ Phương Thảo

Page 16