BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT
THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƯỜNG

NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA
CỦA THÂN CÂY GÁO VÀNG, NAUCLEA
ORIENTALIS (L.) L. (RUBIACEAE)
S

K

C

0

0

3

9

5

9

MÃ SỐ: T2015-66TĐ

S KC 0 0 4 7 9 5



Họ và tên
Phan Thị Anh Đào

Bộ môn CN Hóa học- Khoa CN Hóa

Nội dung
nghiên cứu
được giao
Chủ trì

học& Thực phẩm, ĐH Sư phạm Kỹ
thuật TP. HCM
2

Võ Thị Ngà

Bộ môn Hóa Phân Tich, Khoa Hóa,
ĐH Khoa học Tự Nhiên TP. HCM

Tham gia

ĐƠN VỊ PHỐI HỢP CHÍNH
Tên đơn vị
trong và ngoài nước

Nội dung phối hợp
nghiên cứu

Họ và tên

CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................................... 4

1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA……………………………………4
1.1.1 Khái niệm về gốc tự do ................................................................................... 4
1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể .................................................... 5
1.1.3 Vai trò của gốc tự do trong cơ thể ................................................................... 8
1.1.4 Khái niệm về chất kháng oxy hóa ................................................................. 12
1.1.5 Phân loại ........................................................................................................ 12
1.1.6 Các phương pháp xác định hoạt tính kháng oxy hóa .................................... 16
1.2 TÌM HIỂU VỀ CÂY THUỐC NAUCLEA ORIENTALIS (L.), L.
............ ………………………………………………………………………………20
1.2.1 Mô tả thực vật và phân bố sinh thái của cây Nauclea orientalis (L.) L. ....... 20
1.2.2 Nghiên cứu dược học của cây N. orientalis .................................................. 21
1.2.3 Nghiên cứu thành phần hóa học của cây N. orientalis .................................. 22
1.2.4 Nghiên cứu thành phần hóa học của chi Nauclea ........................................ 25
1.3 ĐỊNH HƯỚNG NGHIÊN CỨU………………………………………………….30
1.3.1 Những vấn đề còn tồn tại............................................................................... 30
1.3.2 Định hướng nghiên cứu ................................................................................. 31
CHƯƠNG 2: THỰC NGHIỆM ................................................................................................ 32

2.1 TRÍCH LY VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TINH KHIẾT…………………..32
2.1.1 Hóa chất ......................................................................................................... 32
2.1.2 Thiết bị........................................................................................................... 32
2.1.3 Trích ly và phân lập các hợp chất từ thân cây N.orientalis ........................... 33
2.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH KHÁNG OXY HÓA ......................................................... 35

2.2.1 Thử nghiệm hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH ............................................. 35
2.2.2 Khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid ................................. 37
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN .............................................................................. 39


Hình 1.7 Phản ứng trung hòa gốc DPPH .................................................................................. 18
Hình 1.8 Phản ứng tạo phức giữa malonyldialdehyde và acid thiobarbituric .......................... 19
Hình 1.9 Ảnh minh họa cây, hoa và lá của N. orientalis .......................................................... 21
Hình 1.10 Cấu trúc một số hợp chất alkaloid phân lập từ cây N. orientalis............................. 24
Hình 1.11 Cấu trúc một số hợp chất steroid và chất béo phân lập từ cây N. orientalis ........... 24
Hình 1.12 Cấu trúc một số hợp chất terpenoid phân lập từ cây N. orientalis .......................... 25
Hình 1.13 Cấu trúc một số hợp chất phenol phân lập từ cây N. orientalis............................... 25
Hình 1.14 Cấu trúc một số hợp chất alkaloid phân lập từ chi Nauclea .................................... 28
Hình 1.15 Cấu trúc một số hợp chất steroid, terpenoid phân lập từ chi Nauclea ..................... 29
Hình 1.16 Cấu trúc một số hợp chất polyphenol phân lập từ chi Nauclea ............................... 29
Hình 3.1 Tương quan HMBC (mũi tên) trong hợp chất GV-8................................................. 41
Hình 3.2 Tương quan HMBC (mũi tên) trong hợp chất GV-9................................................. 42
Hình 3.3 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-10 ............... 44
Hình 3.4 Tương quan HMBC (mũi tên) trong hợp chất GV-12............................................... 47
Hình 3.5 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-17 ............... 48
Hình 3.6 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-18 ............... 50
Hình 3.7 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-19 ............... 52
Hình 3.8 Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-20 ............... 54
Hình 3.9a Cấu trúc và tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong phần aglycone
của hợp chất GV-21 ................................................................................................. 57
Hình 3.9b Cấu trúc và tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong phần đường của
hợp chất GV-21 ....................................................................................................... 58
Hình 3.9c Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-21 ............. 58
Hình 3.38c Tương quan HMBC (mũi tên) và COSY (kẻ đậm) trong hợp chất GV-21 ........... 58
Hình 3.9d Tương quan NOESY (mũi tên) trong hợp chất GV-21 ........................................... 59
Hình 4.1 Cấu trúc của 10 hợp chất phân lập từ thân cây N. orientalis ..................................... 62

vi



Sơ đồ 2.3 Quy trình khảo sát hoạt tính ức chế quá trình peroxide hóa lipid ............................ 38

vii


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT
AO (AH)

: Antioxidant (chất kháng oxy hóa)

Asc

: Ascorbic acid (vitamin C)

BHA

: Butylated hydroxyanisole

br

: Broad (rộng)

BHT

: Butylated hydroxytoluene

CHCl3

: Chloroform


: Electron transfer methods

GSH

: Glutathione

HAT

: Hydrogen atom transfer methods

HMBC

: Heteronuclear multiple bond correlation

HR-ESI-MS

: High resolution electro spray ionization mass spectroscopy

HSQC

: Heteronuclear single quantum coherence

IC50

: Nồng độ của mẫu mà tại đó nó có thể ức chế 50 % gốc tự do

J

: Hằng số ghép


: Propyl gallate

Pr

: Protein

PTLC

: Preparative thin layer chromatography (sắc ký bản mỏng điều chế)

quin

: quintet (mũi năm)
viii


RNS

: Reactive nitrogen species

ROS

: Reactive oxygen species

s

: Singlet (mũi đơn)

SEM


XO

: Xanthine oxidase

YHCT

: Y học cổ truyền

ix


TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM KỸ THUẬT

CỘNG HOÀ XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM

THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

Độc lập - Tự do - Hạnh phúc

ĐƠN VỊ: KHOA CNHH VÀ TP
Tp. HCM, Ngày 28 tháng 10 năm 2015

THÔNG TIN KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

1. Thông tin chung:
- Tên đề tài: Nghiên cứu hoạt tính kháng oxy hóa của thân cây Gáo Vàng, Nauclea
orientalis (L.)L. (Rubiaceae)
- Mã số: T2015-66TĐ
- Chủ nhiệm: Phan Thị Anh Đào
- Cơ quan chủ trì: ĐH Sư phạm Kỹ thuật Tp. HCM

Đề tài góp phần cung cấp thông tin khoa học về thành phần và hoạt tính kháng oxy
hóa của thân cây Gáo Vàng, Nauclea orientalis (L.)L. (Rubiaceae). Do vậy, đây là
tài liệu tham khảo hữu ích cho sinh viên ngành Hóa, Sinh và Dược học. Bên cạnh
đấy, kết quả nghiên cứu của đề tài giúp đẩy mạnh ứng dụng của cây thuốc Gáo
vàng trong y học cổ truyền Việt Nam.
Ngày 28 tháng 10 năm 2015
Trưởng Đơn vị

Chủ nhiệm đề tài

(ký, họ và tên, đóng dấu)

(ký, họ và tên)

xi


INFORMATION ON RESEARCH RESULTS
1. General information:
- Project title: Study on antioxidant activity of the stem of Nauclea orientalis (L.)
L. (Rubiaceae).
- Code number: T2015- 66TĐ
- Coordinator: Phan Thi Anh Dao
- Implementing institution: HCM City University of Technology and Education
- Duration: from 6/2014 to 12/2015
2. Objective(s):
- Isolating compounds from the stem of Nauclea orientalis (L.) L. (Rubiaceae).
- Indentification the isolated compounds.
- Study on DPPH free radical scavenging and lipid peroxidation inhibitory activities of
isolated compounds.

activities of stem of Nauclea orientalis (L.) L. (Rubiaceae) helpful for student in
chemistry, biology and pharmacy. In addition, this investigation of antioxidant
phenolic compounds suggested that the potency of these compounds could provide a
chemical basis for some of the health benefits claimed for N.orientalis in foods and
folk medicine.

xiii


MỞ ĐẦU
* Tính cấp thiết: Trong những năm gần đây, các nhà khoa học đặc biệt quan tâm đến
các vấn đề gốc tự do, chất kháng oxy hóa và hoạt tính kháng oxy hóa. Trong cơ thể
con người, khi lượng gốc tự do quá lớn, vượt qua mức kiểm soát của hệ thống miễn
dịch, gốc tự do sẽ tấn công vào các đại phân tử như DNA, protein, lipid và gây rối loạn
các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Gốc tự do được biết là thủ phạm có liên quan tới
nhiều căn bệnh mà trong đó phải kể tới các bệnh nguy hiểm hiện nay như ung thư,
viêm khớp, huyết áp, tim mạch, Alzheimer, Parkinson …Chất kháng oxy hóa được
đưa vào cơ thể con người thông qua thực phẩm, dược phẩm có khả năng ngăn ngừa, ức
chế và loại bỏ tác dụng độc hại của các gốc tự do một cách trực tiếp hoặc gián tiếp.
Nhu cầu và thị yếu của con người ngày càng cao, đòi hỏi sự tìm tòi, nghiên cứu của
các nhà khoa học càng sâu rộng, hiệu quả và kịp thời.
Ngày này, xu hướng nghiên cứu mới là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc tự
nhiên nhằm thay thế cho các chất kháng oxy hóa tổng hợp hiện vẫn còn sử dụng nhiều
trong thực phẩm, y học và cuộc sống hằng ngày.
Vùng Bảy Núi, huyện Tịnh Biên, An Giang có hệ thực vật phong phú và đa dạng,
được sử dụng nhiều trong y hoc cổ truyền (YHCT). Có nhiều cây thuốc được sử dụng
trong dân gian để điều trị nhiều bệnh lý liên quan tới gốc tự do như ung thư, tim mạch,
viêm gan, tiểu đường, huyết áp…Tuy nhiên, cho đến nay, chưa có bất kỳ một nghiên
cứu qui mô và hệ thống nào về các cây thuốc Việt Nam có hoạt tính kháng oxy hóa.
Từ kết quả sàng lọc hoạt tính kháng oxy hóa của 90 cây thuốc An Giang (3/2012),

những cây thuốc này chưa có hoặc còn rất hạn chế. Ở Việt Nam, chưa có nhiều công
trình nghiên cứu mang tính qui mô, sâu rộng theo định hướng hoạt tính kháng oxy hóa.
- Cây N.orientalis đã được ứng dụng trong dân gian để chữa trị các bệnh xơ gan
cổ trướng. Tuy nhiên, nghiên cứu hóa học và hoạt tính của loài cây này thì chưa được
triển khai ở Việt Nam.
* Mục tiêu:
 Cô lập các hợp chất từ thân cây Gáo vàng, Nauclea orientalis (L.), L., Họ Cà
phê (Rubiaceae).
 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất cô lập được.
 Thử nghiệm hoạt tính kháng oxy hóa bằng phương pháp ức chế gốc tự do
DPPH, ức chế quá trình peroxyde hóa lipid.
* Cách tiếp cận


Tham khảo tài liệu.



Thực nghiệm.
2


* Phương pháp nghiên cứu:
Phương pháp nghiên cứu thực nghiệm:
Điều chế các mẫu cao bằng phương pháp trích nóng trong dung môi MeOH và cô
lập các hợp chất bằng các phương pháp sắc ký cột, sắc ký bản mỏng điều chế.
 Phương pháp nghiên cứu phân tích tổng hợp:
Phân tích và tổng hợp các dữ liệu phổ nghiệm như phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H,
13



3


CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1 GỐC TỰ DO VÀ CHẤT KHÁNG OXY HÓA
1.1.1 Khái niệm về gốc tự do
Gốc tự do (free radical) được định nghĩa là những phân tử, nguyên tử, nhóm
nguyên tử có chứa một hay nhiều electron tự do (electron độc thân) ở lớp ngoài
cùng.[1-3]
Gốc tự do gồm hai dạng hoạt động chính là: dạng hoạt động của nitrogen (RNSreactive nitrogen species) (bảng 1.1) và dạng hoạt động của oxygen (ROS-reactive
oxygen species) (bảng 1.2).
Bảng 1.1 Các dạng hoạt động của nitrogen [1]
Các dạng hoạt
động

Ký hiệu

Thời gian
tồn tại

Hoạt động

Nitric oxide

NO●

1s

Nitrogen dioxide


Thời gian
tồn tại

Superoxide

O2●─

10-6s

Gốc hydroxyl

HO●

10-9s

Alkoxyl
Gốc peroxyl
Hydroperoxide
hữu cơ
Hydrogen
peroxide

RO●
ROO●

1s
1s

ROOH

Là tác nhân oxy hóa mạnh, dễ dàng nhận một electron
để chuyển hóa thành gốc tự do HO●
Hoạt tính cao, hình thành trong quá trình quang học
(photosensitization) và phản ứng hóa học
Là một chất gây ô nhiễm trong khí quyển, có thể phản
ứng với các phân tử khác nhau để tạo ra 1O2.

Các gốc tự do thường kém bền và có năng lượng cao, dễ dàng tham gia vào nhiều
phản ứng hóa học như phản ứng oxy hóa-khử, phản ứng polymer hóa…. Gốc tự do có
hoạt tính cao nên thời gian tồn tại của chúng thường rất ngắn, phụ thuộc nhiều yếu tố:
cấu hình không gian, đặc tính cộng hưởng, hiệu ứng liên hợp.[4]
4


Hai gốc tự do quan trọng chứa nitrogen là NO• và ONOO-, trong đó NO• là gốc tự
do được quan tâm nhiều nhất do nó có vai trò rất quan trọng trong hệ thống thần kinh
trung ương, ngoại biên và là tác nhân điều hòa huyết áp. Nếu như các dạng hoạt động của
nitrogen có ý nghĩa trên lâm sàng thì các dạng hoạt động của oxygen lại là tác nhân
nguy hiểm gây ra nhiều bệnh lý.[1,5] Các dạng oxygen hoạt động này có năng lượng
cao, rất kém bền và dễ dàng phản ứng với những đại phân tử sinh học như protein,
lipid, DNA… gây rối loạn các quá trình sinh hóa trong cơ thể. Đồng thời khi một phân
tử sống bị các gốc tự do tấn công, nó sẽ mất điện tử và trở thành một gốc tự do mới,
tiếp tục phản ứng với những phân tử khác tạo thành một chuỗi phản ứng thường gọi là
phản ứng dây chuyền trong cơ thể, gây ra các biến đổi có tác hại đối với cơ thể.[1,5]
1.1.2 Các nguồn phát sinh gốc tự do trong cơ thể
1.1.2.1. Nguồn nội sinh
Gốc tự do được chính cơ thể tạo ra bởi những quá trình sinh lý (quá trình hô hấp ở
tế bào), quá trình bệnh lý (quá trình viêm nhiễm), hoặc bởi hệ thống enzyme thân oxy
hóa (prooxidant enzyme) và sự có mặt của các ion kim loại chuyển tiếp trong cơ thể.
a) Quá trình hô hấp của tế bào [6-8]

HO + H + e  H2O

(1.5)

H2O2 + H + e  HO + H2O
●

+

Bên cạnh đó, phản ứng phụ giữa các gốc tự do trong quá trình hô hấp cũng sẽ hình
thành những gốc tự do mới, độc hại hơn. Một phản ứng phụ đáng chú ý là phản ứng
-

Haber-Weiss (phản ứng 1.6), xảy ra giữa gốc O2● và H2O2 tạo nên gốc HO● và oxygen
đơn bội:
●-

O2

+ H2O2 

1

●

-

O2 + HO + HO

(1.6)

+

(1.7)

c) Các enzyme thân oxy hóa [5,6,10]
Một hệ thống các enzyme thân oxy hóa trong cơ thể có khả năng tạo gốc tự do
như xanthine oxidase (XO), nitric oxide synthase, myeloperoxidase … Gốc O2●- và
NO● là hai gốc tự do chính được sinh ra dưới sự xúc tác của các enzyme thân oxy hóa
này.
- Xanthine oxidase là một enzyme quan trọng trong quá trình thoái hóa của các
hợp chất purine. XO dùng O2 như một chất chuyển electron trong quá trình phản ứng
và kết quả dẫn đến là hình thành gốc O2●-. Điều này được minh họa bằng phản ứng 1.8
như sau:
O
HN
O

O

H
N
+

N
H

H2 O

+


ứng với gốc NO● tạo ONOO- (một hợp chất có hại đối với DNA).
6


- Enzyme myeloperoxidase được tạo ra do sự hoạt hóa bởi bạch cầu đa nhân trung
tính, sử dụng H2O2 để oxy hóa ion Cl- tạo ra HOCl, một hợp chất không phải là gốc tự
do nhưng có khả năng oxy hóa mạnh, gây nguy hại cho các mô cơ trong quá trình
viêm nhiễm.
d) Các ion kim loại chuyển tiếp [6,9]
Phản ứng giữa một ion kim loại chuyển tiếp và một hợp chất peroxide cũng góp
phần sản sinh gốc tự do trong cơ thể. Phản ứng phân hủy H2O2 thành gốc HO● dưới
xúc tác ion sắt là một ví dụ điển hình (phản ứng 1.9 và 1.10)
Fe

2+

Fe

3+

-

●

3+

+ H2O2  HO + HO + Fe
+ H2O2  H

+

-aq

(1.11)
(1.12)

Nếu trong nước có oxygen thì sẽ xảy ra phản ứng sau (phản ứng 1.13 và 1.14):
O2 + e
●

-aq

●-

 O2

(1.13)
●

H + O2  HOO (gốc hydroperoxide)

(1.14)

Như vậy, dưới tác dụng của bức xạ, các gốc tự do như HO●, O2●-, HOO● được
hình thành trong cơ thể. Điều này có thể giải thích vì sao sự lão hóa của da người sẽ
tăng lên tại những vùng bị phơi bày dưới ánh sáng. Đó là do các bức xạ mặt trời, tia
cực tím đã làm sản sinh những gốc tự do có khả năng tham gia quá trình peroxide hóa
lipid ở các tế bào da.
Bức xạ cũng có thể khơi mào những phản ứng gốc trong tế bào, chẳng hạn như sự
tự oxy hóa các lipid. Đồng thời, các phân tử DNA cũng là mục tiêu bị nguy hại bởi các
bức xạ vì các gốc tự do sản sinh từ sự phân giải nước sẽ tấn công các base của DNA.

8


S

K

L

0

0

2

1

5

4