ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Hoàng Ngọc Huyền

NGHIÊN CỨ U QUÁ TRÌNH SẢ N XUÂT́ HYDRO SINH HỌ C
TỪ RÁ C THẢ I NÔNG NGHIỆP NHỜ CHỦ NG VI KHUẨN KỊ KHI ́ ƯA NHIỆT Thermotoga Neapolitana
DSM 4359

Chuyên ngành: Vi sinh vật họ c
Mã số: 60420107

TÓM TẮT LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS. TS. Bùi Thị Việt Hà

Hà Nội - Năm 2014

MỞ ĐẦU

1


Thế giới vào những năm đầu của thế kỷ thứ 21 đang đứng trước nhiều vấn đề cần phải đối mặt. Trong đó vấn
đề thiếu năng lượng là một vấn đề cấp bách mang tính toàn cầu và cần phải sớm có biện pháp giải quyết.
Những nguồn năng lượng hóa thạch như than đá, dầu mỏ, khí thiên nhiên thì không phải là vô tận. Với sự
phát triển của ngành công nghiệp trên thế giới như hiện này thì những nguồn năng lượng này sẽ nhanh chóng cạn kiệt
và sẽ gây ảnh hưởng đến sự phát triển của xã hội cũng như đời sống con người.
Hơn nữa, đặc điểm các tài nguyên hóa thạch là trong thành phần hóa học đều có chứa các nguyên tố cacbon,
hydro, oxy, nitơ, lưu huznh, đặc biệt trong than còn có kèm theo chất phóng xạ urani và thori, do đó sử dụng những

khác như khí methane (CH4) đạt 2.148 C, propane (C3H8) đạt 2.385 C [32, 34].
1.3. Một số phƣơng pháp sản xuất hydro sinh hoc
1.3.1. Sản xuất hydro bằng điện
Sản xuất H2 bởi điện bằng cách cho dòng điện qua một điện dẫn điện trong nước (kiềm hoặc polyme), kết quả
tách phân tử H2O thành H2 và oxy (O2). Hydro được sản xuất bởi điện có chất lượng tương đối cao, không có carbon,
lưu huznh, hoặc hợp chất được tạo ra trong quá trình.
1.3.2. Sản xuất hydro bởi khí metan (SMR)
Quá trình SMR thường sử dụng hơi nước ở nhiệt độ cao (800oC) phản ứng với khí mêtan (CH4), tạo thành
H2 và carbonmonoxide (CO). Sau đó khí CO phản ứng với hơi nước để tạo thành carbondioxide (CO2) và bổ sung
H2.
1.3.3. Sản xuất Hydro bởi hơi nước của oxy hóa hydrocacbon
Hydro có thể sản xuất bằng cách oxy hóa hơi nước hoặc dung dịch của nhiều hydrocacbon khác nhau như
methanol, ethanol, glycerol, glucose hoặc sử dụng nhiệt độ và chất xúc tác

2


1.3.4. Lên men sinh hydro phụ thuộc ánh sáng
Như chúng ta đã biết, ánh sáng và nước là những nguồn tài nguyên phong phú, do đó, trong vấn đề sản xuất hydro thì
sự quang phân sinh học nước thành H2 và O2 là một giải pháp đầy hứa hẹn.
1.3.5. Lên men tối sinh hydro
Trái ngược với sự lên men sáng sinh hydro, lên men không phụ thuộc ánh sáng hay lên men tối sinh hydro là
một quá trình sản xuất sinh học có thể được thực hiện một khoảng thời gian ngắn hơn để tạo thành khí hydro, khí
CO2, acid acetic và acid lactic cùng một vài chất khác *5, 15+.
1.4. Sản xuất H2 sinh học theo con đƣờng lên men tối
H2 có thể được sản xuất sinh học bởi vi sinh vật, và do những yêu cầu đã được đề cập ở trên cho nguồn năng
lượng mới, một số vi sinh vật sản xuất H2 đã được phân lập và nghiên cứu trong một vài năm gần đây *10, 33+. Tất cả
các phương pháp được biết đến của việc sản xuất H2 sinh học dựa trên các enzym xúc tác cho các phản ứng hóa học
+
2H + 2 e ↔ H2.

hydrogenase (EC 1.12.99.6 và EC1.12.7.2) cũng tác động ngược lại vào quá trình oxy hoá của phân tử hydro
1.6.6. Những đặc điểm của phù hợp với việc sản xuất hydro
Trong chi Thermotoga, Thermotoga neapolitana được coi là “mạnh” nhất vì thích nghi với các điều kiện khác
nhau, các nguồn cacbon khác nhau và sản sinh ra lượng hydro cao nhất
1.7. Các nguồn nguyên liệu tái sinh
1.7.1. Chất thải sản xuất đường
Sản xuất đường là ngành công nghiệp quan trọng phổ biến rộng rãi trên toàn thế giới. Trong quá trình sản
xuất đường nhiều loại chất thải khác nhau như mật đường, bã mía, và nước thải được tạo ra. Các loại rác thải là môi
trường thích hợp cho sự phát triển của vi sinh vật.
1.7.2. Chất thải sản phẩm sữa
Chất thải sản phẩm sữa, trong đó có sữa hoặc dư lượng pho mát và sữa, được biết là có một lượng lớn các
chất hữu cơ có giá trị COD dao động từ 5 và 50g/L (Seifert et al. 2010a).
1.7.3. Bã đậu
1.7.4. Glycerol

3


1.7.5. Rơm, rạ

CHƢƠNG 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.1. Chủng giống
Chủng được lựa chọn để tiến hành nghiên cứu là Thermotoga neapolitana DSM 4359 và được mua tại
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Đức
2.2. Các thiết bị và dụng cụ thực hiện thí nghiệm
2.2. 1. Các thiết bị
- Máy đo OD
- Hệ thống sắc kí khí GC
- Hệ thống sắc kí lỏng cao áp
- Nồi lên men 5L

neapolitana DSM 4359 đã sinh trưởng tốt và sinh ra khí hydro.
3.1.2. Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đơn giản đến sự sản sinh hydro của chủng Thermotoga neapolitana DSM
4359
Có thể thấy: hàm lượng hydro cao nhất thu được ở nồng độ các cơ chất glucose, xylose đều là 5g/L, với hàm
lượng lần lượt là: 19.68 và 20.01(mmol/L).

4


3.1.3. Khảo sát một số nguồn nitơ phổ biến cho sự sản xuất hydro sinh học từ chủng vi khuẩn kỵ khí ưa nhiệt DSM
4359 và đánh giá khả năng sinh hydro
Do đó, có thể thấy rằng hàm lượng hydro cao nhất thu được ở nồng độ các nguồn nitơ là cao nấm men,
peptone và NH4 NO3 đều là 2g/L, với hàm lượng lần lượt là: 20.01; 19.27; 13.16 (mmol/L).
3.2. Nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ tới quá trình sản xuất hydro của DSM 4359
o
Khi nhiệt độ nuôi cấy tăng từ 50 đến 75 C thì lượng hydro sinh ra và sự phát triển của tế bào tăng dần và đạt
o
giá trị cực đại ở 75 C, với sản lượng hydro thu được tăng từ 9.82 đến 20.09 (mmol/L) và giá trị OD tăng từ 0.15 đến
0.39
3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của pH tới quá trình sản xuất hydro của chủng vi khuẩn Thermotoga neapolitana DSM
4359
Khi giá trị pH tăng từ 5 đến 7.5 thì cho thấy có sự tăng tích lũy hydro nhanh chóng từ 6.56 đến 20.13 mmol/L
Sự phát triển của vi khuẩn thì đạt giá trị cực đại là OD600 = 0.39 khi giá trị pH là 7.
3.4. Nghiên cứu phƣơng pháp sục khí nitơ làm giảm áp suất khí trong bình nuôi cấy để tăng hàm lƣợng hydro
Hơn nữa, dưới điều kiện sục khí nitơ và kiểm soát pH, sự sản xuất hydro cao hơn nhiều so với không có sự sục
khí nitơ nhưng không bao gồm sự kiểm soát pH. Lượng khí hydro thu được khi áp dụng phương pháp sục khí nitơ và
kiểm soát pH tăng lên đến 2.98±0.1 mol hydro/mol glucose tiêu thụ sau nuôi cấy.
3.5. Hàm lƣợng acid hữu cơ đƣợc tạo trong quá trình sản xuất hydro của
T. neapolitana
Sau 24h nuôi cấy, pH môi trường giảm nhanh xuống dưới mức tối ưu (7-6.8), cùng với đó, tốc độ sinh hydro

Tiền xử lý vớ i axit sulfuric 1% ở nhiệt độ 121 C trong thờ i gian 50 phút thì sẽ cho hiệu quả cao nhât́ và xử l{
đượ c 65,97% xylose.
3.7.3.2. Thành phần của rơm rạ sau tiền xử lý
Theo phương pháp 2.3.4, có được kết quả phân tích thành phần của rơm rạ như sau: 41% cellulose; 17.8%
lignin; và một số chất khác
3.7.3.3. Sản lượng hydro sử dụng cơ chất rơm rạ đã qua xử lý

5


Để xác định ảnh hưởng của cơ chất rơm rạ đến sản lượng hydro, chủng nghiên cứu được nuôi cấy trong thời
gian từ 24 giờ đến 120 giờ sử dụng cơ chất rơm rạ thô và rơm rạ đã qua tiền xử l{ với nồng độ 5g/L.
tiền xử l{ rơm rạ giúp làm tăng sản lượng hydro một cách đáng kể so với khi không qua tiền xử l{. Sản lượng
hydro đạt mức cao nhất11.52 mmol/L, cao hơn gần 4 lần so với khi sử dụng rơm rạ thô làm cơ chất (3.28 mmol/L), với
85.4% cơ chất được tiêu thụ, mức độ chuyển hóa đường là 95.7% đối với xylose và 73% với glucose.
3.8. Nghiên cứu quá trình sản xuất hydro bằng phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung (fed-batch culture) sử
dụng nồi lên men 5 L
Để sản xuất hydro liên tục và làm tăng sản lượng hydro. Phương pháp lên men theo mẻ có bổ sung sử dụng
nồi lên men 5L được thực hiện sử dụng 5g/L glucose làm cơ chất, pH được duy trì ở mức 7.0 bằng 2N NaOH, tốc độ lắc
400rpm, với 4 đợt bổ sung cơ chất tại các thời điểm 39, 57, 78 và 99h nuôi cấy
Tổng kết lại sau 5 pha nuôi cấy liên tục với 4 lần bổ sung cơ chất, tốc độ sản xuất hydro trung bình đạt 3.15
mmol/L/h.
3.9. Đánh giá khả năng sử dụng nguyên liệu đầu vào đối với quá trình sản sinh hydro của chủng vi khuẩn nghiên
cứuTrên quy mô nhỏ, chúng tôi tiến hành thí nghiệm sử dụng bình với thể tích 120mL. Với pH tối ưu ban đầu được
đưa vào là 7.5 và nhiệt độ luôn duy trì ở mức 70°C
KẾT LUẬN
1. Đã hoạt hóa và nuôi cấy được chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 - chủng vi khuẩn kí khí ưa nhiệt
dùng để nghiên cứu sản xuất hydro sinh học. Đã xác định được nồng độ cơ chất ban đầu phù hợp
2. Đã nghiên cứu khảo sát được nguồn nitơ phù hợp là 2g/L cao nấm men, cho sản lượng hydro đạt 20.01
mmol/L. Đã xác định được điều kiện nuôi cấy tối ưu cho chủng Thermotoga neapolitana DSM 4359 là nhiệt

This is a new direction and promising but equally difficult and challenging. So I proceed to implement the project, "the
study of biological hydrogen production from agricultural waste by thermophilic bacteria Thermotoga neapolitana
DSM 4359" with the following objectives:
1. Develop a process of biological hydrogen production from a number of different substrates (glycerol, xylose,
glucose ...).
2. Given the results of exploration a source of agricultural waste as raw material for the process of biological hydrogen
production by fermentation of thermophilic anaerobic bacteria Thermotoga neapolitana DSM 4359.
CHAPTER 1 - OVERVIEW
1.1. Current status of the world's energy resources and the need to find alternative energy sources
1.1.1.Oil
Natural resources from the sea has become the focal point of international competition. Oil is still considered the
main energy source for the world by 2025.
1.1.2.NaturalGas
Along with oil, recently, natural gas has been regarded as one of the fuels have a huge demand in the world with
annual demand rising fastest
1.1.3.Coal
As fossil fuels are used in the world for a long time. Total coal reserves worldwide are estimated at 1,083 billion tons,
enough for about 170 years at current consumption
1.2. Hydrogen is an energy source strengths Vietnam
Hydrogen is a chemical element in the periodic system of elements with atomic mass by 1 In the free state and in the
normal conditions, hydrogen colorless, odorless and tasteless, density is equal to 1 / 14 air density. Combustion
temperature of hydrogen can be up to 3.000oC if burning in oxygen, the highest compared to all other gases such as
methane (CH4) reached 2.148oC, propane (C3H8) reached 2.385oC [32, 34].
1.3. Some methods of biological hydrogen production
1.3.1. Production of hydrogen by electricity
H2 production by electricity by an electric current through the conductive water (alkaline or polymer), resulting in
separation of H2 and H2O molecules into oxygen (O2). Hydro electricity is produced by a relatively high quality, not
carbon, sulfur, or compounds that are created in the process.
1.3.2. Hydrogen production by methane (SMR)
SMR process usually uses steam at high temperature (800oC) reacts with methane (CH4), forming H2 and

Industry: Thermotogae;
Grade: Thermotogae;
Ministry: Thermotogale
They are: Thermotogaceae;
Sub: Thermotoga [33]
1.6.3.Dac morphological and ecological
• Cells rod-shaped, Gram-negative, exist separately or in pairs; Length: 1.1 to 1.5 micron, width: 0.6 micron
1.6.4. Features genome
• NST circular form
• 1800 kb genome
• G + C ratio was 41.3% [35]
Features and cell metabolism
1.6.5. Hydrogenase of Thermotoga
Enzyme responsible for the production of hydrogen (H2) and hydrogen protons combine equivalent (2H + + 2e-) is the
hydrogenase (EC 1.12.99.6 and EC1.12.7.2) and opposite effects on the oxidation of molecular hydrogen
1.6.6. These characteristics suitable for the production of hydrogen
In spending Thermotoga, Thermotoga neapolitana is considered "strong" because most adapted to the different
conditions, different carbon sources and produces the highest amount of hydrogen
1.7. The recycled materials
1.7.1. Waste production line
Sugar production is an important industry spread worldwide. During production lines of different types of waste, such
as molasses, bagasse and waste water is generated. These wastes are suitable environment for the growth of
microorganisms.
1.7.2. Waste milk products
Waste milk products, including milk or cheese and milk residues, is known to have a large amount of organic matter
COD values ranged between 5 and 50 g / L (Seifert et al. 2010a).
1.7.3. Soybean Meal
1.7.4.Glycerol
1.7.5. Straw
Chapter 2 - MATERIALS AND METHODS

of 75 ° C, pH7.5 using Biotron control system. pH is kept constant by the addition of 2NNaOH.
2.7.Theanalyticalmethod
The growth of cells was assessed by cell dry weight (dry cell weight - DCW) and cell density (density opical - OD600)
was measured by a OD. H2 gas in the headspace was obtained by gas-tight syringe, a suction volume of 100 uL
(Australia) and is determined by means of gas chromatography GC
Acetic acid and lactic acid system is determined by high pressure liquid chromatography
The results obtained were processed by means of biostatistics.

TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1.
Bùi Thanh Huyền, “Bức tranh năng lượng thế giới”, Chuyên đề năng lượng- VnGG,
Chương 11.
2.
vật.
3.

Nguyễn Lân Dũng, Bùi Thị Việt Hà (2009), Sinh trưởng và phát triển của vi sinh
Trần Vạn Thọ, “Phân loại sơ lược”, Chuyên đề năng lượng- VnGG, Chương 2.

Tài liệu tiếng Anh
4.
Tien Anh Ngo, Ha Thi Viet Bui, (2011), “Study on biohydrogen production from
various substrates by Thermotoga neapolitana DSM 4359”, VNU, J. Scen Nat Sci & Tech,
27 (2S), 292-296.
5.
Chieh-Lun Cheng, Yung-Chung Lo, Kuo-Shing Lee, Duu-Jong Lee, Chiu-Yue Lin,
Jo-Shu Chang (2011), “Biohydrogen production from lignocellulosic feedstock”,
Bioresource Technology102, pp. 8514–8523.
6.

conditions”, International journal of hydrogen energy, 36, pp. 8712 – 8718.
13.
Nima Nasirian, Morteza Almassi, Saeid Minaei, Renatus Widmann, (2011),
“Development of a method for biohydrogen production from wheat straw by dark
fermentation”, International journal of hydrogen energy, 36, pp. 411 – 420.
14.
Reith J.H., R.H. Wijffels and H. Barten, Bio- methane & bio – hydrogen, pp. 103 121.
15.
Pallavi Sinha, Anjana Pandey, (2011), “An evaluative report and challenges for
fermentative biohydrogen production”, International journal of hydrogen energy36, pp.
7460 – 7478.
16.
Patrik R. Jones (2008), “Improving fermentative biomass-derived H2-production by
engineering microbial metabolism”, International journal of hydrogen energy, 33, pp. 5122
– 5130.
17.
S.Van Ooteghem, P. H. Yue, S. Beer, Thermotoga neapolitana: A microaerophile
producing hydrogen in the presence of oxygen, National Energy Technology Laboratory.
18.
Shinsuke Sakai, Tatsuo Yagishita, (2007), “Microbial Production of Hydrogen and
Ethanol From Glycerol-Containing Wastes Discharged From a Biodiesel Fuel Production
Plant in a Bioelectrochemical Reactor With Thionine”, Biotechnology and Bioengineering,
98 (2).
19.
Suellen A. Van Ooteghem, Stephen K. Beer, Paul C. Yue, (2001), Hydrogen
Production by the Thermophilic Bacterium, Thermotoga neapolitana, National Energy
Technology Center, U.S. Department of Energy.
20.
Susan E. Childers, Madeline Vargas, Kenneth M. Noll, (1992), “Improved Methods
for Cultivation of the Extremely Thermophilic Bacterium Thermotoga neapolitana”,

(1977), “Energy conservation in
chemotrophic anaerobic bacteria”, Bacteriol. Rev., 41.
26.
Thiruchitrambalam Valliyappan (2004), Hydrogen or Syn Gas Production from
Glycerol Using Pyrolysis and Steam Gasification Processes, University of Saskatchewan
Saskatoon, Saskatchewan, Master thessis.
27.
You-Kwan Oh, Subramanian Mohan Raj, Gyoo Yeol Jung, Sunghoon Park, (2011),
“Current status of the metabolic engineering of microorganisms for biohydrogen
production”, Bioresource Technology, 102, pp. 8357–8367.
28.
Yung-Chung Lo, Yi-Chen Su, Chieh-Lun Cheng, Jo-Shu Chang, (2011),
“Biohydrogen production from pure and natural lignocellulosicfeedstock with chemical
pretreatment and bacterial hydrolysis”, International journal of hydrogen energy, 36, pp.
3955 – 3963.
29.
Chieh-Lun Cheng, Yung-Chung Lo, Kuo-Shing Lee, Duu-Jong Lee, Chiu-Yue Lin,
Jo-Shu Chang “Biohydrogen production from lignocellulosic feedstock”, Bioresource.
Technol, (2011), 102, (18), 8514 – 8523.
30.
Reith J.H., R.H. Wijffels and H. Barten (2003), “Bio-methane &Bio-hydrogen”,
Dutch Biological Hydrogen Foundation
31.
David B. Levin, Richard Chahine, (2010), “Challenges for renewable hydrogen
production from biomass”, Inter J of Hydrogen Energy, 35, (10), 4962 – 4969.
32.
Suellen A. Van Ooteghem, Stephen K. Beer Paul C. Yue, (2001), “Hydrogen
Production by the Thermophilic Bacterium, Thermotoga neapolitana”Proceeding of 2001 of
Hdrogen program review.


energy, 37(20), 14983-15840.
39.
Angela A Abreu, Dimitar Kara kashev, Irini Angelidak, Diana Z Sousa and M
Madalena Alves (2012) “Biohydrogen production from arabinose andglucose using extreme
thermophilic anaerobicmixed cultures”, Biotechnology for Biofuels, 5(6).
40.
Martina Cappelletti, Giacomo Bucchi, Jocelia De Sousa Mendes, Andrea Alberini,
Stefano Fedi, Lorenzo Bertin and Dario Frascari, (2012) “Biohydrogen production from
glucose, molasses and cheese whey by suspended and attached cells of four
hyperthermophilic Thermotoga strains, Chemical Technology & Biotechnology, 87 (9),
1291-1301.
41.
Kuan-Yeow Show, Duu-Jong Lee, Jo-Shu Chang (2012) “Bioreactor and process
design for biohydrogen production”, Bioresource Technology
42.
Hui Wang, Zelun Zhi, Jian Wang, Shenghua Ma (2012) “Comparison of various
pretreatment methods for biohydrogenproduction from cornstalk”, Bioprocess Biosyst Eng
(2012) 35:1239–1245.
43.
Chin-Chao Chen, Biswarup Sen, Yeong-Song Chuang, Chia-Jung Tsai, Chyi-How
Lay (2012) “Effect of enfluent recycle ratio in a continuous anaerobic biohydrogen
production system”, Journal of Cleaner Production, 32, 236-243.
44.
Cortright RD. Hydrogen generation from biomass – derived Compounds Utilizing
aqueous – phasere forming. In:Vehicle Power and propulsion, 2005 IEEE conference;
September 2005.doi:10.1109/VPPC.2005.1554603.

12