ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ LIỄU

“BƢỚC ĐẦU NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC
TRỪ CỎ GLYPHOSATE VÀO CÂY ĐẬU TƢƠNG NHỜ
VI KHUẨN AGROBACTERIUM TUMEFACIENS”

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội – Năm 2014


ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

NGUYỄN THỊ LIỄU

“Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ
glyphosate vào cây đậu tƣơng nhờ vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens”
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 0114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. PGS.TS. Đặng Trọng Lƣơng

CaMV:

Virus khảm súp lơ (Cauliflower Mosaic Virus)

Car:

Carbenicillin

CS:

Cộng sự

FAO:

Tổ chức lƣơng thực và Nông nghiệp (Food and Agriculture
Organization)

GA3:

Gibberellic acid

GFP:

Green Fluorescent Protein

GMC:

Cây trồng biến đổi gen (Genetically modified crop)

GMO:

Agri-Biotech

Application)
LB:

Luria Bertani

L-Cys:

L-Cystein

MS-B5:

Môi trƣờng Murashige and Skoog có bổ sung vitamin B5

α-NAA:

α-Napthalene acetic acid

nptII:

Neomycin Phosphotransferase II

PCR:

Phản ứng chuỗi trùng hợp (Polymerase Chain Reaction)

T-DNA:

Transfer-DNA

Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của α-NAA đến khả năng ra rễ giống đậu tƣơng DT2008
................................................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.5.Biểu hiện tạm thời của gen gus khi lây nhiễm các chủng Agrobacterium
khác nhau với nốt lá mầm giống đậu tƣơng DT2008 và ĐT26 ....... Error!
Bookmark not defined.
Bảng 3.6. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng của mật độ dung dịch vi khuẩn
(OD600) đến khả năng biểu hiện gen gus của DT2008 và ĐT26 .............50
Bảng 3.7. Hiệu suất biến nạp vào đậu tƣơng theo thời gian biến nạp đối với giống
đậu tƣơng DT2008, ĐT26 ....................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.8. Ảnh hƣởng của thời gian đồng nuôi cấy đến biểu hiện tạm thời của gen gus
................................................................. Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.9. Hiệu quả ức chế vi khuẩn A.tumefaciens và ảnh hƣởng của tổ hợp kháng
sinh cefotaxim và vancomycin đến khả năng tái sinh của hai giống ĐT26
và DT2008 ............................................... Error! Bookmark not defined.
Bảng 3.10. Ảnh hƣởng của kháng sinh kanamycin đến khả năng tái sinh của mẫu lá
mầm giống đậu tƣơng DT2008 và ĐT26 Error! Bookmark not defined.

III


IV


DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Cấu trúc Ti-plasmid................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.2. Cấu trúc T-DNA ........................................ Error! Bookmark not defined.
Hình 1.3. Quá trình chuyển gen vào thực vật ........... Error! Bookmark not defined.
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp .................. Error! Bookmark not defined.
Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc vector nhị phân .................. Error! Bookmark not defined.
Hình 1.6. Cấu trúc chung của vector pCAMBIA ...... Error! Bookmark not defined.

Hình 3.10. Các mẫu đậu tƣơng ở công thức đối chứng (A, B), giống DT2008, ĐT26
sau khi rửa khuẩn (C, D) và trên môi trƣờng chọn lọc sau 2 tuần nuôi cấy
(E, G) ....................................................... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.11. Ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến khả năng tái sinh chồi từ lá
mầm của giống đậu tƣơng DT2008 ......... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.12. Sơ đồ quy trình chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ CP4-EPSPS thông qua vi
khuẩn Agrobacterium tumefaciens..........................................................60
Hình 3.13. Một số hình ảnh quy trình chuyển gen CP4-EPSPS vào cây đậu tƣơng
thông qua vi khuẩn Agrobacterium ......... Error! Bookmark not defined.
Hình 3.14. Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA
genome của các cây đậu tƣơng DT2008 đã biến nạpError!

Bookmark

not defined.
Hình 3.15. Sản phẩm điện di phản ứng PCR nhân gen CP4-EPSPS từ mẫu DNA
genome của các cây đậu tƣơng ĐT26 đã biến nạpError! Bookmark not
defined.

VI


MỤC LỤC
MỞ
ĐẦU.............................................................................................................
........Error! Bookmark not defined.
CHƢƠNG I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................. Error! Bookmark not defined.
1.1. Giới thiệu chung về đậu tƣơng ....................... Error! Bookmark not defined.
1.1.1. Nguồn gốc ................................................ Error! Bookmark not defined.
1.1.2. Phân loại ................................................... Error! Bookmark not defined.

1.4.1. Khái quát chung về vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens .............. Error!
Bookmark not defined.
1.4.2. Ti-plasmid ................................................ Error! Bookmark not defined.
1.4.3. Quá trình vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens chuyển T-DNA vào tế
bào thực vật trong tự nhiên ................................. Error! Bookmark not defined.
1.5. Quá trình chuyển gen thực vật thông qua Agrobacterium tumefaciens . Error!
Bookmark not defined.
1.5.1. Khái quát chung về chuyển gen thực vật . Error! Bookmark not defined.
1.5.2. Hệ thống vector chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens ......................................................... Error! Bookmark not defined.
1.5.3. Các gen chọn lọc và gen chỉ thị................ Error! Bookmark not defined.
1.5.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp thông qua A.tumefaciens
............................................................................ Error! Bookmark not defined.
1.6. Nghiên cứu chuyển gen kháng thuốc trừ cỏ glyphosate trên cây đậu tƣơng
............................................................................... Error! Bookmark not defined.
1.6.1. Cơ chế kháng glyphosate.......................... Error! Bookmark not defined.
1.6.2. Đậu tƣơng chuyển gen kháng glyphosate Error! Bookmark not defined.
1.7. Phƣơng pháp PCR và việc xác định cây chuyển genError! Bookmark not
defined.
1.7.1. Kỹ thuật PCR và các yếu tố cần thiết ....... Error! Bookmark not defined.
1.7.2. Xác định sự có mặt của gen đƣợc chuyển bằng kỹ thuật PCR ........ Error!
Bookmark not defined.
CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨUError! Bookmark
not defined.
2.1. Vật liệu nghiên cứu ......................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.1. Vật liệu thực vật ...................................... Error! Bookmark not defined.
2.1.2. Vật liệu vi khuẩn ...................................... Error! Bookmark not defined.

VIII


IX

Bookmark

not


3.2.3. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của thời gian lây nhiễm vi khuẩn A.
tumefaciens đến hiệu quả chuyển gen trên giống đậu tƣơng DT2008, ĐT26
............................................................................ Error! Bookmark not defined.
3.2.4. Kết quả nghiên cƣ́u ảnh hƣởng của thời gian đ ồng nuôi cấy đến hiệu quả
chuyển gen vào DT2008 và ĐT26 ..................... Error! Bookmark not defined.
3.2.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của tổ hợp kháng sinh cefotaxim và vancomycin
đến hiệu quả ức chế vi khuẩn ............................. Error! Bookmark not defined.
3.2.6. Kết quả nghiên cứu ảnh hƣởng của nồng độ kanamycin đến sức sống và
khả năng tái sinh của mẫu lá mầm giống DT2008 và ĐT26Error! Bookmark
not defined.
3.3. Kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tƣơng DT2008 và ĐT26
đã biến nạp .............................................................. Error! Bookmark not defined.
3.3.1 Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tƣơng
DT2008 đã biến nạp ........................................... Error! Bookmark not defined.
3.3.2. Kết quả kiểm tra sự có mặt của gen CP4-EPSPS ở các mẫu đậu tƣơng
ĐT26 đã biến nạp ............................................... Error! Bookmark not defined.
Chƣơng IV - KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................. Error! Bookmark not defined.
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................1
PHỤ LỤC..................................................................................................................7

X




trung gian Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông
thôn, 1, tr. 14-19.
11. Trần Thị Cúc Hòa (2008),“Tối ƣu hóa quá trình chuyển gen đậu tƣơng
bằng cải tiến phƣơng pháp lây nhiễm với Agrobacterium tumefaciens”, Tạp
chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, 9, tr. 8-11.
12. Phạm Xuân Hội, Trần Duy Quý (2002), “Công nghệ gen trong việc tăng sản
lƣợng lúa”, Thông tin công nghệ sinh học ứng dụng, Bộ Nông nghiệp và Phát triển
nông thôn - Viện Di truyền Nông nghiệp, 3+4/2002, tr. 1-10.
13. Lê Thị Ánh Hồng (2000), Cơ sở khoa học công nghệ chuyển gen ở thực vật,
NXB Nông Nghiệp, tr. 51- 84.
14. Lê Thị Thu Hiền (2003), Tạo chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens mang
gen kháng côn trùng để chuyển vào cây trồng, Luận án tiến sĩ sinh học, Viện khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
15. Nguyễn Thị Thuý Hƣờng, Trần Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thu Hiền, Chu Hoàng
Mậu (2009), “ Phát triển hệ thống tái sinh in vitro ở cây đậu tƣơng (Glycine max
(L.) Merill) phục vụ chuyển gen”, Tạp chí khoa học & công nghệ, 52(4), tr. 89-93.
16. Trần Bích Lan, Nguyễn Đức Doanh, Nguyễn Lan Hƣơng, Vũ Đức Quang, Trần
Duy Quý (1998),“Kết quả bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen vào giống lúa trồng ở
Việt Nam qua Agrobacterium tumefaciens”, Báo cáo hội nghị toàn quốc về công
nghệ sinh học cây lúa, Huế, tháng 5/1998.
17. Đặng Trọng Lƣơng, Vũ Đức Quang, Nguyễn Đức Doanh, Nguyễn Hữu Đống
(2000), “Nghiên cứu chuyển gen CryIAc kháng sâu vào một số giống cải bắp”, Kết quả
nghiên cứu khoa học 1999 – 2000, Viện Di Truyền Nông Nghiệp, tr. 120-128.
18. Lã Tuấn Nghĩa, Trần Lan Hƣơng, Nguyễn Đức Doanh, Vũ Đức Quang, Trần
Duy Quý (1995), “Bƣớc đầu nghiên cứu chuyển gen vào cà chua qua
Agrobacterium”, Tạp chí công nghệ sinh học ứng dụng, 2, tr. 18-23.
19. Đỗ Tiến Phát, Đinh Thị Phòng, Chu Hoàng Hà (2008), “Đánh giá ảnh hƣởng
của thời gian nhiễm khuẩn tới hiệu quả chuyển gen vào cây bông (Gossypium
hirsutum L.) thông qua Agrobacterium tumefaciens”, Tạp chí công nghệ sinh học,

in seeds and traits by setting up new research focus area in cereals”, Bayer
Crop Scienc, July 21, 2009.
30. Bertheau Y., Diolez A., Kobilinsky A., Magin K (2002), “Detection methods

3


and performance criteria for gennetically modified organisms”, Journal of AOAC
International, 85 (3), pp. 801-808.
31. Carlson R. (2009), “The Market Value of GM Products”, Nature Biotechnology,
27, pp. 984.
32. Cheng M., Lowe B.A., Spencer T.M., Ye X.D. and Armstrong C.L. (2004),
"Factors influencing Agrobacterium-mediated transformation of monocotyledonous
species In Vitro Cellular and Developmental”, BiologyPlant, 40(1), pp. 31-45.
33. NagadharaD., RameshS., PasaluI. C., Kondala R. Y., KrishnalahN. V., SarmaN.
P., BownD. P., GatehouseJ.A., Reddy V. D. and Rao K. V. (2003), “Transgenic
indica rice resistant to sap-sucking insests”, Plant Biotechnology Journal, 1, pp.
231-240.
34. FAOSTAT (2009), Agricultural data, available from: ./
35. Finer J.J. (1988), “Apical proliferation of embryogenic tissue of soybean
[Glycine max (L.) Merrill]”, Plant Cell Reports, 7, pp. 238-241.
36. Frame B.R., McMurray J.M., Fonger T.M., Main M.L., Taylor K.W., Torney
F.J.,

Paz

M.M.,

Wang


Laureate Dr. Norman E. Borlaug (1914-2009")”, ISAAA Brochure available from:
/>43. Jones E.D., and Mullin J.M. (1974), “The effect of potato virus X on
susceptibility of potato tubers to Fusarium roseum”, “Avenaceum”,

American

Journal of Potato Research, 51, pp. 209-251.
44. Li D., Chen P., Alloatti J., Shi A. and Chen Y. F. (2010),“Identification of New
Alleles for Resistance to Soybean Mosaic Virus in Soybean”, Published in
Crop Science, 50, pp. 649-655.
45. Liu S.J., Wei Z.M., Huang J.Q. (2008), “The effect of co-cultivation and
selection parameters on Agrobacterium-mediated transformation of Chinese
soybean varieties”, Plant Cell Reports, 28, pp. 489-498.
46. Mayolo G.A., Maximova S.N., Piskak S., Guiltinan M.J. (2003), “Moxalactam
as a counter-selection antibiotic for Agrobacterium-mediated transformation and its
positive effects on Theobroma cacao somatic embryogenesis”, Plant Science
Amsterdam, 164, pp. 607-615.
47. Olhoft P.M., Flagel L.E., Donovan C.M., Somers D.A (2003), "Efficient
soybean

transformation

using

hygromycine

B

selection


Biotechnology, 24, 435-440.
56. Suryadevara S.R., Lewamy M., Matt M., Raghuveer P., Prachuab K. and David
H. (2009), “Non-antibiotic selection systems for soybean somatic embryos: the
lysine analog aminoethyl-cysteine as a selection agent”, BMC Biotechnology, 94,
pp.1472-1489.
57. Tran Thi Cuc Hoa, Tran Vu Hai and La Cao Thang (2008), “Transformation
efficiencies of the Soybean Variety PC 19 [Glycine max (L.) Merrill] using Agrobacterium
tumefaciens and the cotyledonary node method”, Omorice, 16, pp. 1-8.
58. Tzu-Ming Pan (2002), “Current status and detection of genetically modified
organism”, Journal of Food and Drug Analysis, 10(4/2002), pp. 229-241.
59. USDA National Agriculture Statistics Service (NASS) (2009), “Adoption of
Genetically

Engineered

Crops

in

the

National

Agriculture

Statistics”, />60. Wang Z., Libault M., Joshi T., Valliyodan B., Nguyen H. T., Xu D., Stacey G.,

6



(L.) Merrill)”, Plant Cell Reports, 22, pp. 478-482.
67. ZHU Chengsong, GU Heping and CHEN Xin (1999), "Advances in the Genetic
Engineering of Insect-Resistant Soybeans", Soybean Science Journal, 18(3), pp.
260-264.

7