BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI

------------ 



 ---------- NGUYỄN HỮU HẢI

NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN KHÁNG NGUYÊN Ha1
CỦA VIRUT H5N1 VÀO BÈO TẤM Wolffia globosa
THÔNG QUA VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens

LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP
Chuyên ngành: Di truyền và chọn giống cây trồng
Mã số: 60.62.05
Người hướng dẫn khoa học: TS. PHẠM THỊ LÝ THU
luôn ở bên cạnh giúp ñỡ và ñộng viên tôi trong suốt thời gian qua!
Tác giả luận văn
Nguyễn Hữu Hải

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………iii
MỤC LỤC

Lời cam ñoan 1
Lời cảm ơn ii
Mục lục iii
Danh mục các chữ viết tắt v
Danh mục bảng vi
Danh mục hình vii
1 MỞ ðẦU 1
1.1 ðặt vấn ñề 1
1.2 Mục ñích và yêu cầu của ñề tài 2
2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
2.1 Giới thiệu chung về bèo tấm Wolffia globosa 3
2.2 Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật 5
2.3 Cơ sở khoa học của phương pháp PCR 15
2.4 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 16
3 ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22
3.1 Vật liệu 22
3.2 Nội dung nghiên cứu 23
3.3 Phương pháp nghiên cứu 24
3.4 ðịa ñiểm và thời gian nghiên cứu 35
4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36

bp base pair
CaMV35S- P Cauliflower Mosaic Virus 35S promoter
CTAB Cetyltrimeethylammonium bromide
DNA Deoxy ribo-Nucleic Acid
ðC ðối chứng
EDTA Ethylene Diamine Tetraacetace Acid
Et-Br Ethidium Bromide
gus β- glucuronidase gene = gen mã hoá β-glucuronidase
NOS Nopaline Synthetase
NOS-P Nopaline Synthetase Promotor
nptII Neomycin phosphotransferase gene
= gen mã hoá neomyciphosphotransferase
OD
600
Mật ñộ vi khuẩn ño ở bước sóng 600nm bằng quang phổ kế
DUR800 Spectrophotometer của hãng Beckman Coulter
PCR Polymerase Chain Reaction
T-DNA transferred-DNA = DNA chuyển
Ti- Plasmid Tumor inducing plasmid = plasmid gây khối u thực vật
X-Gluc 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………vi
DANH MỤC BẢNG
STT Tên bảng Trang
1 Lựa chọn chủng vi khuẩn A. tumefaciens thích hợp cho chuyển gen
vào bèo tấm Wolffia globosa 37

2 Ảnh hưởng mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen
gus ở bèo tấm Wolffia globosa chuyển gen 39


3.2 Vectơ nhị phân pCAMBIA1301 và vector p6d35SUbiHa1 23
4.1 Biểu hiện của gen gus khi biến nạp bằng các chủng vi khuẩn
Agrobacterium tumefacies 38
4.2 Ảnh hưởng của mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của
gen gus ở bèo tấm W. globosa sau khi biến nạp với A. tumefaciens 40
4.3 Ảnh hưởng của cách phương thức lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện
của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen. 42
4.4 Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm ñến tỷ lệ biểu hiện của gen gus 45
4.5 Ảnh hưởng của Acetosyringone (AS) ñến biểu hiện của gen gus
ở bèo tấm W. globosa chuyển gen 47
4.6 Biểu hiện của gen gus ở bèo Wolffia globosa chuyển gen trên các
môi trường ñồng nuôi cấy khác nhau 48
4.7 Ảnh hưởng của thời gian ñồng nuôi cấy ñến tỷ lệ biểu hiện của
gen gus ở Wolffia globosa chuyển gen. 50
4.9 Ảnh hưởng của Geneticin tới sự sinh trưởng và phát triển của bèo
tấm Wolffia globosa 53
4.10 Ảnh hưởng của Paromomycin tới sự sinh trưởng và phát triển
của bèo tấm Wolffia globosa 53
4.8 Biểu hiện của gen gus khi chuyển gen bằng quy trình hoàn thiện 55
4.10 Kết quả kiểm tra DNA tổng số của 12 mẫu bèo W. globosa
chuyển gen 57
4.11 Kết quả phân tích PCR của 12 dòng bèo W. globosa chuyển gen 58

Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………1
1. MỞ ðẦU

1.1. ðặt vấn ñề
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, ñời sống con người cũng
không ngừng ñược nâng cao. Việc chăm sóc sức khỏe cộng ñồng ngày càng
ñược quan tâm chú ý hơn. Nhất là trong giai ñoạn hiện nay, khi mà hiện tượng

mạnh mẽ. Chúng có thể sống ở nhiều vùng khí hậu khác nhau; có khả nhân
sinh khối nhanh; chứa nhiều loại vitamin A, B1, B2,… và ñặc biệt là chúng có
bộ máy sản xuất protein khá mạnh. Với những ưu ñiểm ñó bèo tấm Wolffia
globosa mang nhiều lợi thế cho việc sản xuất các loại protein tái tổ hợp.
Xuất phát từ những lý do trên chúng tôi ñã thực hiện ñề tài: “Nghiên
cứu chuyển gen kháng nguyên Ha1 của virus H5N1 vào bèo tấm Wolffia
globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens”.
1.2. Mục ñích và yêu cầu của ñề tài
1.2.1. Mục ñích
- Xây dựng thành công quy trình chuyển gen kháng nguyên Ha1 cảu
virus vào bèo tấm W. globosa nguyên cây thông qua vi khuẩn A. tumefaciens.
- Tạo ñược mẫu bèo tấm Wolffia globosa mang gen Ha1.
1.2.2. Yêu cầu
- Tối ưu hoá các yếu tố ảnh hưỏng ñến quá trình biến nạp gen, bao
gồm: Chủng vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens thích hợp cho biến nạp gen,
mật ñộ vi khuẩn thích hợp ñể biến nạp, thời gian biến nạp,…
- Sử dụng các loại kháng sinh như: Geneticin, Paromomycin ñể chọn
lọc cánh bèo chuyển gen và nhân dòng.
- Kiểm tra sự có mặt của gen Ha1 trong hệ gen của bèo tấm Wolffia
globosa bằng phản ứng PCR.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………3
2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Giới thiệu chung về bèo tấm Wolffia globosa
2.1.1. Nguồn gốc và vị trí phân bố
Wolffia globosa ñược tìm thấy ở các vùng thung lũng có khí hậu nóng
thuộc trung tâm và miền nam California, ở vùng bùn lầy của các kênh mương
dọc miền tây Nevada, và cả những cánh ñồng lúa ở trung tâm Valley. Ngoài
California người ta còn tìm thấy Wolffia globosa ở những vùng khác của Mỹ
như miền nam Florida. Wolffia globosa còn phân bố rộng khắp các vùng nhiệt

bèo mẹ. Khi các cánh bèo con hình thành, bản thân chúng ñã mang sẵn các thế
hệ cánh bèo kế tiếp ñang ñược hình thành ở vùng mô phân sinh của chúng. Khi
gặp ñiều kiện bất lợi như: thiếu chất dinh dưỡng, nhiệt ñộ quá cao hay quá
thấp,… bèo tấm có khả năng tạo chồi ngủ gọi là “turion”. Các chồi ngủ này
lắng xuống ñáy bùn ao hồ và nảy mầm thành những cây bèo mới khi gặp ñiều
kiện thuận lợi. ðôi khi, bèo tấm Wolffia globosa cũng sinh sản hữu tính thông
qua sự ra hoa và kết hạt tương tự như các loại thực vật hạt kín khác [23], [24].
2.1.4. Những ưu ñiểm của bèo tấm W. globosa
W.globosa là cây một lá mầm thuộc họ Lemnaceae [23] nên nó mang
ñầy ñủ những ñặc ñiểm chung của họ Bèo tấm:
- Có khả năng nhân ñôi trong vòng 24 – 72 giờ tùy thuộc vào ñiều kiện
môi trường, là một trong số những loài có tốc ñộ nhân sinh khối lớn nhất
trong giới thực vật [22], [23].

- Có bộ máy sản xuất protein mạnh, khoảng 15% protein tính trên trọng
lượng chất khô (Landolt, 1986). Protein của bèo tấm W. globosa còn chứa hầu
hết các axít amin không thay thế và rất nhiều loại vitamin khác như A, B1,
B2, E,.... [22], [24].
- Rất dễ nuôi trồng; chỉ cần nước, ánh sáng, CO
2
và ñặc biệt không phụ
thuộc vào thời vụ (Landolt và Kandeler, 1987) [22], [23].
- Sinh sản vô tính là chủ yếu nên hạn chế ñược sự trao ñổi gen giữa các
loài gần gũi về di truyền [24]
,
ñiều này ñảm bảo tốt ñiều kiện về an toàn sinh
học cho cây biến ñổi gen.
- Cải tạo môi trường nước [10], [22], [41].
2.2. Cơ sở khoa học của chuyển gen ở thực vật
Chuyển gen hữu ích vào cây trồng là một bước tiến nhảy vọt trong

tế bào trần làm cho DNA bên ngoài có thể thâm nhập vào bộ gen của tế bào.
Người ta chuẩn bị một huyền phù tế bào trần với các plasmid tái tổ hợp mang
gen mong muốn và gen chọn lọc. Dùng thiết bị ñiện xung tạo ñiện thế cao 200
– 600 V/cm trong khoảng thời gian 4 – 5 phần nghìn giây. Kết quả sẽ làm cho
màng tế bào trần xuất hiện những lỗ thủng tạm thời giúp cho DNA ngoại lai
có thể xâm nhập. Quá trình ñược thực hiện trong các cuvet chuyên dụng hoặc
các “buồng xung ñiện” có các tấm cực bằng kim loại ñặt cách nhau 1 – 4 mm.
Sau quá trình ñiện xung ñem tế bào trần nuôi trong các môi trường thích hợp
hoặc môi trường chọn lọc ñể tách các tế bào trần ñă nhận ñược DNA. Nuôi
cấy tái sinh và tiếp tục chọn lọc [2].
Kỹ thuật chuyển gen nhờ silicon carbide
Silicon carbide là những vật liệu dạng sợi do hãng Arco Metals sản
xuất. Sợi silicon carbide có ñường kính rất nhỏ khoảng 0,6 micromet và dài
khoảng 10-80 micromet. Khi lắc một huyền phù tế bào ñơn và plasmid tái tổ
hợp mang gen mong muốn, gen chọn lọc với silicon carbide trên máy lắc
vortex khoảng 5 giây, các tế bào sẽ bị thủng và DNA ngoại lai có thể xâm
nhập. Nuôi cấy tế bào, tái sinh thành mô sẹo và cây, chọn lọc ñể tách ra
những cây ñã chuyển gen.
Thường huyền phù tế bào ñơn thu hoạch vào ngày thứ 5 hoặc thứ 6 sau
khi cấy chuyển là giai ñoạn tốt nhất ñể thực hiện quy trình chuyển gen [2].
Phương pháp chuyển gen trực tiếp thông qua ống phấn
Phương pháp chuyển gen này ñược gọi là phương pháp chuyển gen
không qua nuôi cấy mô. Theo phương pháp này thì DNA chuyển vào có thể
theo ñường ống phấn chui vào bầu nhuỵ cái và chuyển gen ngay sau khi hạt
phấn mọc qua vòi nhuỵ và bắt ñầu ñưa tinh tử vào thụ tinh. Theo nghiên cứu
thì chuyển gen qua bao phấn tốt nhất ngay sau khi quá trình thụ tinh xảy ra ở
noãn nhưng tế bào sinh dục cái chưa phân chia. Như vậy sự chuyển gen chỉ
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………8
xảy ra ñối với một tế bào sinh sản cái duy nhất và khi tái sinh cây sẽ không
xuất hiện thể khảm [2].

thể mua ñược, giá thành vật tư ñắt [2].
2.2.2. Phương pháp chuyển gen gián tiếp
Phương pháp chuyển gen gián tiếp, ở ñây gen ñược chuyển vào tế bào
thực vật qua một sinh vật trung gian, thường là vi khuẩn, virus.
Chuyển gen nhờ virus
Virus ñược sử dụng làm vector chuyển gen cho cây trồng do rất dễ
thâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật. Mặt khác trong cấu tạo của virus
cũng có mặt axit nuclêic làm cơ sở cho việc gắn các gen cần chuyển vào. Tuy
nhiên ñể làm vector chuyển gen thì virus cần có các tiêu chuẩn sau:
- Bộ genome của virus có cấu tạo DNA chứ không phải RNA
- Có khả năng di chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các
plasmodest (lỗ thành tế bào)
- Có khả năng tải ñược các ñoạn DNA gắn vào
- Có phổ ký chủ rộng
- Không gây hại hoặc gây hại không ñáng kể
Tuy nhiên hiện nay, việc chuyển gen nhờ virus rất ít ñược sử dụng, do
virus về nguyên tắc không chuyền qua hạt do vậy việc nhân giống các cây
chuyển gen nhờ virus phải tiến hành bằng phương pháp vô tính. ðiều này
không phải thực hiện ñược với tất cả các loại cây. ðây chính là một nhược
ñiểm lớn của phương pháp chuyển gen bằng virus [2].
Phương pháp chuyển gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
DNA ñược chuyển vào tế bào thực vật nhờ cơ chế truyền ñặc trưng của
loài vi khuẩn Agrobacterium làm môi giới.
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………10
Agrobacterium là các vi khuẩn ñất nhuộm gram (-). Chúng gây ra các triệu
chứng bệnh ở cây khi xâm nhiễm qua vết thương.
Trong chi Agrobacterium có các loài chính sau:
A. tumefaciens: gây bệnh u thân.
A. rhisogenes: gây bệnh tạo rễ.
A. rubi: gây u ở các loại dâu ñất, mâm xôi.

* Các yếu tố ảnh hưởng lên quá trình chuyển gen thông qua Agrobacterium.
Phổ vật chủ của Agrobacterium ñược xác ñịnh là rất rộng, song hiệu quả biến
nạp gen lại không giống nhau ở các ñối tượng thực vật. Nhìn chung ở cây hai lá mầm
tần suất chuyển nạp gen cao hơn nhiều so với cây một lá mầm. Ngoài ra hiệu quả
biến nạp gen còn phụ thuộc nhiều vào kiểu gen của thực vật.
Hiệu quả biến nạp gen thông qua Agrobacterium ở thực vật phụ thuộc
vào một số yếu tố chính như dạng mô lây nhiễm, mật ñộ vi khuẩn và thời gian
lây nhiễm, tiền xử lý mô thực vật, chủng vi khuẩn Agrobacterium và cấu trúc
vector biến nạp.
Khi phân tích biểu hiện gen gus ở mô lúa, Hiei và cộng sự (1994) ñã
phát hiện mô sẹo tạo thành từ tế bào sctellum là vật liệu phù hợp nhất ñể
chuyển gen thông qua Agrobacterium so với các loại mô khác (mô lá, ñỉnh
sinh trưởng, ñầu rễ).
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………12
Thời gian nuôi cộng sinh cũng ảnh hưởng tới tần suất biến nạp, ở lúa
khoảng thời gian nuôi cộng sinh vào khoảng 2-3 ngày là lý tưởng nhất.
Sardana cho thấy rằng mật ñộ vi khuẩn cao 10
10
tế bào/ml ñã làm tăng hiệu
quả biến nạp gen cao hơn so với mật ñộ thấp 10
6
tế bào/ ml ở cây thuốc lá và
Arabidopsis [26], [33]. Tuy nhiên mật ñộ vi khuẩn lây nhiễm không ảnh
hưởng ñến hiệu quả biến nạp gen ở Petunia.
Hiệu quả biến nạp gen phụ thuộc vào khả năng chuyển T-DNA của các
gen vir. Tăng khả năng biểu hiện của các gen vir ñạt ñược bằng cách gây tiền
cảm ứng vi khuẩn với hợp chất phenol như Acetosyringone (AS). Tiền xử lý
trong môi trường chứa AS ñã làm tăng tần suất biến nạp gen ở các cây thuốc
lá. Bổ xung AS vào môi trường nuôi cộng sinh cũng ảnh hưởng tới hiệu quả
chuyển gen thông qua Agrobacterium [28]. Ngoài ra ñộ pH của môi trường

nhau nhưng trong cùng một chủng A. tumefaciens (hình 2.3).

Hình 2.4: Sơ ñồ cấu trúc hệ vector nhị thể
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………14
Có hai loại vectơ ñược sử dụng trong hệ thống vectơ nhị thể:
(1) Vectơ chuyển gen: Là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và
có phổ vật chủ rộng với ñoạn T-DNA ñược cắt bỏ hết các gen không cần thiết
ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải, gắn thêm một số thành phần tạo ra
cấu trúc mới gồm: i) các ñơn vị sao chép ñể DNA plasmid có thể vừa tự nhân
trong cả E. coli và Agrobacterium; ii) các gen chọn lọc, gen ñánh dấu và iii)
vùng có chứa nhiều ñiểm cắt của các enzym giới hạn (vùng tạo dòng ña năng)
nằm ở giữa hai trình tự biên trái và biên phải ñể chèn gen mong muốn.
(2) Vector bổ trợ: nằm trong A. tumefaciens, với toàn bộ vùng vir ñược
giữ lại nhưng loại bỏ hoàn toàn vùng T-DNA và RB, LB. Plasmid này ñược
cải tiến loại bỏ gen kích thích tế bào thực vật phát triển thành khối u, nhưng
vẫn duy trì khả năng thâm nhập vào tế bào thực vật.
Hai loại vector này cùng ñược ñưa vào Agrobacterium, khi các gen trên
vector bổ trợ hoạt ñộng thì các sản phẩm của nó sẽ tác ñộng tới ñoạn T-DNA
trên vector chuyển gen dẫn ñến sự chuyển ñoạn T-DNA sang tế bào thực vật.
• Hệ vectơ liên hợp
Vectơ liên hợp ñược xây dựng trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương
ñồng nằm trên plasmid vi khuẩn (như vectơ của E. coli) với vùng T-DNA trên
Ti-plasmid của A. tumefaciens. Trong ñó, người ta giữ lại vùng vir, loại bỏ
vùng mã hoá chức năng gây khối u và thay thế bằng những ñoạn DNA mới
trong Ti-plasmid (hình 2.4).
Có 3 loại vectơ tham gia vào hệ thống vectơ liên hợp:
(i) Ti-plasmid: các gen gây khối u ñã bị vô hiệu hoá bằng cách thay vào
ñó gen kháng kanamycin của vi khuẩn;
(ii) Vectơ trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thước nhỏ và
ñược sử dụng ñể bổ trợ chức năng không ưu việt của Ti-plasmid (kích thước

rất khả quan (Rowlandson & Tackaberry, 2003) [33].
Một loạt các protein gây miễn dịch của virus, vi khuẩn và một số loài
thực vật ñã ñược nghiên cứu. Kết quả thử nghiệm ñã chứng minh vaccine tái
tổ hợp chống viêm gan B sản xuất bằng thực vật ñã gây miễn dịch hệ thống
màng nhầy ñộng vật (Mason et al., 1996) [28] và gây miễn dịch ở những
người tình nguyện (Tacket et al., 2000) [36].
Nhiều loại vaccine thú y cũng ñược quan tâm nghiên cứu như: Gen
VP2 tổng hợp vỏ của virus Gumboro ñã ñược chuyển vào Arabidopsis
thailiana. Dịch chiết của thực vật ñược tách và sử dụng ñể gây miễn dịch cho
gà qua ñường miệng. Kết quả cho thấy vaccine thương mại gây miễn dịch cho
78%, trong khi dịch triết gây miễn dịch cho 80% số gà ñược uống. Khi kết
hợp 2 loại vaccine này, cho gà uống vaccine thương mại ở 1 tuần tuổi và dịch
triết tách từ thực vật ở tuần thứ 4 cho tỷ lệ miễn dịch ñạt 90% (Wu et al.,
2004) [39]. Cỏ Linh lăng ñược chuyển gen tổng hợp polyprotein P1 và
protease 3C của virus gây bệnh lở mồng long móng ñã gây miễn dịch cho
chuột (Marria et al., 2005) [26].

Hiện nay, người ta ñã thành công trong việc tạo ra kháng nguyên chống
bệnh ở một số loại thực vật như: Glycoprotein B (cytomegalovirus người) ở
Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ……………17
thuốc lá, lúa (Sardana et al., 2003) [33]; Tacket et al., 2000) [36]; NVCP
(virus Norwalk) ở khoai tây và thuốc lá (Marson et al., 1996) [28];
hemaglutinin virus sởi ở cà rốt (Bouch et al., 2003) [9]; HbsAg (virus viêm
gan B) ở khoai tây, rau riếp, chuối (Kapusta et al., 1999; Kong et al., 2001)
[19]; ñộc tố gây bệnh tả ở cà chua (Jani et al., 2002) [18]; protein F (virus hợp
bào hô hấp) ở cà chua (Sandhu et al., 2000) [32]; LT-B (E.coli) ở khoai tây,
ngô (Chikwamba et al.,2002; Haq et al., 1995) [12]; protein S (virus gây bệnh
ñường ruột) ở thuốc lá (Tuboly et al., 2000) [37]; protein L1 (papilloma virus
người) ở khoai tây (Warzecha et al., 2003) [38]; kháng nguyên chống bệnh
than ở thuốc lá (Aziz et al., 2002) [7]; protein vở puumala ở khoai tây và