Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
LỜI CẢM ƠN
Trước hết, tôi xin gửi tới bố mẹ, anh chị cùng bạn bè, những người mà đã
luôn quan tâm, ủng hộ và là chỗ dựa cho tôi trong suốt thời gian tôi làm khóa luận
này, cũng như trong cuộc sống.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Bùi Phương Thuận - chủ nhiệm
bộ môn Hóa sinh - trường ĐH Khoa học tự nhiên Hà Nội, đã giúp đỡ hết sức tận tình
để tôi hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối tới TS. Nguyễn Văn Đồng đã tận tình
giúp đỡ, hướng dẫn trong quá trình thực hiện và hoàn thành khóa luận.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với sự giúp đỡ to lớn, những ý
kiến đóng góp quý báu, sự hướng dẫn tận tình của Ths. Hà Văn Chiến trong quá
trình tôi thực hiện và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn tới tập thể cán bộ Phòng thí nghiệm trọng điểm Công
nghệ tế bào thực vật - Viện Di truyền nông nghiệp về sự giúp đỡ nhiệt tình trong suốt
thời gian tôi thực hiện khóa luận.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trường ĐH Khoa học Tự nhiên -
ĐH Quốc Gia Hà Nội đã giúp đỡ nhiệt tình và đã tạo mọi điều kiện thuận lợi trong
thời gian học tập cũng như khi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đối với những giúp đỡ quý báu đó.
Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2010
Bùi Thúy Hiền
Bùi Thúy Hiền
- i -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
KÝ HIỆU VIẾT TẮT
AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)
BAP : 6-benzylaminopurin
CaMV : Cailiflower Mosaic Virus
Car : Carbenicillin
Bảng 3. Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu Châu Á (nghìn tấn) 10
Bảng 4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam những năm gần đây
.....................................................................................................................................10
Bảng 5. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và
các gen chỉ thị sàng lọc (screenable marker genes)...............................................16
Bảng 6. Nồng độ và thời gian khử trùng của Ethanol và NaClO............38
Bảng 7. Kết quả thí nghiệm thử nồng độ và thời gian khử trùng............38
Bảng 8. Kết quả biểu hiện của ĐT26 đối với các chủng vi khuẩn...........40
Bảng 9. Kết quả thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang
của dung dịch ...........................................................................................................41
Bảng 10. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp......43
Bảng 11. Hiệu suất biến nạp vào đậu tương theo thời gian biến nạp......46
Bảng 12. môi trường MS (PH=5,6-5,8).......................................................59
Bảng 13. Môi trường LB (PH = 7)...............................................................59
Bảng 14. Môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu..............................................60
Bùi Thúy Hiền
- iv -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN .................................................................................................. i
KÝ HIỆU VIẾT TẮT ..................................................................................... ii
DANH MỤC HÌNH VẼ ................................................................................. iii
DANH MỤC BẢNG ....................................................................................... iv
MỤC LỤC ........................................................................................................ v
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 4
1.1. Giới thiệu chung về đậu tương ...................................................................... 4
1.1.1. Nguồn gốc ..................................................................................... 4
1.1.2. Phân loại ........................................................................................ 4
2.1.2. Hóa chất và môi trường ................................................................ 24
2.1.3. Vi khuẩn ...................................................................................... 24
2.1.4. Đối tượng nghiên cứu .................................................................. 24
2.2. Phương pháp nghiên cứu .............................................................................. 24
2.2.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng ......................................................... 24
♦♦ Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian
khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu. ........................................................................ 24
2.2.2. Chuyển gen gus vào đậu tương .................................................. 25
♦♦ Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất với
ĐT26 ............................................................................................................................ 25
♦♦ Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng của mật độ quang của dung dịch
khuẩn (OD) đến khả năng biểu hiện gus của ĐT26. .................................................. 27
♦♦ Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian biến nạp đến hiệu
quả chuyển gen gus vào ĐT26. ................................................................................... 29
♦♦ Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng của việc gây tổn thương nốt lá
mầm đến sự biểu hiện của gen gus trên ĐT26. ......................................................... 30
♦♦ Thí nghiệm 6: Xây dựng quy trình tái sinh cây chuyển gen ..................... 32
♦♦ Thí nghiệm 7: Phân tích cây chuyển gen T0 ............................................. 33
2.3. Các chỉ tiêu đánh giá ..................................................................................... 35
Chương III - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 37
3.1. Tạo nguồn vật liệu vô trùng ......................................................................... 37
Bùi Thúy Hiền
- vi -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaClO và thời gian
khử trùng ở giai đoạn khử trùng mẫu ................................................................ 37
3.2. Chuyển gen gus vào đậu tương .................................................................... 39
3.2.1. Thí nghiệm 2: Nghiên cứu xác định chủng vi khuẩn thích hợp nhất
với ĐT26 .......................................................................................................... 39
Tuy nhiên, với tình hình khí hậu trên trái đất đang biến đổi không ngừng, nhiệt
độ trái đất càng ngày càng tăng cao, từ đó dẫn đến các thiên tai (lũ lụt, hạn hán, bệnh
dịch,…) gây ảnh hưởng không nhỏ đến sự sinh trưởng, phát triển của các loại cây
trồng nói chung và cây đậu tương nói riêng. Vì thế để tăng năng suất và chất lượng
thì ngoài việc thực hiện chăm sóc, gieo trồng tốt còn phải tập trung nghiên cứu nhằm
cải thiện các loại giống để chúng có thể cho năng suất cao, chống chịu được các điều
kiện ngoại cảnh bất lợi tốt nhờ những ứng dụng to lớn của công nghệ sinh học hiện
đại.
Trong hơn một thập niên vừa qua, công nghệ sinh học nói chung và cây trồng
biến đổi gen nói riêng đã có những bước phát triển vượt bậc. Từ khoảng 1 triệu ha
đầu tiên năm 1996 trồng tại Châu Mỹ, đến tháng 12 năm 2009, toàn thế giới đã có
134 triệu ha cây trồng biến đổi gen [20], tăng 80 lần so với năm 1996 và tăng 9 triệu
ha so với năm 2008 (125 triệu ha). Trong đó đậu tương biến đổi gen là loại cây biến
đổi gen nổi bật nhất, có tới 69,7 triệu ha chiếm 52% trong tổng diện tích cây biến đổi
gen toàn thế giới và chiếm tới 75% trong tổng diện tích 90 triệu ha trồng đậu tương
trên thế giới [14].
Các đánh giá mới nhất về tác động của cây chuyển gen cho thấy trong khoảng
thời gian từ năm 1996 đến năm 2008, lợi ích kinh tế trị giá 51,9 tỷ USD mà cây biến
đổi gen mang lại được tạo ra từ 2 nguồn: thứ nhất là giảm chi phí sản xuất (50%) và
tăng năng suất thu hoạch bền vững (50%). Số sản lượng tăng thêm này nếu không sử
Bùi Thúy Hiền
- 1 -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
dụng các giống cây chuyển gen thì sẽ cần thêm 62,6 triệu ha để tạo ra chúng. Vì thế
công nghệ sinh học giúp tiết kiệm diện tích trồng trọt, giảm được lượng thuốc trừ sâu
ở mức 365 triệu kg, ứng với 8,4% tổng lượng thuốc trừ sâu sửu dụng trong nông
nghiệp. Chỉ tính riêng trong năm 2008, lượng khí CO2 được cây biến đổi gen hấp thụ
là 14,4 tỷ kg, tương đương với lượng khí thải mà 7 triệu chiếc oto thải ra.
Nước ta là một nước nông nghiệp với đặc điểm nổi bật là mật độ dân số cao
- 2 -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
* Nghiên cứu quy trình biến nạp hiệu quả nhất, trong đó có:
• Xác định chủng vi khuẩn có khả năng chuyển gen hiệu quả nhất.
• Xác định mật độ quang (OD) của dung dịch khuẩn thích hợp nhất
• Xác định thời gian biến nạp thích hợp nhất
• Nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp gây tổn thương
nốt lá mầm đến hiệu quả biến nạp.
• Xây dựng quy trình tái sinh cây đậu tương chuyển gen
• Phân tích cây chuyển gen T0
Bùi Thúy Hiền
- 3 -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
Chương I - TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu chung về đậu tương
1.1.1. Nguồn gốc
Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và
trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh.
Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương
có nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tương được thuần
hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và được đưa vào trồng trọt và
khảo sát có thể trong triều đại Shang năm 1700-1100 trước B.Cds.
1.1.2. Phân loại
Đậu tương hay đỗ tương, đậu nành có tên khoa học là Glycine max(L.) Merr
theo khóa phân loại của Hymowitz, T. and C.A. Newell [19] căn cứ vào đặc điểm
hình thái, sự phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể, nó thuộc:
Bộ đậu : Fabales
Họ đậu : Fabaceae
phẩm từ đậu tương. Các sản phẩm được tiêu thụ trên thị trường gồm bột đậu nành
đóng gói, đậu phụ, sữa đậu nành, sữa chua đậu nành,…
- Giá trị về mặt công nghiệp
Đậu tương là nguyên liệu của nhiều ngành công nghiệp khác nhau như: chế
biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng, chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu
bôi trơn trong ngành hàng không, nhưng chủ yếu đậu tương dùng để ép dầu. Hiện nay
trên thế giới đậu tương là cây đứng đầu về cung cấp nguyên liệu cho ép dầu, dầu đậu
tương chiếm 50% tổng lượng dầu thực vật.
- Giá trị về mặt nông nghiệp
♦ Làm thức ăn cho gia súc: Đậu tương là nguồn thức ăn tốt cho gia súc 1kg
hạt đậu tương tương đương với 1,38 đơn vị thức ăn chăn nuôi. Toàn cây đậu tương
(thân, lá, rễ, quả, hạt) có hàm lượng đạm khá cao cho nên các sản phẩm phụ như thân
lá tươi có thể làm thức ăn cho gia súc rất tốt, hoặc nghiền khô làm thức ăn tổng hợp
của gia súc. Sản phẩm phụ công nghiệp như khô dầu có thành phần dinh dưỡng khá
cao: N 6,2% ; P
2
O
5
0,7% ; K
2
O 2,4% . Vì thế làm thức ăn cho gia súc rất tốt [2].
♦ Cải tạo đất: Đậu tương là cây luân canh cải tạo đất tốt. Trong hệ thống luân
canh, nếu bố trí cây đậu tương vào cơ cấu cây trồng hợp lý sẽ có tác dụng tốt đối với
cây trồng sau, góp phần tăng năng suất cả hệ thống cây trồng mà giảm chi phí cho
việc bón N. Thân lá đậu tương dùng bón ruộng thay thay phân hữu cơ rất tốt bởi hàm
lượng N trong thân chiếm 0,05% trong lá chiếm 0,19% [2].
Bùi Thúy Hiền
- 5 -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
1.1.5.1. Tính chịu lạnh
Bùi Thúy Hiền
- 6 -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
Nhiệt độ dưới 15
0
C có ảnh hưởng xấu đến nảy mầm của hạt và sự hút nước.
Nhiệt độ dưới 13-15
0
C, giảm ra hoa, đậu quả và ảnh hưởng tới quang hợp và toàn bộ
máy quang hợp.
Tổn thương do lạnh thường gây hại màng tế bào,do màng tế bào không có khả
năng giữ cấu trúc của nó ở nhiệt độ thấp. Các mô, chẳng hạn như hạt phấn đang lớn
dễ nhạy cảm với nhiệt độ thấp hơn các mô khác và dẫn đến sự bất dục ở cây đậu
tương [2].
1.1.5.2. Tính chịu hạn
Tránh hạn là cơ chế một số thời kỳ sinh trưởng phát triển nhạy cảm của cây
đậu tương tránh và thoát các ảnh hưởng trực tiếp của khô hạn. Việc tránh hạn đối với
những vùng có khô hạn dài ngày thì rất khó thực hiện. Ta chỉ có thể chọn thời vụ mà
khô hạn xẩy ra ít nhất để hạn chế ảnh hưởng của nó tới sinh trưởng và năng suất cây.
Hướng chọn giống có tính giảm sự mất nước cho thấy có nhiều triển vọng. Nên chọn
những cây có bộ rễ sâu phân nhánh nhiều, do đó có thể hút nước từ tầng đất sâu và
rộng.
Chịu hạn hoặc do giảm sự mất nước, hoặc cây chịu được sự mất nước. Sự mất
nước qua khí khổng phụ thuộc chủ yếu vào độ mở của khí khổng và sau đó là hướng
lá và các yếu tố khác. Khi hạn xảy ra, lỗ khí khổng lá đóng ngay lại, dẫn đến giảm sự
bốc hơi nước và quang hợp, nhưng sự giảm bốc hơi nước mạnh hơn. Giữa các giống
có sự khác nhau về lớp phấn và lông trên lá. Lớp phấn trên lá có tác dụng giảm sự
bốc hơi [2].
khả năng chống chịu của cây như: rễ sâu, phân cành nhiều, chín sớm, điều chỉnh khí
khổng tốt, chịu mất nước, hoặc sinh trưởng tốt sau khi bị hạn [2].
1.1.6. Đặc tính sinh học của giống đậu tương ĐT26
- Nguồn gốc
Tác giả: Trần Đình Long, Trần Thị Trường, Nguyễn Thị Loan, Nguyễn Thị
Chinh, Nguyễn Văn Thắng, Trần Thanh Bình và CTV. Trung tâm Nghiên cứu và
Phát triển Đậu đỗ, Viện Cây lương thực và Cây thực phẩm, Viện Khoa học Nông
nghiệp Việt Nam.
Giống đậu tương ĐT26 được chọn từ tổ hợp lai ĐT2000 x ĐT12. Được công
nhận cho sản xuất thử theo Quyết định số 111/QĐ-TT-CCN ngày 3 tháng 6 năm
2008.
- Những đặc điểm chính: Thời gian sinh trường trung bình từ 90-95 ngày.
Chiều cao cây 45-60 cm, hoa màu trắng, hạt vàng, rốn nâu đậm, quả chính có màu
nâu, phần cành khá từ 2-3 cành/cây, có 30-35 quả chắc/cây, tỷ lệ quả 3 hạt 20-40%.
Khối lượng 100 hạt 18-19g. Năng suất 21-29 tạ/ha, tùy thuộc vào mùa vụ và điều
kiện thâm canh. Giống thích hợp trong vụ xuân và vụ đông. Giống ĐT26 nhiễm nhẹ
bệnh gỉ sắt, chống đổ tốt.
Bùi Thúy Hiền
- 8 -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
Với những đặc tính này, ĐT26 rất phù hợp với điều kiện sinh thái của Việt
Nam, nên chúng tôi đã chọn ĐT26 làm đối tượng để chuyển gen.
1.2. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới và Việt Nam
1.2.1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới
Đậu tương là cây trồng lấy hạt, cây có dầu quan trọng bậc nhất trên thế giới,
đứng hàng thứ 4 sau cây lúa mì, lúa nước và ngô. Do có khả năng thích ứng rộng nên
đậu tương được trồng khắp các châu lục, nhưng tập trung nhiều nhất ở Châu Mỹ trên
70%, tiếp đến là Châu Á.
Bảng 1. Tình hình sản xuất đậu tương trên thế giới những năm gần đây
(triệu tấn)
Mỹ 30,2 26,67 80,53 28,84 28,72 82,83
Brazin 21,27 28,17 59,92 22,89 21,92 50,17
Argentina 16,38 28,22 46,23 14,03 27,28 38,27
Trung
Quốc
9,13 17,02 15,54 9,500 17,79 16,90
(Nguồn: Bộ Nông Nghiệp Mỹ (USDA), 2009)
Bùi Thúy Hiền
- 9 -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
Hiện nay, 4 nước sản xuất đậu tương lớn nhất thế giới là Mỹ, Brasil,
Argentine và Trung Quốc, các nước này chiếm khoảng 90-95% tổng sản lượng đậu
tương của thế giới. Trong đó Mỹ là nước sản xuất, tiêu thụ và xuất khẩu đậu tương
lớn nhất (xem bảng 2).
Bảng 3. Các nước nhập khẩu đậu tương hàng đầu Châu Á (nghìn tấn)
Tên nước 2008-2009 2009-2010
Indonesia 2339 2600
Việt Nam 2300 2500
Thái Lan 2160 2208
Hàn Quốc 1813 1850
Nhật Bản 1812 1700
(Nguồn: Bộ Nông Nghiệp Mỹ (USDA), 2009)
1.2.2. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam
Việt Nam có lịch sử trồng đậu tương lâu đời, một số tài liệu cho rằng cây
đậu tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời vua Hùng và xác định rằng nhân dân
ta trồng cây đậu tương trước cây đậu xanh và cây đậu [2].
Bảng 4. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam những năm gần đây
Năm
như sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi tiêm,
chuyển gen thông qua con đường ống phấn,… Tuy nhiên, phương pháp chuyển gen
gián tiếp nhờ vi khuẩn A.tumefaciens là phương pháp được sử dụng phổ biến hiện
nay. Phương pháp này được sử dụng trong khóa luận này để chuyển gen vào đậu
tương.
1.3.1. Giới thiệu chung về vi khuẩn A. tumefaciens
A.tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình chóp ở
các vị trí tổn thương của thực vật hai lá mầm. Chỉ rất ít thực vật một lá mầm thuộc họ
Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp. Sự sinh trưởng khối u có
thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể được sinh trưởng vô trùng
bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ xung auxin và cytokinie ngoại
sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự sinh trưởng của mô thực vật in vitro.
Mô khối u tổng hợp amino acid và các dẫn xuất của đường được biết chung là opine.
Loại opine tổng hợp trong khối u (ví dụ như nopaline, octopine, agrocinopine,
mannopine và agropine) phụ thuộc vào dòng Agrobacterium khởi đầu sự hình thành
khối u. Octopine và nopaline là hai loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng
phát hiện nhất trong mô khối u hình chóp. Do đó nhiều dòng A. tumefaciens phổ biến
được thiết kế theo kiểu octopine hoặc nopaline.
A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một
đoạn ADN của nó vào tế bào thực vật. Khi ADN vi khuẩn được hợp nhất với nhiễm
sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của tế bào một cách có hiệu quả
và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sổi của quần thể vi khuẩn..
Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như là một vector chuyển gen các
nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và thay
Bùi Thúy Hiền
- 11 -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải và bờ trái
của T-ADN và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng bờ của T-ADN.
ADN trong Ti-plasmid của Agrobacterium. Kết quả này chứng tỏ không có sự sắp
xếp lại vị trí của T-ADN trong lúc khối u được tạo thành. Một hoặc nhiều bản sao
của T-ADN có thể có mặt ở các đoạn lặp nối tiếp. Chúng cũng có thể tách ra và liên
kết với các vùng khác nhau của ADN thực vật. Vị trí hợp nhất của T-ADN vào ADN
thực vật là hoàn toàn ngẫu nhiên.
1.3.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN
T-ADN là một đoạn ADN có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa cho
sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong Ti-plasmid, vị trí
của T-ADN được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left
Border). Ngoài T-ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN mã hóa cho việc tái
sinh plasmid, cho khả năng lấy nhiễm và tiếp hợp (vùng vir), cho việc tiêu hóa opine.
Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genom thực vật ở dạng một
đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-ADN là một đoạn
gen liên tục dài 13 kb. T-ADN mang rất nhiều gen như: (1) Các gen mã hoá những
enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen gây khối u như tms1,
tms2, tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và
cytokinine.
Trong các vùng ADN của Ti-plasmid, ngoài T-ADN được nghiên cứu nhiều
hơn cả là vùng ADN phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Sản phẩm
hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích của các hợp chất
phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu như virE
2
, virB, virD,
virD
2
,… Các protein này nhận biết các vết thương ở các cây chủ thích hợp (hầu hết là
cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-ADN, bao bọc che chở các đoạn
ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen của cây chủ một cách an toàn.
1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi khuẩn
vị tái bản (replicon) như các gen vir hoặc trên một plasmid phân tán. Trước đây, loại
vector thường được đề cập đến là vector liên hợp (co-intergrative vector), tuy nhiên
gần đây vector nhị thể (binary vector) là phổ biến hơn.
♦ Cis vector
Bùi Thúy Hiền
- 14 -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
Đây là các vector có nguồn gốc từ Ti-plasmid kiểu dại mà gen onc trên T-
ADN đã được loại bỏ và trong một số trường hợp được thay thế bằng một đoạn ADN
đặc hiệu có vùng tương đồng với một vector tạo dòng nhỏ mà chỉ có thể tái bản ở
E.coli. Chiến lược vector này phụ thuộc vào sự liên hợp trong A.tumefaciens giữa các
vùng tương đồng trên Ti-plasmid đã sửa đổi (hỗ trợ mang gen vir) và một vector tạo
dòng nhỏ ở E.coli (vector trung gian) mang gen marker chọn lọc sẽ hoạt động chức
năng trong các tế bào thực vật và các trình tự duy nhất cho việc xen DNA ngoại lai
vào.
Vector trung gian mang trình tự ADN ngoại lai thường được đưa vào
A.tumefaciens bằng sự tiếp hợp với ADN ngoại lai đã ổn định trong T-ADN là kết
quả của tái tổ hợp tương đồng.
♦ Vector nhị thể
Vector trans hoặc vector nhị thể được dựa trên các plasmid có thể tái bản ở cả
E.coli và Agrobacterium, và các plasmid này có chứa các trình tự biên của T-ADN.
Các vector này có thể được thiết kế sao cho các trình tự biên cạnh MCS
(Multicloning site- trình tự tạo dòng) cho phép xen ADN ngoại lai vào và các marker
cho phép chọn lọc trực tiếp các tế bào thực vật đã được biến nạp.
Plasmid có thể được thao tác ở trong E.coli và được chuyển vào qua sự tiếp
hợp với các dòng Agrobacterium mang plasmid có chứa vùng vir nhưng thiếu T-
ADN và các trình tự lặp 25 bp. Các plasmid như thế thường là các thể đột biến mất
đoạn đơn giản của Ti-plasmid octopine kiểu dại hoặc kiểu nopaline. Việc chuyển
ADN ngoại lai trên vector tạo dòng tế bào thực vật có thể được thực hiện do hoạt
Kí hiệu gen Enzyme tương ứng Chất dùng để phát hiện
gus A β-glucuronidase X-gluc
lacZ β-galactosidase X-Gal
luc Luciferase đom đóm Lumis Phos
lux Luciferase khuẩn Lumi Phos
cat Chloramphenicol acetyltransferase Chloramphenicol đánh dấu
nos Nopaline synthase nopaline
Gen bar: Gen bar là tên gọi của gen mã hóa cho enzyme phosphinothricin
acetyltransferase (PAT), có tác dụng làm mất độc tính của phosphinothricin (PPT), là
hoạt chất chính của thuốc trừ cỏ như Bialaphos và Basta. Gen bar được tạo dòng đầu
tiên từ một dòng vi khuẩn Streptomyces hygroscopicus. Phương pháp đơn giản nhất
để kiểm tra sự có mặt của gen bar là phương pháp trực tiếp. Mô, tế bào hoặc cây
chuyển gen được đặt trên môi trường có các nồng độ phosphinithricin khác nhau
(hoặc thuốc trừ cỏ tương ứng) và so sánh sinh trưởng của mô, tế bào hoặc cây đối
chứng đặt trên cùng môi trường.
Bùi Thúy Hiền
- 16 -
K51A Sinh học
Khóa luận tốt nghiệp Hà Nội, 06/2010
Gen gusA: là gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-
glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide, sản phẩm
phân giải có màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết. β-glucuronide thường dùng nhất
trong phản ứng để nhận biết sự tồn tại của gen gus A là X-gluc (5-bromo-4-chloro-3-
indolyl-β-D-glucuronide). Dung dịch X-gluc không màu dưới tác động của enzyme
β-glucuronidase sẽ huyển sang màu xanh chàm đặc trưng.
Gen lacZ: Enzyme β-galctosidase (lacZ) trọng lượng phân tử 116 kD, pH tối
thích 7-7,5 được mã hóa do gen lacZ. Gen lacZ ở E.coli được dùng rất phổ biến trong
công nghệ gen vi sinh và đã có sẵn các hệ thống phương pháp kiểm tra rất nhạy với
thuốc thử X-Gal. Sự tồn tại hoạt động của lacZ trong tế bào thực vật đã được khẳng
định. Vì vậy, trước khi kiểm tra sự có mặt của gen lacZ ngoại lai, cần phải bất hoạt
K51A Sinh học
Copyright: Tài liệu đại học ©