Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
1
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
VIỆN SINH THÁI
VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT
VIỆN DI TRUYỀN NÔNG NGHIỆP
TRẦN THU CÚC “NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN KHÁNG SÂU CRY1B
VÀO ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA
VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens”
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
VÀO ĐẬU TƢƠNG (Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA
VI KHUẨN Agrobacterium tumefaciens” Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: Ts. Nguyễn Văn Đồng
Hà Nội, 2012
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
3
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
Chƣơng 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 7
4
2.3.5. Phƣơng pháp điện di trên gel agarose 39
2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh cây hoàn chỉnh 39
2.3.7. Phƣơng pháp biến nạp gen vào các giống đậu tƣơng 41
2.3.8. Sàng lọc, phân tích cây chuyển gen 42
2.3.9. Phƣơng pháp bố trí, theo dõi và đánh giá thí nghiệm. 43
2.3.9. Các chỉ tiêu đánh giá 44
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 46
3.1. Kết quả biến nạp plasmid pX2 – mpi:Cry1B:nos vào một số chủng vi khuẩn
để biến nạp vào đậu tƣơng 46
3.2. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của một số giống đậu
tƣơng 47
3.1.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương 47
3.1.2. Khả năng kéo dài chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương
nghiên cứu 49
3.3. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho chuyển gen ở đậu tƣơng 49
3.4.Tối ƣu hóa các yếu tố ảnh hƣởng đến hiệu quả biến nạp gen 51
3.4.1.Ảnh hưởng của mật dộ tế bào vi khuẩn lây nhiễm 51
3.4.2. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm 53
3.4.3. Ảnh hưởng của thời gian lây nhiễm 53
3.4.4. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy 54
3.4.5. Ảnh hưởng của nồng độ Acetosyringon (AS) 55
3.4.6. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen 56
2.5. Đánh giá cây chuyển gen 57
2.5.1. Đánh giá hiệu quả biến nạp gen cry1B ở vào giống đậu tƣơng chọn lọc . 57
2.5.2. Đánh giá khả năng phân ly của gen kháng sâu cry1B và gen chọn lọc hpt
(kháng kháng sinh) ở dòng đậu tƣơng chuyển gen 60
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 62
TÀI LIỆU THAM KHẢO 63
với nhiều loài sâu gây hại.
Công nghệ sinh học hiện đại và các cây trồng biến đổi di truyền đang đƣợc ứng
dụng rộng rãi cũng nhƣ có nhiều đóng góp giá trị cho sản xuất nông nghiệp, đặc biệt
trên lĩnh vực tạo giống cây trồng mới. Công nghệ sinh học với những tiến bộ của kỹ
thuật DNA tái tổ hợp và chuyển gen thực vật, các gen đƣợc phân lập từ các sinh vật
khác loài, thực vật, vi sinh vật và động vật đã đƣợc đƣa vào cây trồng. Với khả năng
tuyệt vời này cho phép tạo ra hàng loạt cây trồng mang các gen hữu ích, có những đặc
tính nông học quan trọng nhƣ kháng sâu, kháng thuốc diệt cỏ, chín sớm và các đặc tính
có lợi khác, điều mà các nhà chọn giống truyền thống chƣa làm đƣợc.
Theo những tính toán gần đây, giai đoạn 1996 – 2012 diện tích cây trồng biến đổi
gen đã tăng 87 lần, điều này cho thấy công nghệ về cây trồng biến đổi gen là công
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
6
nghệ đƣợc chấp nhận nhanh nhất trong lịch sử nông nghiệp hiện đại. Từ năm 1996 đến
năm 2009, cây trồng biến đổi gen đã góp phần tạo nên tính bền vững và giảm biến đổi
khí hậu. Điều này đƣợc thấy thông qua sản lƣợng cây trồng ngày càng tăng và trị giá
65 tỷ USD, tiết kiệm 393 triệu thuốc trừ sâu, chỉ tính trong năm 2009 giảm phát thải
18 tỷ kg khí CO
2
, tƣơng đƣơng giảm gần 8 triệu chiếc xe hơi trên đƣờng – tạo một môi
trƣờng trong sạch hơn, bảo tồn đa dạng sinh học bằng cách tiết kiệm 15 triệu ha đất và
hỗ trợ giảm ngèo bằng cách giúp 14,4 triệu hộ nông dân nhỏ, trong số đó có những hộ
nông dân là những ngƣời nghèo nhất trên thế giới.
Cùng với hiện trạng và xu thế phát triển của thế giới, Việt Nam đã triển khai các
nghiên cứu về cây trồng chuyển gen nói chung cũng nhƣ đậu tƣơng chuyển gen nói
riêng, có những kết quả ban đầu đáng ghi nhận [6], [11], [12],
Trên cơ sở thực tiễn này, chúng tôi thiết kế các thí nghiệm nghiên cứu chuyển
nạp gen kháng sâu ở đậu tƣơng. Trong phạm vi đề tài, chúng tôi tiến hành: “Nghiên
cứu biến nạp gen kháng sâu cry1B vào đậu tƣơng (Glycine max (L.) Merrill)
Nguồn gốc: Đậu tƣơng là một trong những loại cây trồng mà loài ngƣời đã
biết sử dụng và trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tƣơng cũng sớm
đƣợc xác minh. Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận
rằng đậu tƣơng có nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây đậu
tƣơng đƣợc thuần hóa ở Trung Quốc qua nhiều triều đại tiền phong kiến và đƣợc
đƣa vào trồng trọt, khảo sát có thể trong triều đại Shang (năm 1700 – 1100 B.C) trƣớc
công nguyên[2].
Phân loại: Có nhiều cách phân loại đậu tƣơng dựa trên những yêu cầu, tiêu chí
phân loại khác nhau. Hệ thống phân loại theo khóa phân loại của Hymowitz, T. và
C.A. Newell căn cứ vào đặc điểm về hình thái, phân bố địa lý và số lƣợng nhiễm sắc thể
đƣợc nhiều ngƣời sử dụng [80]. Theo đó, đậu tƣơng hay đỗ tƣơng, đậu nành có tên khoa
học là Glycine max (L.) Merr, và thuộc:
Bộ đậu : Fabales
Họ đậu : Fabaceae
Phân họ : Leguminosae
Chi : Glycine
Số lƣợng nhiễm sắc thể 2n = 40
Ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja. Chi Glycine đƣợc chia ra thành 7 loài
hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja đƣợc chia ra làm 2 loài: loài đậu tƣơng trồng Glycine
(L.) Merrill và loài hoang dại hàng năm G. Soja Sieb và Zucc.
1.1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tƣơng
Những bƣớc tiến của Công nghệ sinh học hiện đại đã từng bƣớc tạo ra cây trồng
mang những đặc tính mới hay phát huy thế mạnh của những đặc tính vốn có phục vụ
nhu cầu sản xuất, kinh doanh và tiêu dùng của con ngƣời. Đậu tƣơng cũng vậy, là một
trong những cây trồng quan trọng bậc nhất – mối quan tâm của ngƣời dân, nhà kinh tế,
cũng nhƣ các nhà khoa học. Và, vì vậy, các đặc tính của đậu tƣơng cũng đã có nhiều
thay đổi tích cực cùng với các đặc tính sẵn có nhờ có nền công nghệ sinh học hiện đại.
Đặc tính kháng côn trùng, sâu, bệnh hại
Tính kháng sâu hại là đặc tính của giống cây trồng có khả năng chống lại sự
tấn công của một loài sâu hại nào đấy hoặc làm giảm tác hại do sâu hại gây ra. Tính
hƣớng mới trong công tác lai tạo giống đậu tƣơng kháng sâu. Năm 1994, Parrott và
cộng sự thực hiện thí nghiệm chuyển gen Bt vào cây đậu tƣơng. Tác giả sử dụng gen
cry1Ac đƣợc phân lập từ chủng Bacillus thuringiensis var.kurstaki để tạo cây đậu
tƣơng chuyển gen Bt đầu tiên. Các cây chuyển gen Bt này khi đƣợc dùng làm thức ăn
cho sâu ăn lá Velvetbean (Anticarsia gemmatalis), làm sâu biếng ăn, chậm phát triển
và tỷ lệ sống sót giảm, kết quả biểu hiện tính kháng tƣơng đƣơng với giống đậu
tƣơng chuẩn kháng CatIR81-296 có tính kháng cao đối với sâu bộ cánh vảy. Độ độc
không cao của các cây đậu tƣơng chuyển gen Bt này đƣợc xác định là do mức biểu
hiện thấp của Bt protein (ít hơn 1ng Bt protein/mg protein tổng số) trong cây đậu
tƣơng [51]. Để gia tăng tính kháng sâu cũng nhƣ an toàn sinh học của các cây đậu
tƣơng chuyển gen kháng sâu, rất nhiều các nghiên cứu đã đƣợc tiến hành và có
những thành công nhất định.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
9
Đặc tính tránh chịu hạn
Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tƣơng nói riêng có nhu cầu về nƣớc cao
hơn các loại cây khác, bởi đậu tƣơng có hàm lƣợng protein và lipit cao, để tổng hợp 1
kg chất khô cần 500-530 kg nƣớc. Trong quá trình nảy mầm nhu cầu về nƣớc của đậu
tƣơng chiếm 50% khối lƣợng hạt, trong khi đó ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26%
Tính tránh chịu hạn của đậu tƣơng có thể phân loại nhƣ sau:
- Tránh hạn: là cơ chế một số thời kỳ sinh trƣởng phát triển nhạy cảm của cây
đậu tƣơng tránh và thoát các ảnh hƣởng trực tiếp của khô hạn.
- Chịu hạn hoặc do giảm sự mất nƣớc, hoặc cây chịu đƣợc sự mất nƣớc
Những công trình nghiên cứu về cơ chế phân tử của khả năng chịu hạn của
thực vật trong những năm gần đây đã chỉ ra rằng: các gene tham gia vào quá trình chịu
hạn của thực vật đƣợc chia thành hai nhóm: Nhóm1- gen điều khiển (gen tổng hợp
protein điều khiển quá trình phiên mã - transcription factor, kinase ) và Nhóm 2- gen
chức năng (gen tham gia vào quá trình tổng hợp photphatase, protease, late
embryogenesis abundant (LEA), các protein sinh tổng hợp amino acid, đƣờng: proline,
Bằng công nghệ sinh học ngƣời ta đã có thể tạo ra những giống cây trồng kháng
thuốc diệt cỏ, cho phép loại trừ đƣợc cỏ dại một cách chọn lọc. Nhìn chung, sản xuất
cây trồng kháng thuốc diệt cỏ đƣợc tiến hành bằng việc chuyển gen mã hóa enzyme
gây bất hoạt thuốc diệt cỏ vào cây trồng. Gen mã hóa enzyme tổng hợp 5-enolpyruvyl-
3-phosphoshikimic (EPSPS), gen mã hóa enzyme phosphinothricin acetyl transerase
(PAT) đã đƣợc chuyển vào cây đậu tƣơng và tạo ra các dòng đậu tƣơng chuyển gen
kháng thuốc diệt cỏ glyphosate /glufosinate.
Theo Lawton (1999) có khoảng 1000 giống đậu tƣơng kháng thuốc diệt cỏ
glyphosate đang đƣợc bán bởi hơn 200 công ty trên thế giới. Monsanto, công ty giữ
bản quyền về giống đậu tƣơng chuyển gen kháng cỏ “Round up” thống kê cho thấy
năm 1996 có khoảng 0,4 triệu hecta trồng đậu tƣơng kháng thuốc diệt cỏ, năm 1997
tăng lên 3,6 triệu hecta và năm 1998 đạt 11,3 triệu hecta [38].
Các giống đậu tƣơng chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ glufosinate, Roundup và
imidazoline đã đƣợc thƣơng mại hóa. Năm 2004, hàng loạt các giống đậu tƣơng
chuyển gen kháng các loại thuốc diệt cỏ khác nhau đƣợc trồng chủ yếu ở Mỹ và chúng
đã đƣợc nhập khẩu vào cộng đồng chung Châu Âu, mặc dù vẫn tồn tại khá nhiều tranh
cãi. Trong thập kỷ qua (1995-2006), đối với cây chuyển gen, đặc tính kháng thuốc diệt
cỏ liên tục là tính trạng nổi bật (chiếm 71%), tiếp sau là đặc tính kháng sâu bệnh
(chiếm 18%), và các cây mang cả hai đặc tính này (chiếm 11%).
1.1.3. Tình hình sản xuất và nhu cầu tiêu thụ đậu tƣơng
Cây đậu tƣơng là cây trồng cạn, ngắn ngày, dễ trồng, có tác dụng cải tạo đất,
tăng năng suất các cây trồng khác do hoạt động cố định đạm của loài vi khuẩn
Rhizobium cộng sinh trên rễ cây đậu. Đậu tƣơng là nguồn thực phẩm có giá trị kinh tế
cao, giàu đạm, giàu chất béo, giàu các chất khoáng, các vitamin và đƣợc ƣu ái gọi là “
Ông Hoàng của các loài đậu”.
Tình hình sản xuất đậu tƣơng:
Trên thế giới:
Quê hƣơng của đậu tƣơng là Đông Nam châu Á, nhƣng 45% diện tích trồng đậu
tƣơng và 55% sản lƣợng đậu tƣơng của thế giới nằm ở Mỹ. Do khả năng thích ứng
rộng hiện nay đậu tƣơng đƣợc trồng ở khắp các châu lục, tập trung nhiều nhất ở châu
diện tích cây trồng bị thu hẹp nên sản lƣợng đậu tƣơng nƣớc ta năm 2011 giảm 14% so
với năm 2010 xuống còn 254,2 nghìn tấn (Bảng 1).Quy mô sản xuất vẫn còn tƣơng đối
nhỏ và không đáp ứng đƣợc nhu cầu tiêu thụ trong nƣớc. Sản lƣợng năm 2011 giảm
khá xa so với mục tiêu mà Bộ NN&PTNT đã đề ra trong năm 2010 (325 nghìn tấn) và
mục tiêu năm 2020 (700 nghìn tấn). Nguyên nhân chủ yếu là do năng suất cây trồng
còn thấp, chi phí sản xuất lại khá cao và công nghệ thu hoạch vẫn còn rất lạc hậu.
Theo số liệu thống kê chính thức, đậu tƣơng đang đƣợc trồng tại 25 trong số 63
tỉnh thành cả nƣớc, với khoảng 65% tại các khu vực phía Bắc và 35% tại các khu vực
phía Nam. Đầu năm nay, Thủ tƣớng Chính phủ cũng đã phê duyệt Quy hoạch tổng
thể phát triển sản xuất ngành nông nghiệp đến năm 2020 và tầm nhìn đến năm 2030.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
12
Theo đó, diện tích đất quy hoạch khoảng 100 ngàn ha, tận dụng tăng vụ trên đất lúa
để năm 2020 diện tích gieo trồng khoảng 350 ngàn ha, sản lƣợng 700 ngàn tấn; vùng
sản xuất chính là đồng bằng sông Hồng, trung du miền núi phía Bắc, Tây Nguyên.
Bảng 1.1: Sản xuất đậu tương Việt Nam từ 2007 - 2013
2007
2008
2009
2010
2011
2012
*
2013
*
Crop area (thousand
ha)
190,1
350
Nguồn: Tổng cục thống kê, *số liệu dự báo
Nguồn: Tổng cục thống kê, *số liệu dự báo
Hình 1.2 – Diện tích trồng và sản lượng cây đậu tương tại Việt Nam (2007 – 2013)
Các nhà khoa học Việt Nam cũng đang tiếp tục nghiên cứu để cho ra giống đậu
tƣơng công nghệ sinh học và hiện đại có sản lƣợng cao hơn và chi phí sản xuất thấp
hơn tại một số khu vực. Bộ NN&PTNT cũng đã phê duyệt đƣa 3 loại cây là ngô,
bông và đậu tƣơng để trồng cây biến đổi gen trên các cánh đồng thử nghiệm. Tuy
nhiên, cho tới nay vẫn chƣa có doanh nghiệp nào áp dụng để thực hiện khảo nghiệm
đậu tƣơng Bt. Thời gian thử nghiệm thƣờng kéo dài từ 2 đến 3 năm trƣớc khi đƣợc
công nhận và cho đi vào khâu sản xuất. Theo hệ thống bảo hộ giống cây trồng, do
Cục trồng trọt (Bộ NN&PTNT) thành lập năm 2002, nhiều giống cây trồng trong đó
có đậu tƣơng và cây lạc (hầu hết là giống trong nƣớc) đƣợc đăng ký và chấp thuận
bảo hộ, đặc biệt là sau khi Việt Nam gia nhập Hiệp hội Bảo hộ giống cây trồng quốc
tế (UPOV) năm 2006. Đây cũng là một yếu tố khuyến khích các nhà khoa học Việt
Nam tiếp tục nghiên cứu tìm ra những giống cây trồng mới.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
13
Tình hình tiêu thụ cây đậu tƣơng:
Theo bản thống kê, trên toàn thế giới có khoảng 1,2 vạn sản phẩm làm từ đậu
tƣơng. Ở Nhật Bản, hàng năm dùng tới 460-500 vạn tấn đậu tƣơng (bình quân mỗi
ngƣời ăn khoảng 37-40 kg) trong đó có khoảng 80% dùng làm dầu ăn và thức ăn chăn
nuôi, 20% dùng làm thực phẩm. Ở Mỹ, ngƣời ta làm ra khoảng 2500 loại thực phẩm từ
đậu tƣơng. Các sản phẩm đƣợc tiêu thụ trên thị trƣờng gồm bột đậu nành đóng gói,
đậu phụ, sữa đậu nành, sữa chua đậu nành,… Đậu tƣơng là nguyên liệu của nhiều
ngành công nghiệp khác nhau nhƣ: chế biến cao su nhân tạo, sơn, mực in, xà phòng,
chất dẻo, tơ nhân tạo, chất đốt lỏng, dầu bôi trơn trong ngành hàng không, nhƣng chủ
hành với công suất 4.000 tấn/ngày. Nhà máy Bunge Việt Nam đã nghiền 500.000 tấn
đậu tƣơng nhập khẩu từ Hoa Kỳ, Argentina, Brazil và Paraguay trong 8 tháng đầu vận
hành (bắt đầu từ tháng 5 năm 2011).
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
14
1.1.4. Tình trạng sâu hại đậu tƣơng
Đậu tƣơng là cây trồng đƣợc khá nhiều loài côn trùng sử dụng làm thức ăn.
Những thiệt hại chính đối với cây đậu tƣơng gây ra bởi côn trùng thuộc ba bộ chính: bộ
cánh vảy, bộ hai cánh và bộ cánh cứng. Sâu hại đậu tƣơng có thể phân làm ba loại dựa
trên dạng gây hại nhƣ: sâu ăn lá và cắn rụng lá, sâu ăn quả và sâu đục thân đậu tƣơng.
Các loại sâu ăn quả có thể gây thiệt hại nghiêm trọng đến năng suất đậu tƣơng khi tấn
công trên hạt non. Sâu đục thân thƣờng làm ruộng đậu đổ ngã, cây đậu còi cọc và chết.
Với các loại sâu ăn lá, mức độ thiệt hại nhiều hay ít tùy theo giai đoạn phát triển của
cây đậu.
Việc sử dụng giống kháng bị hạn chế vì không có giống kháng cao để hoàn toàn
phòng trừ sâu hại đậu tƣơng, ở Mỹ một vài kỹ thuật canh tác đƣợc áp dụng nhƣ gieo
trồng sớm hay trồng các giống ngắn ngày để né tránh các đỉnh bộc phát của sâu
Velvetbean; trồng gần bên các ruộng cây trồng khác đƣợc sâu đo ƣa thích hơn đậu
tƣơng cũng hạn chế mức gây hại của sâu đo đến ruộng đậu tƣơng ở một số vùng trồng
đậu tƣơng của nƣớc Mỹ [55]. Thuốc trừ sâu thƣờng đƣợc dùng khi mật độ sâu lên đến
mức ngƣỡng gây hại. Tổng chi phí ƣớc tính cho thuốc trừ sâu sử dụng để phòng trừ 4
loại côn trùng nhƣ sâu ăn lá Velvetbean (Anticarsia gemmatalis), sâu đo
(Pseudoplusia includens), sâu xanh corn earworn (Heliothis zea), và sâu đục thân
(Elesmopalplus) ở Mỹ lên đến 6,5 triệu đô hằng năm [55]. Tuy nhiên, do tính kháng
thuốc trừ sâu cao của một số loài sâu bộ cánh vảy, việc phòng trừ sâu hại đậu tƣơng
bằng thuốc trừ sâu trở nên kém hiệu quả.
Theo Gianessi và cộng sự (2002), ở Mỹ các loại sâu thƣờng gây hại nghiêm
trọng đến năng suất đậu tƣơng là sâu ăn lá Velvetbean (Anticarsia gemmatalis), sâu đo
Tại Đài Loan, loài sâu đục quả này có thể gây hại 10-15% số quả. Ở Indonesia đậu
tƣợng bị loài sâu hại này gây hại nặng hơn, với tỷ lệ quả bị đục có khi tới 80% [45]
1.2. Agrobacterium tumefaciens và hiện tƣợng biến nạp gen thực vật
Ngày nay, cây trồng công nghệ sinh học mang các tính trạng mong muốn đã
đƣợc tạo ra nhờ nhiều phƣơng pháp trong đó có các phƣơng pháp chuyển gen thực vật
khác nhau nhƣ sử dụng súng bắn gen, dùng xung điện tế bào và mô thực vật, dùng vi
tiêm, chuyển gen thông qua con đƣờng ống phấn,…Phƣơng pháp chuyển gen thông
qua Agrobacterium tumefaciens, cho đến nay, vẫn đƣợc sử dụng chính trong kỹ thuật
chuyển gen thực vật và sản phẩm tạo ra chiếm đến 80 % sản phẩm chuyển gen [65].
1.2.1. Giới thiệu chung về A.tumefaciens
Những năm đầu thế kỷ 20, Smith và Townsend đã phát hiện ở một số cây hai lá
mầm xuất hiện những khối u và tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn đất Agrobacterium
tumefaciens. Đến cuối những năm 1960, mối quan hệ giữa khối u và vật liệu di truyền
trong loài vi khuẩn này đã đƣợc Braun và Schilperoort khám phá. Agrobacterium
tumefaciens có khả năng xâm nhiễm vào thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết
thƣơng của cây chủ. Trong tự nhiên, Agrobacterium chủ yếu tấn công vào cây hai lá
mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa. Một vài loài cây một lá mầm thuộc họ hành tỏi
và thủy tiên mẫm cảm yếu với Agrobacterium tumefaciens.
Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thƣờng, khối u do vi khuẩn
Agrobacterium sinh ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện không có hormone sinh
trƣởng (auxin và cytokinin). Sở dĩ nhƣ vậy là do Agrobacterium đã chuyển một
đoạn DNA (T-DNA) sang tế bào thực vật và T-DNA đã điều khiển quá trình tổng
hợp các chất đó [57], [68]. Ngoài ra, khối u còn tổng hợp opin là các amino axit đặc
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
16
biệt và các dẫn xuất của đƣờng. Dạng opin đƣợc tổng hợp có thể là nopalin,
octopin, agrocinopin, mannozapin hay agropin phụ thuộc vào từng chủng
Agrobacterium điều khiển quá trình tổng hợp các chất đó. Trong đó nopalin và
octopin là hai dạng opin phổ biến nhất. Opin đƣợc vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn
C. Bằng phƣơng pháp lai DNA-DNA và lập bản đồ chuỗi kép di hợp
(heteroduplex mapping), ngƣời ta đã xác định đƣợc Ti-plasmid có 4 vùng tƣơng đồng.
Kết quả phân tích di truyền cho thấy vùng T-DNA (transferred DNA) và vùng gây độc
(virulence) liên quan đến sự hình thành khối u trong khi hai vùng khác liên quan đến
sự tiếp hợp và sự tái bản của plasmid trong Agrobacterium. Vùng Vir dài khoảng 40
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
17
kb đảm nhiệm chức năng gây nhiễm. Ở Ti-plasmid dạng octopin, vùng Vir chứa tới 24
gen gây độc. Sản phẩm protein do các gen này mã hóa đã kích thích sự tách biệt T –
DNA, bao bọc che chở và giúp chúng tiếp cận với genome cây chủ [67]. Có 9 loại
protein Vir là A, B, C, G, B1 – 11, D1 – 2, E1 – 2, F, H, J/AcvB [54], [67]. Các
protein Vir này có vai trò quan trọng trong việc chuyển T- DNA sang tế bào thực vật.
Trên Ti-plasmid, chỉ có vùng T – DNA đƣợc chuyển từ vi khuẩn sang hệ gen
của các cây bị bệnh và tồn tại bền vững ở trong đó. Tuy nhiên, vùng này lại không mã
hóa những sản phẩm trung gian cho quá trình chuyển T – DNA mà cần có sự trợ giúp
đặc biệt của các gen gây độc.
1.2.3. Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-DNA
T-DNA là một đoạn DNA đƣợc giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần nhƣ
hoàn toàn từ khoảng 25bp và gọi là đoạn biên, trong đó chứa gen mã hóa cho sinh tổng
hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong Ti-plasmid, vị trí của T-
DNA đƣợc giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và bờ trái (LB-Left Border). Ở
đoạn biên bên phải (Right border – RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình
chuyển T – DNA. Đoạn bên trái (Left border – LB) gián tiếp tham gia vào quá trình
chuyển T – DNA và là dấu hiệu để quá trình này kết thúc bình thƣờng [6], [54].
Ti-plasmid dạng nopalin, T – DNA xâm nhập vào hệ gen thực vật ở dạng một
đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopin, T – DNA là một đoạn
gen liên tục dài 13 kb. T – DNA mang rất nhiều gen nhƣ: (1) các gen mã hóa những
enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opin; (2) các gen gây khối u nhƣ tms1,
tms2, tmr mã hóa cho các enzyme liên quan đến quá trình sinh tổng hợp auxin và
kích thƣớc của phức xuống xấp xỉ 2 nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di
chuyển qua các kênh dẫn truyền trên màng tế bào [57]. Protein Vir E2 chứa đựng hai
tín hiệu định vị trong nhân tế bào thực vật và một protein Vir D2 [21]. Thực tế cho
thấy hai protein này có vai trò quan trọng trong việc dàn xếp sự hấp thụ phức vào
trong nhân tế bào thực vật [148]. Nếu loại bỏ tín hiệu định vị trong nhân thì một trong
các protein này bị giảm, nhƣng không ức chế hoàn toàn quá trình chuyển T – DNA và
tƣơng tác giữa T – DNA với genome tế bào thực vật, chứng tỏ có một thành viên khác
có thể đảm nhận một phần tối thiểu vai trò của protein bị thiếu Protein Vir E cần thiết
đối với quá trình bài xuất protein Vir E2 sang tế bào thực vật [57].
Protein Vir D4 không thể thiếu đối với sự vận chuyển phức ss – T – DNA.
Chức năng của protein Vir D4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein cần thiết
đối với quá trình di truyền T – DNA.
Các nghiên cứu công bố trƣớc đây đã miêu tả vai trò của operon Vir B có kích
thƣớc 9,5 kb trong quá trình sản sinh cấu trúc bề mặt của tế bào đối với sự vận chuyển
phức từ vi khuẩn sang tế bào thực vật [48]. Protein Vir B là protein có tính kị nƣớc
tƣơng tự protein kết hợp trên màng khác. Phần lớn protein Vir B đã đƣợc phát hiện
giống nhƣ kênh protein xuyên màng. Tuy nhiên, cũng có thể vài protein Vir B khác
đƣợc phân phối lại trong quá trình phát sinh sinh vật và thực hiện chức năng của kênh
kết hợp qua tế bào vận chuyển. Đáng chú ý là trong đó protein Vir B2, Vir B11 là
thành phần cơ bản của bộ máy vận chuyển T – DNA từ tế bào vi khuẩn sang tế bào
thực vật. Sau khi T – DNA qua màng tế bào chúng đi thẳng vào nhân và kết hợp với
hệ gen thực vật, bắt đầu hoạt động và sản sinh ra auxin, cytokinin và opin gây lên sự
phát triển thái quá của hàng loạt tế bào lân cận dẫn đến sự hình thành khối u [48].
Gen virA và gen virC đƣợc biểu hiện ở vi khuẩn sinh trƣởng sinh dƣỡng mặc dù
gen virC chỉ đƣợc phiên mã ở mức độ thấp. Khi Agrobacterium gặp dịch rỉ của các tế
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
19
bào thực vật bị tổn thƣơng, hoặc AS tinh khiết, sản phẩm của gen virA (có thể liên kết
với màng) sẽ nhận diện và tƣơng tác với AS và truyền tín hiệu ngoại bào vào trong tế
Vector liên hợp đƣợc xây dựng dựa trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tƣơng
đồng nằm trên plasmid vi khuẩn (nhƣ vector của E.coli) với cùng T- DNA trên Ti-
plasmid của Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, ngƣời ta giữ lại vùng Vir, loại bỏ
vùng mã hóa chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-
plasmid.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
20
Có 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:
(a) Ti-plasmid: các gen gây khối u đã bị thay bởi gen kháng kháng sinh hoặc một
đoạn trình tự của vector pBR322 (hệ thống vector pGV).
(b) Vector trung gian: có nguồn gốc từ pBR322 với kích thƣớc nhỏ và đƣợc
bổ trợ chức năng không ƣu việt của Ti-plasmid. Chúng đƣợc nhân lên trong E.coli
và chuyển sang Agrobacterium tumefaciens nhờ quá trình tiếp hợp. Do không thể
sao chép trong Agrobacterium tumefaciens nên chúng mang những đoạn tƣơng đồng
với T- DNA.
(c) Vector trợ giúp: tồn tại trong E.coli, có kích thƣớc nhỏ, chứa các gen di động
(mob) và gen chuyển (tra) giúp cho quá trình tiếp hợp và chuyển vào Agrobacterium
tumefaciens.
Hình 1.4. Sơ đồ cấu trúc vector liên hợp
1.3.1.2. Vector nhị thể
Trên cơ sở phát hiện hai vùng Vir không nằm trên cùng một plasmid với vùng T
– DNA mà vẫn điều khiển đƣợc sự chuyển và xâm nhập của T – DNA vào hệ gen thực
vật, ngƣời ta đã nghiên cứu và hoàn chỉnh hệ thống vector nhị thể, trong đó vùng T –
DNA và vùng Vir nằm trên hai plasmid khác nhau nhƣng trong cùng một chủng
Agrobacterium tumefaciens.
Có hai loại vector đƣợc sử dụng trong hệ thống vector nhị thể:
(a) Vector chuyển gen là Ti-plasmid nhỏ có khả năng tự sao chép và có phổ vật Hình 1.5. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể
Hình 1.5 : Vector nhị thể
1.3.1.3. Hệ vector 2 T-DNA
Hệ vector 2 T - DNA là một dạng của vector nhị thể, đƣợc phát triển nhằm tạo ra
cây trồng chuyển gen an toàn sinh học, phát triển một thế hệ “công nghệ gen sạch”,
đáp ứng đƣợc mối quan tâm lo lắng đặt ra từ phía các chính phủ cũng nhƣ ngƣời tiêu
dùng sản phẩm cây trồng chuyển gen. Những cây chuyển gen sử dụng hệ thống vector
2 T –DNA sau thế hệ T
0
tức là thế hệ cây T
1
đã có thể chọn đƣợc các cây chuyển gen
không mang gen chỉ thị sàng lọc (gfp, gus…), gen chỉ thị chọn lọc (hpt, …), và chỉ
mang gen mục tiêu cần chuyển (gen kháng sâu, gen chịu hạn, gen kháng thuốc diệt
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
22
cỏ…). Vector 2 T-DNA có kích thƣớc khá lớn do mang hai đoạn T- DNA, một đoạn
T-DNA mang gen chỉ thị chọn lọc và gen chỉ thị sàng lọc, còn một đoạn T-DNA mang
gen mục tiêu hoặc cả hai đoạn T-DNA đều mang gen mục tiêu. Với nhiều lợi ích của
vector 2 T - DNA nhƣ: cùng lúc có thể chuyển hai gen mục tiêu khác nhau, nhanh
chóng sàng lọc đƣợc cây chuyển gen an toàn sinh học, nên vector 2 T -DNA hiện nay
đang đƣợc sử dụng vào chuyển gen thực vật khá nhiều. Nhƣợc điểm của vector 2 T –
DNA là kích thƣớc tƣơng đối lớn nên khó chuyển. Hiện nay hệ thống vector 2 T –
DNA đã có nhiều dạng cải biến mang các gen mục tiêu khác nhau với mục đích
23
chọn lọc hpt, T-DNA thứ hai mang gen bar biến nạp vào 3 giống lúa ƣu tú. Các cây
lúa chuyển gen nhận đƣợc sau phân ly có biểu hiện kháng thuốc diệt cỏ.
1.3.2 Gen chỉ thị và gen kháng côn trùng
1.3.2.1. Gen chỉ thị
Việc thiết kế các gen chỉ thị có thể hoạt động đƣợc trong tế bào thực vật đã nâng
cao hiệu quả của kỹ thuật chuyển gen. Nhờ quá trình chọn lọc ở tế bào vi khuẩn và
sàng lọc ở mô tái sinh, các tế bào biến nạp đƣợc nhận biết dễ dàng. Các chỉ thị di
truyền sử dụng trong biến nạp gen ở thực vật thƣờng có nguồn gốc từ vi khuẩn hoặc
thực vật với hai loại chính:
Chỉ thị chọn lọc
Các chỉ thị chọn lọc di truyền đã và đang đƣợc sử dụng phổ biến hiện nay trong
quá trình biến nạp gen đƣợc trình bày trong bảng 1.4. Việc chọn các gen chỉ thị di
truyền cần chú ý một số yêu cầu: Thứ nhất là chất chọn lọc ức chế sinh trƣởng các tế
bào không đƣợc biến nạp; thứ hai là sự thể hiện của gen chọn lọc không ảnh hƣởng tới
trao đổi chất của các tế bào chuyển nạp; thứ ba là gen chọn lọc bảo vệ tế bào khỏi tác
dụng của chất chọn lọc và cho thấy rõ ràng sự khác nhau về sinh trƣởng giữa tế bào
đƣợc chuyển nạp và tế bào không đƣợc chuyển nạp; thứ tƣ là không ảnh hƣởng tới
sinh trƣởng của cây hoàn chỉnh tạo đƣợc từ cây chuyển gen.
Ngoài ra để đảm bảo mức độ an toàn sinh học đối với những cây trồng biến đổi
gen, một số hệ thống chọn lọc tích cực (positive selection system) đang đƣợc sử dụng
nhằm thay cho các gen kháng sinh và kháng thuốc diệt cỏ. Các gen này nhƣ: isopentyl
transferase (ipt) và gen tăng trƣởng rễ (root proliferation-rol gen system) thuộc hệ
thống biến dƣỡng hormone sinh trƣởng; xylose isomerase (xylA) và phosphomanose
isomerase (pmi) thuộc hệ thống biến dƣỡng đƣờng [74]. Tế bào thực vật đƣợc chuyển
gen pmi có khả năng biến dƣỡng mannose 6-phosphate thành fructose 6-phosphate,
dạng đƣờng đƣợc hấp thụ bởi tế bào thực vật. Hệ thống chọn lọc bằng mannose đã
đƣợc sử dụng thành công trong chuyển gen cho củ cải đƣờng [74], lúa, lúa mì và ngô.
Chỉ thị sàng lọc
Gen lacZ: Gen LacZ là một trong những gen đầu tiên đƣợc sử dụng nhƣ là gen
chỉ thị. Gen lacZ mã hóa cho một protein β-galactosidase, một loại đƣợc sử dụng rộng
dãi trong hóa sinh và di truyền học. Gen chỉ thị này lúc đầu đƣợc sử dụng để phân tích
sự biểu hiện của gen ở trong nấm men nhƣng sau đó đã đƣợc sử dụng ở trong thuốc lá.
Vấn đề chính của loại gen chỉ thị này là mức độ biểu hiện của enzyme β-galactosidase
ở trong thực vật
Gen CAT: Một loại gen cũng đƣợc sử dụng rộng rãi để phân tích sự biểu hiện
của gen đó là protein mã hóa chloramphenicol acetyltransferase (CAT) Enzyme này
xúc tác phản ứng acetyl hóa hai vị trí trên phân tử chloramphenicol và làm nó bất hoạt.
Gen CAT đã chuyển thành công trong các sinh vật nhân thực khác nhau nhƣ nấm men
[34], tế bào động vật có vú, Drosophila [40], thuốc lá [64]. Gen chỉ thị CAT chỉ thích
hợp cho một số loài thực vật. Charest và cộng sự (1989) phát hiện ra một số họ cải có
mức độ hoạt động cao của CAT nội sinh và sự có mặt của chất ức chế không xác định
đã làm giảm mức độ biểu hiện của vi khuẩn CAT trong chuyển gen thực vật.
Gen gfp: Hệ thống gen chỉ thị mới đã đƣợc phát hiện đó là một loại protein
phát huỳnh quang màu xanh (Green fluorescent protein- gfp). Protein này đƣợc phát
hiện trong tự nhiên ở một loài sứa biển, nó có thể đƣợc quan sát bằng kính hiển vi
quang học một cách dễ dàng mà không phá hủy cơ quan sống của sinh vật.
Số hóa bởi trung tâm học liệu http://www.lrc.tnu.edu.vn/
25
Từ khi gen chỉ thị gfp lần đầu tiên đƣợc Chalfile và cộng sự (1994) [26] sử dụng
để phát hiện sự biểu hiện của gen ở E.coli và Caenorhabditis elegans nó đã đƣợc cải
tiến ở nhiều phòng thí nghiệm với mục đích khác nhau [61], [63]. Gen gfp đã đƣợc sử
rộng rãi và đƣợc xem nhƣ là một scorable marker để đánh giá hiệu quả chuyển gen
thông qua A.tumefaciens [56], bắn gen. Biểu hiên của gen gfp có thể cho phép quan sát
mẫu ở bất kỳ thời điểm nào. Gen gfp cũng đƣợc sử dụng nhƣ là một gen chỉ thị để
phân tích sự phân chia hay sự di chuyển của protein trong quá trình sống của thực vật
dƣới kính hiển vi huỳnh quang [61].
Bảng 1.3. Hệ thống các gen chỉ thị chọn lọc (selectable marker genes) và các gen
gus A
β-glucuronidase
X-gluc
lacZ
β-galactosidase
X-Gal
luc
Luciferase đom đóm
Lumis Phos
lux
Luciferase khuẩn
Lumi Phos
cat
Chloramphenicol acetyltransferase
Chloramphenicol đánh dấu
nos
Nopaline synthase
nopaline
1.3.2.2. Gen kháng côn trùng và gen cry1B
Khái quát về gen kháng côn trùng
Copyright: Tài liệu đại học ©