Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
NGUYỄN TIẾN DŨNG Tên đề tài:
“NGHIÊN CỨU BIẾN NẠP GEN VÀO ĐẬU TƯƠNG
(Glycine max (L.) Merrill) THÔNG QUA VI KHUẨN
Agrobacterium tumefaciens”
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Thái Nguyên-2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
Thái Nguyên-2010
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC BẢNG
Trang
Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tương nhiều nhất thế giới năm 2008 5
Bảng 1.2. Số liệu thống kê sản xuất đậu tương qua các vùng khác nhau 6
Bảng 1.3. Tình hình sản xuất đậu tương ở Việt Nam 7
Bảng 1.4. Các chỉ thị chọn lọc dùng cho biến nạp gen 17
Bảng 1.5 Các gen thông báo chỉ thị sinh hóa 20
Bảng 2.1. Thành phần môi trường nuôi cấy 38
Bảng 3.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương sau 10 ngày 45
Bảng 3.2. Khả năng kéo dài chồi và ra rễ tạo cây hoàn chỉnh 47
Bảng 3.3. Kết quả lựa chọn chủng vi khuẩn thích hợp cho biến nạp gen 48
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của mật độ vi khuẩn biến nạp đến hiệu quả biến nạp gen 53
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của phương thức tăng cường khả năng lây nhiễm 54
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đồng nuôi cấy đến hiệu quả biến nạp gen 56
Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ AS đến khả năng biến nạp gen 57
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của L-cystein đến hiệu quả biến nạp gen 58
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của hygromycin đến khả năng chọn lọc sau chuyển gen 59
Bảng 3.10. Hiệu quả chuyển gen vào một số giống đậu tương 62
Bảng 3.11. Số cây sau chọn lọc của một số giống đậu tương 63
Bảng 3.12. Kết quả phân tích PCR các dòng đậu tương chuyển gen với cặp mồi 65
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
AS
:
Acetosyringone
BAP
:
6 - Benzylaminopurine
bp
:
base pair (cặp bazơ)
GFP
:
Green Fluorescent Protein
DNA
:
Deoxyribo Nucleic Acid
EDTA
:
Ethylene Diamine Tetraacetace Axit
Et-Br
:
Ethidium Bromide
TAE
:
Tris-Acetate-EDTA
TE
:
Tris-EDTA
T- DNA
:
Transfer DNA (ADN chuyển)
Ti-Plasmid
:
Tumor inducing plasmid (plasmit gây khối u thực vật)
VIR
:
Virulence region (vùng gây độc có khả năng tạo khối u)
X-gluc
:
5-bromo-4-chloro-3-indolyl--D-glucuronodase acid
2,4-D
:
Dichlorophenoxy acetic acid
& cs
:
và cộng sự
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
MỤC LỤC
Chƣơng 2: VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30
2.1. VẬT LIỆU 30
2.1.1. Các thiết bị và dụng cụ thí nghiệm 30
2.1.2. Hóa chất 30
2.1.3. Plasmid, primers và vi khuẩn 30
2.1.4. Vật liệu thực vật 31
2.1.5. Địa điểm nghiên cứu 32
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 32
2.3. Ph-¬ng ph¸p nghiªn cøu 32
2.3.1. Biến nạp plasmid vào tế bào E.coli bằng phƣơng pháp sốc nhiệt 32
2.3.2. Biến nạp plasmid vào tế bào Agrobacterium tumefaciens bằng phƣơng
pháp xung điện 33
2.3.3. Phƣơng pháp tách chiết DNA plasmid từ vi khuẩn 33
2.3.4. Phƣơng pháp PCR 34
2.3.5. Ph-¬ng ph¸p ®iÖn di trªn gel agarose
2.3.6. Phƣơng pháp nuôi cấy tái sinh cây hoàn chỉnh 35
2.3.7. Phƣơng pháp biến nạp gen vào các giống đậu tƣơng 39
2.3.8 Sàng lọc, phân tích cây chuyển gen 39
2.3.8.1. Sàng lọc thông qua gen chỉ thị GFP 39
2.3.8.2. Phân tích PCR 39
2.3.9. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm, theo dõi, đánh giá và sử lý kết quả 41
2.3.9.1. Phương pháp bố trí thí nghiệm………………………………………… 41
2.3.9.2. Phương pháp theo dõi, đánh giá .42
Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 44
3.1. Kết quả đánh giá khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của một số giống đậu
tƣơng 44
3.1.1. Khả năng phát sinh chồi của một số giống đậu tương 44
3.1.2. Khả năng kéo dài chồi, ra rễ tạo cây hoàn chỉnh của các giống đậu tương
nghiên cứu 46
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
1. Tính cấp thiết của đề tài
Đậu tương [Glycine max (L.) Merrill.] là một trong những cây trồng có vị trí quan
trọng trong sản xuất nông nghiệp. Ngoài giá trị dinh dưỡng trong hạt, đậu tương còn là
cây trồng lý tưởng trong hệ thống luân canh do có khả năng cải tạo đất. Diện tích cây
đậu tương ở nước ta 5 năm gần đây chỉ trên 170.000 ha, năng suất bình quân xấp xỉ 1,5
tấn/ha, sản lượng hạt trên 210 nghìn tấn, thấp hơn nhiều so với năng suất bình quân
của thế giới [14]. Nguyên nhân chính là do năng suất của giống không cao, tổn thất do
sâu bệnh hại trên đồng ruộng và sau thu hoạch lớn (hàng năm, ước tính thiệt hại về số
lượng sau thu hoạch đối với đậu tương khoảng 6,2 - 14%).
Diện tích đất canh tác nông nghiệp ngày càng bị thu hẹp do sự phát triển của các
ngành công nghiệp và dịch vụ. Bên cạnh đó, nhu cầu về sản lượng hạt đậu tương để
phục vụ cho phát triển chăn nuôi, công nghiệp chế biến ngày một tăng. Sản lượng đậu
tương không đáp ứng đủ nhu cầu trong nước, do đó phải nhập khẩu từ các nước bên
ngoài (năm 2009, Việt Nam nhập khẩu 2,3 triệu tấn đậu tương từ nước ngoài).
Thêm nữa, những năm gần đây khí hậu toàn cầu đang có dấu hiệu thay đổi phức
tạp. Hiện tượng trái đất nóng lên đã làm cho tình hình hạn hán, lũ lụt ngày càng trở
nên nghiêm trọng. Việt Nam là một trong những nước sẽ chịu nhiều ảnh hưởng. Dự
kiến, nếu mực nước biển dâng cao 1 mét, Việt Nam sẽ mất hơn 12% diện tích đất đai,
nơi cư trú của 23% số dân. Nguồn nước và sản xuất nông nghiệp bị ảnh hưởng nghiêm
trọng. Cùng với đó là sự gia tăng của dịch hại đã tác động không nhỏ đến cây trồng nói
chung và đậu tương nói riêng. Để tăng sản lượng đậu tương, ngoài mở rộng thêm diện
tích trong cơ cấu luân canh thì việc tăng năng suất là giải pháp chính.
Sử dụng giống đậu tương biến đổi gen là một tiến bộ quan trọng trong ngành sản
xuất đậu tương của thế giới hiện nay. Ở nước ta, đậu tương, ngô và bông là 3 cây trồng
đang được nghiên cứu để tạo cây chuyển gen. Một số phòng thí nghiệm của các Viện
nghiên cứu đã có những báo cáo kết quả nghiên cứu cây chuyển gen của Việt Nam như
đậu tương [7], [8], ngô [4]. Tuy nhiên đó mới chỉ là các kết quả nghiên cứu ban đầu.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
2
3
Chƣơng 1
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nguồn gốc và phân loại cây đậu tƣơng
Đậu tương là một trong những loại cây trồng mà loài người đã biết sử dụng và
trồng trọt từ lâu đời, vì vậy nguồn gốc của cây đậu tương cũng sớm được xác minh.
Những bằng chứng về lịch sử, địa lý và khảo cổ học đều công nhận rằng đậu tương có
nguyên sản ở Châu Á và có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây đậu tương được thuần hóa
ở Trung Quốc qua nhiều triều đại và được đưa vào trồng trọt và khảo sát ở triều đại
Shang (năm 1700 – 1100 B.C) trước công nguyên.
Do xuất phát từ những yêu cầu, căn cứ vào tiêu chí phân loại khác nhau nên
cũng có nhiều cách phân loại đậu tương. Nhưng đến nay, hệ thống phân loại căn cứ vào
đặc điểm về hình thái, phân bố địa lý và số lượng nhiễm sắc thể được nhiều người sử
dụng [63]. Theo hệ thống này ngoài chi Glycine còn có thêm chi phụ Soja. Chi Glycine
được chia ra thành 7 loài hoang dại lâu năm, và chi phụ Soja được chia ra làm 2 loài: loài
đậu tương trồng Glycine (L.) Merrill và loài hoang dại hàng năm G. Soja Sieb và Zucc.
Đậu tương thuộc chi Glycine, họ đậu Leguminosae, họ phụ cánh bướm Papilionoideae và
bộ Phaseoleae. Đậu tương có tên khoa học là Glycine Max (L.) Merrill [2], [67].
1.2. Đặc tính chống chịu của cây đậu tương
Đặc tính chịu hạn
Các cây họ đậu nói chung, cây đậu tương nói riêng là cây có nhu cầu về nước cao hơn
các loại cây khác. Đó chính là do đậu tương có hàm lượng protein và lipit cao, để tổng hợp
1 kg chất khô cần 500-530 kg nước. Trong quá trình nảy mầm nhu cầu về nước của đậu
tương chiếm 50% khối lượng hạt, trong khi đó ở ngô chỉ là 30%, lúa là 26% [2], [9].
Khi nghiên cứu các đặc tính chịu hạn của cây đậu tương về phương diện sinh lý và
di truyền đã cho thấy các đặc tính này liên quan liên quan chặt chẽ đến đặc điểm hoá keo
của nguyên sinh chất, đặc điểm của quá trình trao đổi chất. Khả năng chịu hạn của cây
đậu tương ở khu vực Châu Á hoặc Châu Úc [22]. Năm 1902, lần đầu tiên bệnh rỉ sắt ở
đậu tương được phát hiện tại Nhật và cũng là trở ngại cho các nước khu vực nhiệt đới
và cận nhiệt đới. Không lâu sau đó, loại nấm Phakopsora pachyrhizi nhanh chóng lan
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
5
rộng ra các vùng trồng đậu tương trên toàn thế giới. Một loạt các nước phát hiện ra
loại bệnh này như Hawaii (1994), Zimbabwe (1998), Paraquay (2001) và nhiều nước
khác thuộc khu vực Châu Phi, Nam Mỹ.
Thống kê ở các nước trồng đậu tương trên thế giới đã xác định năng suất đậu
tương bị suy giảm do loại bệnh rỉ sắt gây ra khoảng từ 10 đến 80% tùy từng mùa vụ,
điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác và giống đậu tương gieo trồng.
Ở Việt Nam, Pham và cộng sự (2009) [111] đã đánh giá khả năng kháng bệnh rỉ
sắt của 63 giống đậu tương (trong đó có 3 giống của Việt Nam) qua năm mùa vụ khác
nhau từ 2005 đến 2009 đã xác định được giống DT2000 và Vàng Hà Giang là 2 giống
có khả năng kháng bệnh rỉ sắt tốt nhất.
1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng trên thế giới và tại Việt Nam
1.3.1.Trên thế giới
Đậu tương là cây lương thực giàu hàm lượng protein (44%), lipid (12,5 – 25%)
và glucid (10 – 15%) được trồng làm thức ăn cho người và gia súc. Trong hạt đậu
tương có chứa đầy đủ các axít amin cơ bản như isoleucin, leucin, lycin, methionin,
phenylalanin, tryptophan và valin. Cây đậu tương dễ trồng, có tác dụng cải tạo đất,
tăng năng suất các cây trồng khác do hoạt động cố định đạm của loài vi khuẩn
Rhizobium cộng sinh trên dễ cây đậu. Do khả năng thích ứng khá rộng, cây đậu tương
đã được trồng khắp năm châu lục, tập trung nhiều nhất là châu Mỹ 75,68%, tiếp đến là
châu Á 21,27% và một số nước khác trên thế giới [42].
Bảng 1.1. Các quốc gia sản xuất đậu tƣơng nhiều nhất thế giới năm 2008
TT
Quốc gia
Diện tích
7
Canada
1,20
3,34
8
Bolivia
0,96
1,60
Tổng số trên toàn thế giới
96,87
230,95
(Nguồn: Food & Agriculture Organisation, 2009)
1.3.2. Ở Việt Nam
Một số tài liệu cho rằng cây đậu tương được đưa vào trồng ở nước ta từ thời
vua Hùng và xác định cây đậu tương được trồng trước cây đậu xanh và cây đậu đen
[1]. Ngày nay đậu tương đã trở nên quen thuộc và trồng rộng rãi trên cả nước. Tuy
nhiên đậu tương trồng ở nước ta chủ yếu là sử dụng làm thực phẩm mang tính tự cung
tự cấp. Trong những năm gần đây, cây đậu tương đã phát triển khá nhanh cả về diện
tích và năng suất góp phần tạo ra mặt hàng tiêu dùng quan trọng. Tình hình sản xuất
đậu tương trong nước mấy năm gần đây được trình bày trong bảng 1.2 và 1.3.
Bảng 1.2. Số liệu thống kê sản xuất đậu tƣơng qua các vùng khác nhau ở Việt
Nam, năm 2008
STT
Vùng canh tác
Diện tích
( ha)
Năng suất
(kg/ha)
Sản lƣợng
(tấn/năm)
15500
Tổng số
191500
1400,0
268600
(Nguồn: Niêm giám thống kê 2008, NXB Thống kê Hà Nội, 2009)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
7
Về diện tích: Diện tích gieo trồng đậu tương của nước ta chiếm tỉ lệ nhỏ trong
tổng diện tích gieo trồng (khoảng 1,5 – 1,6%). Những năm gần đây diện tích trồng đậu
tương có xu hướng giảm xuống, nếu lấy năm 2005 làm mốc thì đến năm 2009 diện
tích đã giảm 57,7 nghìn ha (bảng 1.3).
Về năng suất: năng suất đậu tương bình quân của nước ta rất thấp chỉ đạt
khoảng trên 50% so với năng suất bình quân trên thế giới. Tuy nhiên, nhờ những nỗ
lực rất lớn của các nhà khoa học trong công tác nghiên cứu chọn tạo giống và các biện
pháp canh tác, năng suất đậu tương trong 5 năm gần đây đã tăng từ 1,34 tấn/ha (2004)
lên 1,46 tấn/ha (2009). Hiện nay, cả nước đã hình thành 6 vùng sản xuất đậu tương
(bảng 1.2). Trong đó vùng Đồng bằng Sông Hồng có diện tích lớn nhất, chiếm 36,6%
diện tích đậu tương cả nước; tiếp đến là vùng Trung du miền núi phía bắc (chiếm
33,47%), vùng Tây Nguyên (chiếm 13%), vùng đồng bằng sông Cửu Long 5,7%.
Về sản lượng: sản lượng đậu tương của vùng đồng bằng sông Hồng và Trung
du miền núi phía Bắc chiếm hơn 65% sản lượng đậu tương cả nước. Vùng đồng bằng
sông Cửu Long chỉ chiếm khoảng 3,6% diện tích nhưng năng suất bình quân cao nhất
cả nước đạt trên 22 tạ/ha, sản lượng chiếm 5,7% sản lượng của cả nước (bảng 1.2).
Bảng 1.3. Tình hình sản xuất đậu tƣơng ở Việt Nam trong những năm gần đây
(2004 – 2009)
Năm
Diện tích
(Nghìn ha)
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
8
Cùng với nhịp độ tăng dân số, vấn đề sức khỏe của người tiêu dùng được chú
trọng. Xu hướng sử dụng dầu thực vật để thay thế mỡ động vật trong chế biến thức ăn
ngày càng tăng. Hạt đậu tương là một trong những loại nguyên liệu chính được sử
dụng để sản xuất dầu thực vật và là nguồn cung cấp protein cho con người. Việt Nam
đã đặt ra mục tiêu tăng sản lượng đậu tương lên đến 50 triệu tấn/năm vào năm 2010.
Tuy nhiên, sản lượng đậu tương khó tăng nhanh trong những năm tới do năng suất còn
thấp, chi phí cho hóa chất trừ sâu hại cao, làm hạn chế khả năng tăng năng suất, tăng
mùa vụ và diện tích gieo trồng của đậu tương.
1.4. Vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens và quá trình chuyển gen vào cây trồng
1.4.1. Agrobacterium tumefaciens và hiện tượng biến nạp gen thực vật trong tự nhiên
Những năm đầu thế kỷ 20, Smith và Townsend đã phát hiện ở một số cây hai lá
mầm xuất hiện những khối u và tác nhân gây bệnh chính là vi khuẩn đất Agrobacterium
tumefaciens. Đến cuối những năm 1960, mối quan hệ giữa khối u và vật liệu di truyền
trong loài vi khuẩn này đã được Braun và Schilperoort khám phá. Agrobacterium
tumefaciens có khả năng xâm nhiễm vào thực vật, kích thích tạo khối u ngay tại các vết
thương của cây chủ. Trong tự nhiên, Agrobacterium chủ yếu tấn công vào cây hai lá
mầm, đặc biệt là nhóm thực vật có hoa. Một vài loài cây một lá mầm thuộc họ hành tỏi
và thủy tiên mẫm cảm yếu với Agrobacterium tumefaciens [27].
Hoàn toàn khác với mô tế bào thực vật bình thường, khối u do vi khuẩn
Agrobacterium sinh ra phát triển mạnh ngay trong điều kiện không có hormone sinh
trưởng (auxin và cytokinin). Sở dĩ như vậy là do Agrobacterium đã chuyển một
đoạn DNA (T-DNA) sang tế bào thực vật và T-DNA đã điều khiển quá trình tổng
hợp các chất đó [49], [59]. Ngoài ra, khối u còn tổng hợp opin là các amino axit đặc
biệt và các dẫn xuất của đường. Dạng opin được tổng hợp có thể là nopalin,
octopin, agrocinopin, mannozapin hay agropin phụ thuộc vào từng chủng
Agrobacterium điều khiển quá trình tổng hợp các chất đó. Trong đó nopalin và
octopin là hai dạng opin phổ biến nhất. opin được vi khuẩn sử dụng thay cho nguồn
genome cây chủ [59]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
10 Hình 1.1. Sơ đồ cấu trúc Ti-plasmid dạng octopin
1.4.3. Cấu trúc và chức năng của các đoạn T-DNA
Kết quả phân tích trình tự gen trên T – DNA ở các Ti-plasmid khác nhau cho
thấy, T – DNA được giới hạn bởi một đoạn trình tự lặp lại gần như hoàn toàn từ
khoảng 25bp và gọi là đoạn biên. Chúng là dấu hiệu nhận biết cho quá trình chuyển T
– DNA và xâm nhập của T – DNA vào tế bào thực vật. Ở đoạn biên bên phải (Right
border – RB) có yếu tố điều khiển cis cần cho quá trình chuyển T – DNA. Đoạn bên
trái (Left border – LB) gián tiếp tham gia vào quá trình chuyển T – DNA và là dấu
hiệu để quá trình này kết thúc bình thường [6], [47].
và sợi T – DNA. Theo đa số các nhà khoa học cho rằng phức hợp sợi đơn T – DNA –
Vir D2 được bao bọc bởi protein Vir E2 có trọng lượng 96 kDa [54]. Sự phối hợp này
giúp ngăn cản sự tấn công của nuclease, hơn nữa sợi đơn T – DNA duỗi thẳng làm
giảm kích thước của phức xuống xấp xỉ 2 nm, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình di
chuyển qua các kênh dẫn truyền trên màng tế bào [49]. Protein Vir E2 chứa đựng hai
tín hiệu định vị trong nhân tế bào thực vật và một protein Vir D2 [19]. Thực tế cho
thấy hai protein này có vai trò quan trọng trong việc dàn xếp sự hấp thụ phức vào
trong nhân tế bào thực vật [132]. Nếu loại bỏ tín hiệu định vị trong nhân thì một trong
các protein này bị giảm, nhưng không ức chế hoàn toàn quá trình chuyển T – DNA và
tương tác giữa T – DNA với genome tế bào thực vật, chứng tỏ có một thành viên khác
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
12
có thể đảm nhận một phần tối thiểu vai trò của protein bị thiếu Protein Vir E cần thiết
đối với quá trình bài xuất protein Vir E2 sang tế bào thực vật [49]. Hình 1.2. Sự tương tác giữa Agrobacterium với tế bào thực vật và cơ chế
chuyển T - DNA
Protein Vir D4 không thể thiếu đối với sự vận chuyển phức ss – T – DNA. Chức năng
của protein Vir D4 là liên kết với ATP độc lập với phức protein cần thiết đối với quá
nhận việc cắt bỏ bớt base, như microhomologies, cần thiết đối với bước lặp lại giữa
cặp vận chuyển T – DNA với Vir D2 và DNA thực vật. Sự tương đồng này rất thấp và
đặc trưng đối với quá trình tái tổ hợp bởi sự xác định vị trí của Vir D2 để gắn kết [49],
[60]. Ở trình tự gần kề hay đầu 3‟ của T – DNA tìm thấy một vài sự tương đồng nhỏ
đối với DNA thực vật, kết quả của sự tương tác đầu tiên giữa sợi T – DNA và DNA
thực vật là tạo ra lỗ hổng ở sợi 3‟ – 5‟ của DNA thực vật. Sau đó DNA thực vật được
cắt ở vị trí đầu 3‟ của lỗ hổng bởi endonuclease và nucleotit của đầu 5‟ bắt cặp với Vir
D2 bởi một nucleotit của đầu 5‟ bắt cặp với Vir D2 bởi một nucleotit trong đầu sợi (5‟
– 3‟) DNA thực vật. Phần 3‟ nhô ra của T – DNA cũng như DNA thực vật thay thế bị
phân hủy bởi endonuclease hay 3‟-5‟ enxonuclease. Đầu 5‟ của T – DNA gắn với Vir
D2 còn đầu 3‟ kia cặp đôi với DNA thực vật kéo dài từ bước đầu của quá trình tương
tác, nối liền với vết cắt trong sợi DNA dưới của thực vật. Sự đưa vào của sợi T – DNA
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn
14
trong sợi 3‟ – 5‟ của DNA thực vật được bổ sung, tình trạng xoắn sinh ra bởi vết cắt
trong sợi đối ngược được sản sinh [13], [60].
Tình trạng này hoạt hóa phản ứng sửa chữa của tế bào thực vật và sợi bổ sung
được tổng hợp sử dụng để chèn dễ dàng sợi T – DNA như là sợi khuôn [49]. Vir D2 có
vai trò hoạt hóa trong sự hòa hợp chính xác sợi T – DNA vào nhiễm sắc thể thực vật.
Phóng thích protein Vir D2 có thể cung cấp năng lượng chứa đựng trong các liên kết
phosphodieste, như Tyr 29 với nucleotit đầu tiên của sợi T – DNA, qui định đầu 5‟ của
sợi T – DNA không còn [116]. Ngoài ra, quá trình chuyển T – DNA còn có sự tương
tác với các protein do gen trên nhiễm sắc thể của Agrobacterium tumefaciens qui định
và protein trong tế bào thực vật.
1.5. Hệ thống vector sử dụng để biến nạp gen thông qua vi khuẩn Agrobacterium
tumefaciens
1.5.1. Vector nhị thể
Trên cơ sở phát hiện hai vùng Vir không nằm trên cùng một plasmid với vùng T
– DNA mà vẫn điều khiển được sự chuyển và xâm nhập của T – DNA vào hệ gen thực
Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc vector nhị thể
1.5.2. Hệ vector liên hợp
Vector liên hợp được xây dựng dựa trên cơ sở sự tái tổ hợp giữa vùng tương đồng
nằm trên plasmid vi khuẩn (như vector của E.coli) với cùng T- DNA trên Ti-plasmid
của Agrobacterium tumefaciens. Trong đó, người ta giữ lại vùng Vir, loại bỏ vùng mã
hóa chức năng gây khối u và thay thế bằng những đoạn DNA mới trong Ti-plasmid.
Có 3 loại vector tham gia vào hệ thống vector liên hợp:
Copyright: Tài liệu đại học ©