BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC TRỊNH THỊ THƢƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN GUS VÀO
GIỐNG SẮN KM 94 THÔNG QUA VI KHUẨN
AGROBACTERIUM TUMEFACIENS KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Sơn La, năm 2014

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC TÂY BẮC

TRỊNH THỊ THƢƠNG XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHUYỂN GEN GUS VÀO


Trịnh Thị Thƣơng
KÝ HIỆU VIẾT TẮT AS : Acetosyringone (3,5-dimethoxy-4-hydrroxy Acetophenone)
A. tumefaciens: Agrobacterium tumefaciens
BAP : 6-benzylaminopurin
CIAT: Centro Internacional de Agricultura Tropical
DNA : Deoxiribonucleic Acid
FAO : Food and Agriculture Organization
Gus : β-1,4-Glucuronidase
MS : Murashige and Skoog, 1962
OD: Optical density
Ti-plasmid : Tumor-Inclucing Plasmid
T-DNA : Transfer-DNA
Vir : Virulence
VTM: Vitamin
X-gluc : 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-glucuronide
MỤC LỤC
MỞ ĐẦU 1
1. Lí do chọn đề tài 1
2. Mục tiêu đề tài 2
3. Nội dung nghiên cứu 2
4. Đối tượng và thời gian nghiên cứu 2
4.1. Đối tượng nghiên cứu 2
4.2. Thời gian nghiên cứu 2
5. Địa điểm và phạm vi nghiên cứu 2
5.1. Địa điểm 2
5.2. Phạm vi nghiên cứu 2

2.3.2. Tạo vật liệu chuyển gen 17
2.3.3 Các bước chuyển gen 19
2.3.4. Phương pháp xác định hiệu quả chuyển gen bằng nhuộm hóa tế bào 21
2.4. Xây dựng các công thức thí nghiệm 22
2.5. Xác định chỉ tiêu cho mỗi công thức 22
Chƣơng 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 23
1. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào mảnh lá chưa trưởng thành của giống
sắn KM 94 23
2. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào đoạn thân non của giống sắn KM 94 26
3. Biến nạp vi khuẩn mang gen Gus vào mảnh lá mầm của giống sắn KM94 29
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 34
1. Kết luận 34
2. Kiến nghị 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO 35

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. Thành phần môi trường MS (Murashige và Skoog) 16
Bảng 2. Thành phần của môi trường sử dụng nuôi cấy mẫu 17
Bảng 3. Tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá chưa trưởng thànhgiống sắn KM 94 23
Bảng 4. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhuộm Gus của mảnh lá chưa trưởng thành giống sắn
KM 94 25
Bảng 5. Tỉ lệ tạo mô sẹo của đoạn thân non giống sắn KM 94 27
Bảng 6. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhuộm Gus của đoạn thân non giống sắn KM 94 28
Bảng 7. Tỉ lệ tạo mô sẹo của mảnh lá mầm giống sắn KM 94 30
Bảng 8. Tỉ lệ mẫu bắt màu nhộm Gus của mảnh lá mầm giống sắn KM 94 31

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1. Ti-Plasmid 12

ưu tú có năng suất cao, có hàm lượng tinh bột cao nhằm đáp ứng giải quyết các vấn
đề thực tiễn cũng như khoa học là hết sức cần thiết, đặc biệt trong sản xuất nhiên
liệu sinh học, hàm lượng tinh bột được đánh giá cao hơn năng suất [24].
KM 94 là một trong những giống sắn chủ lực ở Việt Nam do năng suất và
hàm lượng tinh bột ổn định và cao hơn các giống mới, được lựa chọn làm đối
tượng chuyển gen. Trong đó gen chỉ thị Gus thường được sử dụng để đánh giá
hiệu quả của một quy trình chuyển gen trước khi tiến hành chuyển các gen đích
mong muốn. Do vậy để tạo tiền đề cho những nghiên cứu tạo ra giống sắn mang
gen đích mong muốn và đạt kết quả cao cần phải xây dựng một quy trình chuyển
gen hoàn chỉnh.
Xuất phát từ thực tế đó, tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xây dựng quy
trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens”

2
2. Mục tiêu đề tài
Xây dựng được quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua
vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens.
3. Nội dung nghiên cứu
- Tạo nguyên liệu chuyển gen: nhân nhanh giống sắn KM 94.
- Tiến hành quá trình biến nạp vi khuẩn A. Tumefaciens và nuôi cấy mẫu
của giống sắn KM 94.
- Kiểm tra và xác định hiệu quả chuyển gen.
4. Đối tƣợng và thời gian nghiên cứu
4.1. Đối tƣợng nghiên cứu
Quy trình chuyển gen Gus vào giống sắn KM 94 thông qua vi khuẩn
Agrobacterium tumefaciens
4.2. Thời gian nghiên cứu
Khóa luận được thực hiện từ tháng 9/2013 đến 5/2014, chia làm các giai đoạn:
- Trong tháng 9/2013: Thu thập thông tin liên quan đến khóa luận.

1.1.3. Tính đa dạng và phân bố
Trong chi Manihot có 19 giống và trên 100 loài, trong đó có một số giống
sắn phổ biến ở Việt Nam như: KM 94, KM 140, KM 98-5, KM 98-1, SM 937-
26, KM 419, KM 325
Trong đề tài này chúng tôi chỉ nghiên cứu giống sắn: KM 94
*Đặc điểm giống sắn KM 94
KM 94 có tên gốc là KU50 được nhập nội từ CIAT/Thái Lan trong bộ
giống khảo nghiệm Liên Á năm 1990. KM 94 là con lai của tổ hợp lai Rayong1
× Rayong 90.
Đặc điểm: KM 94 thuộc nhóm sắn đắng, thân xanh, hơi cong ở phần gốc,
không phân nhánh ở đồng bằng nhưng lại phân nhánh cấp một ở những tỉnh miền

4
núi. Giống ít bị nhiễm bệnh cháy lá, củ đồng đều, thịt củ màu trắng, năng suất củ
tươi: 33,0 tấn/ha, hàm lượng tinh bột 28,7%, thời gian thu hoạch 9-11 tháng.
Giống sắn KM 94 là giống sắn được trồng phổ biến nhất trên phạm vi
toàn quốc. Điển hình là Tây Ninh và Đồng Nai đã áp dụng giống KM 94 với
diện tích hàng trăm ha/hộ, đạt năng suất trên 30 tấn/ha [9].
1.1.4. Giá trị của cây sắn
Cây sắn có giá trị kinh tế lớn về nhiều mặt. Sắn là nguồn lương thực đáng
kể cho con người, là nguồn thức ăn dồi dào cho chăn nuôi, nguồn nguyên liệu
cho công nghiệp. Tất cả các bộ phận của cây sắn đều có thể sử dụng vào mục
đích kinh tế.
 Thành phần hóa học chính của củ sắn là gluxit, ở củ sắn tươi có tỷ lệ các
chất khoáng và vitamin khá cao đặc biệt là canxi. Tuy nhiên, sắn có tỷ lệ
protein và lipit thấp, vì vậy khi sử dụng sắn làm lương thực phải bổ sung thêm
thức ăn giàu đạm và lipit mới cung cấp đủ năng lượng cho cơ thể.
 Sử dụng sắn làm lương thực: Thực tế ở nhiều vùng trên thế giới đã coi sắn
và các sản phẩm từ sắn là nguồn lương thực chính, đặc biệt là các nước Châu
Phi. Sắn đứng vị trí thư tư trên thế giới về mặt cung cấp năng lượng cho con

của thế giới là 12,16 tấn/ha (FAO, 2008).
Trên thế giới, sắn được trồng bởi những hộ nông dân sản xuất nhỏ để làm
lương thực- thực phẩm, thức ăn gia súc và để bán. Sắn chủ yếu trồng trên đất
nghèo và dùng kỹ thuật canh tác truyền thống. Mức tiêu thụ sắn bình quân toàn
thế giới khoảng 18 kg/người/năm. Sản lượng sắn của thế giới được tiêu dùng
trong nước khoảng 85% (lương thực 58%, thức ăn gia súc 28%, chế biến công
nghiệp 3%, hao hụt 11 %), còn lại 15% (gần 30 triệu tấn) được xuất khẩu dưới
dạng sắn lát khô, sắn viên và tinh bột (CIAT, 1993). Nhu cầu sắn làm thức ăn
gia súc trên toàn cầu đang giữ mức độ ổn định trong năm 2006 (FAO, 2007).
Sắn chiếm tỷ trọng cao trong cơ cấu lương thực ở châu Phi, bình quân khoảng
96 kg/người/năm. Zaire là nước sử dụng sắn nhiếu nhất với 391 kg/người/năm
(hoặc 1123 calori/ngày). Nhu cầu sắn làm lương thực chủ yếu tại vùng Saharan
châu Phi cả hai dạng củ tươi và sản phẩm chế biến ước tính khoảng 115 triệu
tấn, tăng hơn năm 2005 khoảng 1 triệu tấn. Buôn bán sắn trên thế giới năm 2006
ước đạt 6,9 triệu tấn sản phẩm, tăng 11% so với năm 2005 (6,2 triệu tấn), giảm

6
14,8% so với năm 2004 (8,1 triệu tấn). Trong đó tinh bột sắn (starch) và bột sắn
(flour) chiếm 3,5 triệu tấn, sắn lát (chips) và sắn viên (pellets) 3,4 triệu tấn [9].
Trung Quốc hiện là nước nhập khẩu sắn nhiều nhất thế giới để làm cồn
sinh học (bio ethanol), tinh bột biến tính (modify starch), thức ăn gia súc và
dùng trong công nghiệp thực phẩm dược liệu. Địa điểm chính tại tỉnh Quảng
Tây. Năm 2005, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,03 triệu tấn tinh bột, bột sắn và
3,03 triệu tấn sắn lát, sắn viên. Năm 2006, Trung Quốc đã nhập khẩu 1,15 triệu
tấn tinh bột, bột sắn và 3,40 triệu tấn sắn lát và sắn viên. Thái Lan chiếm trên
85% lượng xuất khẩu sắn toàn cầu, kế đến là Indonesia và Việt Nam. Thị trường
xuất khẩu sắn chủ yếu của Thái Lan là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật Bản và
cộng đồng châu Âu với tỷ trọng xuất khẩu sắn khoảng 40% bột và tinh bột sắn,
25% là sắn lát và sắn viên (TTTA, 2006; FAO, 2007). Năm 2006 được coi là
năm có giá sắn cao đối với cả bột, tinh bột và sắn lát. Việc xuất khẩu sắn làm

quan trọng của các hộ nông dân nghèo do sắn dễ trồng, ít kén đất, ít vốn đầu tư,
phù hợp sinh thái và điều kiện kinh tế nông hộ. Sắn chủ yếu dùng để bán
(48,6%) kế đến dùng làm thức ăn gia súc (22,4%), chế biến thủ công (16,8%),
chỉ có 12,2% dùng tiêu thụ tươi [9].
Sắn cũng là cây công nghiệp có giá trị xuất khẩu và tiêu thụ trong nước.
Sắn là nguyên liệu chính để chế biến bột ngọt, mì ăn liền, bánh kẹo, siro, nước
giải khát, bao bì, ván ép, phụ gia dược phẩm, màng phủ sinh học và chất giữ
ẩm cho đất. Toàn quốc hiện có trên 60 nhà máy chế biến tinh bột sắn với tổng
công suất khoảng 3,8 triệu tấn củ tươi/năm và nhiều cơ sở chế biến sắn thủ
công rãi rác tại hầu hết các tỉnh trồng sắn. Việt Nam hiện sản xuất mỗi năm
khoảng 800.000 – 1.200.000 tấn tinh bột sắn, trong đó trên 70% xuất khẩu và
gần 30% tiêu thụ trong nước. Sản phẩm sắn xuất khẩu của Việt Nam chủ yếu là
tinh bột, sắn lát và bột sắn. Thị trường chính là Trung Quốc, Đài Loan, Nhật
Bản, Singapo, Hàn Quốc. Đầu tư nhà máy chế biến bio- etanol là một hướng
lớn triển vọng [9].
Sản xuất lương thực là ngành trọng tâm và có thế mạnh của Việt Nam
tầm nhìn đến năm 2.020. Chính phủ Việt Nam chủ trương đẩy mạnh sản xuất
lúa, ngô và coi trọng việc sản xuất sắn, khoai lang ở những vùng, những vụ có
điều kiện phát triển. Thị trường xuất khẩu sắn lát và tinh bột sắn Việt Nam dự

8
báo thuận lợi và có lợi thế cạnh tranh cao do có nhu cầu cao về chế biến
bioethanol, bột ngọt, thức ăn gia súc và những sản phẩm tinh bột biến tính. Diện
tích sắn của Việt Nam dự kiến ổn định khoảng 450 nghìn ha nhưng sẽ tăng năng
suất và sản lượng sắn bằng cách chọn tạo và phát triển các giống sắn tốt có năng
suất củ tươi và hàm lượng tinh bột cao, xây dựng và hoàn thiện quy trình kỹ
thuật canh tác sắn bền vững và thích hợp vùng sinh thái [9].
1.2. Tổng quan tình hình nghiên cứu thuộc lĩnh vực của đề tài ở trong và
ngoài nƣớc
1.2.1. Trên thế giới

của rễ trên mỗi ha trong khi sản lượng trung bình trên thế giới là 10,7 tấn/ ha và
8,9 t/ha ở châu Phi (FAO). Mở khóa tiềm năng di truyền này để tăng sản lượng
và cải thiện các tính trạng như tinh bột và chất lượng dinh dưỡng, đặc tính sau
thu hoạch và giảm hàm lượng cyanogen (HCN) đã trở thành tâm điểm của
chương trình cải thiện [24].
Công nghệ biến đổi gen cho phép những tính trạng có lợi được chuyển từ
một giống sắn này tới giống sắn khác và từ họ hàng hoang dại, vượt qua ranh
giới loài và các vấn đề về thụ phấn chéo và giao phối cận huyết. Ngoài ra,
chuyển vật chất di truyền từ các nguồn ngoại lai như virus cho chiến lược kháng
tác nhân gây bệnh, và gene vi khuẩn kháng sâu có thể được phát triển và triển
khai mang lại lợi nhuận cho nông dân trồng sắn. Công nghệ chuyển gene ở sắn
cũng như các loại cây trồng khác, hệ thống biến đổi gen trong sắn phụ thuộc vào
khả năng tạo các tế bào toàn năng và mô của hệ thống nuôi cấy mô. Đây là mục
tiêu cho chuyển gene, sau khi chọn lọc thành công tái sinh cây chuyển gene
hoàn chỉnh [20]. Ở sắn, không hệ thống tái sinh nào tái sinh được cây từ mô
trưởng thành. Tuy nhiên, nghiên cứu ban đầu đã xác định rằng phôi soma có thể
được cảm ứng và cây được tạo ra từ mẫu lá chưa hoàn chỉnh trên môi trường
Murashige và Skoog (1962) bổ sung auxin. Cây tái sinh theo cách này là dạng
vô tính của vật liệu gốc trưởng thành, giữ nguyên tất cả các tính trạng của các tế
bào mầm có được. Những cấu trúc phôi đa bào và phôi thứ cấp có thể được tạo
ra từ các tế bào mầm, đã được sử dụng làm mục tiêu cho chuyển gen khi chương
trình kỹ thuật di truyền của sắn được bắt đầu vào đầu những năm 1990. Sau một
thời gian thất bại, đã có bằng chứng cho việc tạo phôi và thực vật chuyển gen

10
lần đầu tiên được đưa ra vào năm 1994. Tiếp theo là bước đột phá trong tái sinh
cây từ hệ thống phôi, dẫn đến phục hồi xác nhận cây sắn biến đổi gen biểu hiện
uidA và gen chỉ thị luciferine [24].
1.2.2. Ở Việt Nam
Hiện nay, nghiên cứu tạo giống cây trồng biến đổi gen vẫn còn mới mẻ ở

A.tumefaciens là loài vi khuẩn sống trong đất gây ra bệnh khối u hình
chóp ở các vị trí tổn thương của thực vật Hai lá mầm. Chỉ rất ít thực vật Một lá
mầm thuộc họ Liliaceae và Amaryllidaceae là dễ bị bệnh khối u hình chóp. Sự
sinh trưởng khối u có thể tiếp diễn khi vắng mặt vi khuẩn và mô khối u có thể
được sinh trưởng vô trùng bằng nuôi cấy mô trong các môi trường thiếu sự bổ
xung auxin và cytokinie ngoại sinh mà bình thường là cần thiết để xúc tiến sự
sinh trưởng của mô thực vật in vitro. Mô khối u tổng hợp amino acid và các dẫn
xuất của đường được biết chung là opine. Loại opine tổng hợp trong khối u (ví
dụ như nopaline, octopine, agrocinopine, mannopine và agropine) phụ thuộc vào
dòng Agrobacterium khởi đầu sự hình thành khối u. Octopine và nopaline là hai
loại opine có nguồn gốc từ arginine và dễ dàng phát hiện nhất trong mô khối u
hình chóp. Do đó nhiều dòng A. tumefaciens phổ biến được thiết kế theo kiểu
octopine hoặc nopaline [5].
A. tumefaciens có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách
chuyển một đoạn ADN của nó vào tế bào thực vật. Khi ADN vi khuẩn được
hợp nhất với nhiễm sắc thể thực vật, nó sẽ tấn công vào hệ thống tổ chức của
tế bào một cách có hiệu quả và sử dụng nó để đảm bảo cho sự sinh sổi của
quần thể vi khuẩn
Để khai thác và sử dụng A.tumefaciens như là một vector chuyển gen các
nhà khoa học đã loại bỏ các gen gây khối u và gen mã hóa opine của T-ADN và
thay thế vào đó là các marker chọn lọc, trong khi vẫn duy trì các vùng bờ phải
và bờ trái của T-ADN và các gen vir. Gen chuyển được xen vào giữa các vùng
bờ của T-ADN. Nó sẽ được chuyển vào tế bào và trở nên hợp nhất với nhiễm
sắc thể tế bào thực vật [5].
Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ A. tumefaciens đã được kiểm tra
đối với sự xâm nhập bền vững, sự biểu hiện và sự di truyền của các gen
chuyển đặc biệt. Tuy nhiên, một vài yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả biến nạp
là loại mô được biến nạp, giai đoạn phát triển của mô, mức khởi đầu của vi
khuẩn A. tumefaciens sử dụng, môi trường để nuôi cấy mô sau khi biến nạp,


1.3.3. Cấu trúc và chức năng của T-ADN
T-ADN là một đoạn ADN có kích thước 25 kb, trong đó chứa gen mã hóa
cho sinh tổng hợp auxin, cytokinin, opine và các gen gây khối u. Trong Ti-
plasmid, vị trí của T-ADN được giới hạn bằng bờ phải (RB- Right Border) và
bờ trái (LB-Left Border). Ngoài T-ADN, trên Ti-plasmid còn có các vùng ADN
mã hóa cho việc tái sinh plasmid, cho khả năng lấy nhiễm và tiếp hợp (vùng
vir), cho việc tiêu hóa opine.
Ở Ti-plasmid dạng nopalin, T-ADN xâm nhập vào genom thực vật ở dạng
một đoạn liên tục dài 22 kb. Trong khi ở Ti-plasmid dạng octopine, T-ADN là
một đoạn gen liên tục dài 13 kb. T-ADN mang rất nhiều gen như: (1) Các gen
mã hoá những enzyme cần thiết cho quá trình sinh tổng hợp opine; (2) Các gen
gây khối u như tms1, tms2, tmsr mã hoá cho các enzyme liên quan đến quá trình
sinh tổng hợp auxin và cytokinine.
Trong các vùng ADN của Ti-plasmid, ngoài T-ADN được nghiên cứu
nhiều hơn cả là vùng ADN phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir.
Sản phẩm hoạt động của các gen nằm trong vùng vir dưới tác động kích thích
của các hợp chất phenol tiết ra từ vết thương là một loạt các protein đặc hiệu
như virE
2
, virB, virD, virD
2
,… Các protein này nhận biết các vết thương ở các
cây chủ thích hợp (hầu hết là cây hai lá mầm), kích thích sản sinh ra các đoạn T-
ADN, bao bọc che chở các đoạn ADN này và giúp chúng tiếp cận với hệ gen
của cây chủ một cách an toàn [5].
1.3.4. Cơ chế phân tử của việc chuyển gen thông qua A. tumefaciens
Các tế bào cây bị tổn thương sẽ tiết ra các hợp chất hoá học dẫn dụ vi
khuẩn như: AS, Dưới tác dụng của các hợp chất này, A.tumefaciens nhận biết
rồi bám vào thành tế bào chủ và chuyển T-ADN vào tế bào thực vật. Quá trình
này được sự trợ giúp đặc biệt của các gen vir và bờ phải (RB- Right Border) và

các gen chọn lọc được thiết kế trong vector chuyển gen mà người ta sử dụng các
kháng sinh phù hợp để thu được các tế bào, mẫu mang gen chuyển.
Có thể nhuộm hóa tế bào để khẳng định sự của mặt của sản phẩm thông
qua một loại gen chỉ thị được sử dụng phổ biến trong chuyển gen thực vật là gen

15
Gus hay gen uidA. Gen Gus nằm ở locus uid của vi khuẩn E. coli và mã hóa cho
enzyme β-glucuronidase. Đây là một enzyme hydrolase có khả năng phân hủy
các hợp chất có gốc β- glucuronide tạo thành chất trung gian, khi chất này bị oxi
hóa sẽ có màu xanh đậm đặc trưng. Do đó, enzyme này được xác định rất dễ
dàng và thuận tiện bằng hợp chất indole- β-glucuronide [10].
Người ta thường sử dụng dung dịch muối 5-Br-4-Cl-3-indolyl β-D-
glucuronide cyclohexylamine (X-Gluc) để nhuộm mô tế bào. Sản phẩm sơ cấp
5-Br-4-Cl-3indolyl vẫn còn là một chất dễ tan, không màu. Nhưng ngay sau đó
sản phẩm này bị ôxy hóa và dimmer hóa thành một phức hệ không tan có màu
xanh. Sự có mặt của ferri và ferrocyanide trong dung dịch nhuộm làm tăng quá
trình hình thành sản phẩm cuối cùng, đồng thời cũng góp phần hạn chế việc
khuếch tán sản phẩm sơ cấp đến vùng không có Gus [10]. 16
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHA
́
P NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu thực vật
- Đoạn thân non, mảnh lá chưa trưởng thành, mảnh lá mầm sắn KM 94.
2.1.2. Vi khuẩn
- Chủng vi khuẩn được sử dụng là A.tumefaciens CV58 mang gen Gus làm
chỉ thị sàng lọc.

2
O, ZnSO
4
.7H
2
O,
CuSO
4
.5H
2
O, COCl
2
. 6H
2
O, Na
2
MO
4
.2H
2
O, Na
2
EDTA, FeSO
4
.7H
2
O, Nicotinic
acid, Pyridoxin HCl, Thiamin HCl, Glycine
- Cồn 96%, nước cất vô trùng, agar, đường saccarose,
- Vitamin C, Vitamin mix.

2
O 370mg/l + CaCl
2
.2H
2
O 440mg/l
MS II
Na
2
EDTA 37,3mg/l+ FeSO
4
.7H
2
O 27,8mg/l
MS III
KI 0,83mg/l + CuSO
4
.5H
2
O 0,025mg/l + COCl
2
. 6H
2
O
0,025mg/l + Na
2
MO
4
.2H
2

nuôi khuẩn
(YEB)
YEB
lỏng
Yeast extract 1g/l + beef extract 5g/l + pepton 5g/l+
NaCl 5g/l+ saccarose 5g/l
YEB
đặc
Yeast extract 1g/l+ beef extract 5g/l+ pepton 5g/l+
NaCl 5g/l+ saccarose 5g/l+ agar 15g/l
Môi trƣờng
đồng nuôi
cấy
MS đặc + Picloram 12mg/l + AS 200mg/l, pH 5.8
Môi trƣờng
chọn lọc
MS + Picloram12mg/l + Kanamycin + Cefotaxim 500 mg/l, pH 5,8
Môi trƣờng
tạo mô sẹo
hay tái sinh
MS bột + Picloram 12 mg/l + VTM C 1ml/l + VTM mix 1ml/l
MS đặc
20ml/l MS I + 10ml/l MS II + 10ml/l MS III +10ml/l MS IV +
10ml/l MS V + saccarose 30g/l + agar 7,5g/l, pH 5,8
½ MS lỏng
10ml/l MS I + 5ml/l MS II + 5ml/l MS III +5ml/l MS IV +
5ml/l MS V + saccarose 30g/l , pH 5,8, không bổ sung agar

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2. Tạo vật liệu chuyển gen