KHOA DƯỢC
ĐẠI HỌC Y DƯỢC TP HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC

KHẢO SÁT ĐỘ ỔN ĐỊNH CỦA KIT THỬ
RED PYROGALLOL MOLYBDAT
ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN NIỆU

Giáo viên hướng dẫn: ThS. NGUYỄN THỊ MINH THUẬN
Sinh viên thực hiện: TRẦN THỊ HA
Lớp: D09


NỘI DUNG

1

ĐẶT VẤN ĐÊ

2

TỔNG QUAN

3

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

4

KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN

2. TỔNG QUAN

Phương pháp Red Pyrogallol – Molybdat
để định lượng protein niệu

Nguyên tắc:
Red pyrogallol + molybdat  phức hợp RPM màu đỏ (λmax = 470 nm)

Phức hợp RPM + protein  phức hợp màu tím (λmax = 578 – 612 nm)
Thường được đo ở bước sóng 600 nm.


2. TỔNG QUAN

Công thức thuốc thử RPM đã được tối ưu hóa

Thành phần

Nồng độ (mmol/L)

Red pyrogallol

0,08

Natri molybdat

0.04

Acid succinic



Thời gian ủ

13 phút


2. TỔNG QUAN

Đánh giá quy trình định lượng
Tính đặc hiệu

Tính tuyến tính

Giới hạn phát hiện
Giới hạn định lượng

Độ chính xác

Độ đúng


2. TỔNG QUAN

Nghiên cứu độ ổn định
Lựa chọn lô thử: ít nhất phải có 3 lô, trong đó có 2 lô đủ cho các thử nghiệm và 1 lô có thể ít hơn

Phương pháp nghiên cứu:

Phương pháp dài hạn



Không quy định

Điều kiện tiến hành độ ổn định cấp tốc

Chế phẩm

o
Nhiệt độ ( C)

Độ ẩm (%)

Thuốc bảo quản thường

40 ± 2

75 ± 5

Thuốc bảo quản lạnh

25 ± 2

60 ± 5


2. TỔNG QUAN

Các chỉ tiêu để kết thúc thử nghiệm độ ổn định

- Hàm lượng hoạt chất thay đổi 5% so với giá trị ban đầu.


Đối tượng nghiên cứu
thuốc thử RPM được sản xuất theo công thức đã được thiết kế và tối ưu hóa bằng phần mềm thông minh

nguyên liệu
Trang thiết bị, dụng cụ

Máy quang phổ UV-Vis Spectro UV 2505

Tủ vi khí hậu Shellab HC9-2


3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Hóa chất, dung môi
Red Pyrogallol , natri molybdat, metanol, axit succinic , natri oxalat, natri Benzoat, Dung dịch protein nồng độ 6
g/dL, nước cất 2 lần.

Chất chuẩn
Dung dịch protein chuẩn nồng độ 100 mg/dL của hãng Biolabo: Số lô 97016 hạn dùng đến tháng 06/2014.


3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Phương pháp thực nghiệm

Chuẩn bị thuốc thử:

Pha dung dịch mẹ RP 2 mmol/L
Pha dung dịch mẹ natri molybdat 10 mmol/L

20

100mg/dL (µL)

Mẫu thử (µL)

20

Trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 13 phút. Sau đó đo mật độ quang ở bước sóng 600 nm và đọc đối chiếu với
mẫu trắng.


3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thẩm định quy trình định lượng protein niệu bằng phương pháp RPM trên máy UV – Vis
Spectro UV 2505

Khảo sát tính đặc hiệu:
quét phổ từ bước sóng 400 – 800 nm đối với mẫu trắng, mẫu thử và mẫu chuẩn.

Xác định phương trình hồi quy tuyến tính:
đo độ hấp thu của giai mẫu có nồng độ từ 2 – 350 mg/dL.

Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng :
Giới hạn phát hiện: Dựa vào biểu thức LOD = 3,3 SD/b
Giới hạn định lượng: Dựa vào biểu thức LOQ = 10 SD/b


3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU




3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Ứng dụng quy trình đã được thẩm định trên một số một số mẫu nước tiểu người tình nguyện
khỏe mạnh và bệnh nhân

Lấy mẫu nước tiểu của người tình nguyện gồm 8 người tình nguyện khoẻ mạnh và 6 người tình nguyện có bệnh lý về thận.

Sử dụng mẫu nước tiểu trên định lượng bằng thuốc thử RPM theo quy trình tối ưu.


3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Khảo sát độ ổn định của thuốc thử RPM đã được thiết kế và tối ưu hóa dưới tác động của
nhiệt độ

Pha chế các lô thuốc thử RPM.

Chuẩn bị mẫu thử.

Điều kiện khảo sát độ ổn định của thuốc thử RPM.
o
- Điều kiện tự nhiên: Bảo quản trong tủ lạnh ở nhiệt độ 5 ± 3 C.
o
- Lão hóa cấp tốc: Bảo quản trong phòng máy lạnh duy trì nhiệt độ 25 ± 2 C/ RH = 60 ± 5 %
o
- Thử nghiệm cưỡng bức: Bảo quản trong tủ vi khí hậu duy trì nhiệt độ 40 ± 2 C/ RH = 75 ± 5 %



x

o
25 C

x

x

x

x

x

x

x

o
40 C

x

x

x

x


∆t: Hiệu số giữa nhiệt độ thử nghiệm và nhiệt độ bảo quản.
D0: Hàm lượng vào thời điểm ban đầu.
Dt:: Hàm lượng còn lại sau thời gian bảo quản t.
t: Số ngày từ khi thực hiện khảo sát độ ổn định đến khi lấy mẫu đo.


4. KẾT QUẢ VA BAN LUẬN

Kết quả thẩm định quy trình định lượng protein niệu bằng phương pháp RPM

Tính đặc hiệu

Phổ UV – Vis của mẫu trắng