ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM
-----  -----

--------------

NGUYỄN NGỌC SƠN
Nguyễn Ngọc Sơn

TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT
MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT VÀNG
LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM

TÁCH DÒNG VÀ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTIT
MỘT SỐ ĐOẠN TRONG GENOME CỦA VIRUT
VÀNG LÙN LÚA (RGSV) TẠI VIỆT NAM

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số: 60.42.70

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC:

TS. Nguyễn Trung Nam
Viện Công nghệ sinh học (IBT)

Thái Nguyên - 2009


2

3

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Trung Nam (Viện Công
nghệ Sinh học) đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi hoàn thành
công trình nghiên cứu này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS. TS Lê Trần Bình, TS.
Chu Hoàng Hà, TS. Nguyễn Hữu Cường, KS. Hoàng Thị Thu Hằng và tập thể cán
bộ Phòng Công nghệ Tế bào thực vật – Viện Công nghệ Sinh học đã nhiệt tình giúp
đỡ, truyền đạt nhiều kinh nghiệm đồng thời hỗ trợ tôi trong suốt thời gian thực
nghiệm và hoàn thành khóa luận này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới TS. Nguyễn Như Cường (Viện Bảo
vệ Thực vật) chủ nhiệm đề tài cấp Nhà nước “Nghiên cứu đặc tính sinh học của
virut gây bệnh và môi giới truyền bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá, các biện pháp quản
lý tổng hợp cây trồng (ICM) trong sản xuất lúa” đã cung cấp mẫu bệnh và cộng
tác trong quá trình tôi thực hiện công trình nghiên cứu này.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm – Đại học
Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sau đại học, Ban chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN,
các thày cô giáo, và cán bộ trong Khoa đã truyền đạt kiến thức cũng như tạo điều
kiện cho tôi được thực hiện khóa luận này.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình, bạn bè đã tạo điều kiện, động
viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.

Tác giả luận văn

1.6.2. Kỹ thuật RT-PCR .............................................................................. 22
1.6.3. Kỹ thuật PCR ..................................................................................... 23
1.6.4. Kỹ thuật biến nạp plasmit vào E.coli ................................................ 24
1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen ...................................................................... 24
1.6.6. Kỹ thuật PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony – PCR) ...................... 25
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 26
2.1. VẬT LIỆU .................................................................................................. 26
2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM .......................................................... 27
2.2.1. Hóa chất .............................................................................................. 27

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


4

5

2.2.2. Thiết bị ................................................................................................ 27
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 27
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................................... 27
2.3.1. Thu mẫu thí nghiệm ........................................................................... 27
2.3.2. Thiết kế mồi đặc hiệu ......................................................................... 28
2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa ............................................ 28
2.3.4. Phản ứng RT-PCR ............................................................................. 29
2.3.5. Tạo plasmit tái tổ hợp mang gen mong muốn (Ligation) ................. 29
2.3.6. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng
phƣơng pháp sốc nhiệt................................................................................. 30
2.3.7. Colony-PCR........................................................................................ 31

microlitre

µm

micrometer

bp

base pair

cDNA

Complementary DNA (DNA bổ sung đƣợc tổng hợp nhờ enzym phiên
mã ngƣợc từ RNA thông tin)

CS

Cộng sự

CLRRI

Cuulong Delta Rice Research Institute (Viện nghiên cứu lúa đồng
bằng sông Cửu Long), http://www.clrri.org

CP/NCP

Coat protein/Nucleocapsid Protein (Protein vỏ)

Đ/c


gram

ICTV

International Committee on Taxonomy of Viruses (Ủy ban quốc tế về
phân loại virus).

ICTVdB

The Universal Virus Database of the International Committee on
Taxonomy of Viruses (Ngân hàng dữ liệu về virus của ICTV),
http://www.ictvdb.rothamsted.ac.uk

IPTG

Isopropylthio-β-D-galactoside

IRRI

International Rice Research Institute (Viện nghiên cứu Lúa quốc tế),
http://www.irri.org

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


6

7

Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV…

34

nm

Nanometer

Bảng 3.2. Mã số đăng ký trên GenBank của các trình tự đã thu đƣợc...............

41

PCR

Polymerase Chain Reaction (Phản ứng chuỗi polymerase)

PEG

Polyethylene glycon

RdRp

RNA dependent RNA polymerase (Enzym nhân bản RNA và tạo ra
phân tử RNA)

Bảng 3.3. Hệ số tƣơng đồng và sai khác giữa trình tự nucleotit của gen CPRGSV tại Bình Thuận, Ninh Thuận với các trình tự tƣơng ứng của các tỉnh
ĐBSCL và thế giới (GenBank)..........................................................................

42



Rice tungro spherical virus (Virut tungro hình cầu)

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

DANH MỤC CÁC HÌNH

Trang
Hình 1.1. Cây lúa bị bệnh vàng lùn, bụi lúa giảm chồi........................................

13

Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử............................................

15

Hình 1.3. Sơ đồ cấu trúc bộ gen của RGSV.........................................................

16
17

RWSV

Rice wilted stunt virus (Virut héo lùn lúa)

Hình 1.4. RRSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử.............................................

TAE


Hình 2.2. Sơ đồ vectơ pBT .................................................................................

VL&LXL
vRNA

viral RNA (đoạn RNA của virus)

Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu của
tỉnh Bình Thuận bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV.......................

35

X-gal

5-brom-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactosidase

Hình 3.2. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV

36

Hình 3.3. Điện di sản phẩm RT-PCR gen CP của RGSV bằng cặp mồi CP-RGSV

36

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

40

Hình 3.9. Cây phát sinh chủng loại xây dựng trên việc so sánh trình tự 02 gen
CP- RGSV Nam Trung Bộ (NT, BT) với các trình tự tƣơng ứng của ĐBSCL
và thế giới đã đƣợc đăng ký vào GenBank...........................................................

43

MỞ ĐẦU

1. Lí do chọn đề tài
Lúa gạo là nguồn lƣơng thực giàu chất dinh dƣỡng chủ yếu trên thế giới,
đứng thứ ba sau ngô và lúa mì về sản lƣợng, cung cấp trên 20% calo, 15% protein,
các chất khoáng và chất xơ cho con ngƣời. Năm 2009, Việt Nam dự kiến sẽ tiếp tục
đứng thứ hai thế giới về xuất khẩu gạo (khoảng 5,3 triệu tấn/năm) và tổng sản lƣợng
đạt khoảng 36 triệu tấn/năm [62]. Khoảng 52% diện tích lúa đƣợc trồng ở ĐBSCL.
Khi đánh giá về những thành tựu đạt đƣợc trong sự nghiệp đổi mới kinh tế ở Việt
Nam, các nhà kinh tế thế giới đều thống nhất nhận định: Thành công lớn nhất là
nông nghiệp và cây lúa vẫn luôn là cây lƣơng thực quan trọng bậc nhất của Việt
Nam.
Tuy nhiên, sản lƣợng lúa bị giảm sút nghiêm trọng bởi các bệnh virut do rầy
nâu (Nilaparvata lugens Stal) lây truyền, đặc biệt là bệnh VL&LXL xảy ra trong
thời gian gần đây. Bệnh này do sự tổ hợp từ một đến bốn loại virut gây ra, gồm
virut vàng lùn lúa (Rice Grassy Stunt Virus- RGSV), virut lùn xoắn lá lúa (Rice
Ragged Stunt Virus- RRSV), virut tungro hình cầu (Rice Tungro Spherical VirusRTSV) và virut tungro hình nhộng (Rice tungro bacilliform virus- RTBV) [8], [43],
[48], [59]. Trong một số trƣờng hợp, cây lúa bị nhiễm cùng một lúc 2 đến 4 loại
virut này. Trong đó, RGSV thƣờng chiếm tỷ lệ cao nhất. Từ năm 2006 đến nay dịch
bệnh lại phát triển rộng ở các tỉnh ĐBSCL với diện tích nhiễm rất lớn. Do ảnh
hƣởng của dịch bệnh này trên cây lúa, năm 2009 Việt Nam có nguy cơ tiếp tục bị
giảm sản lƣợng gạo xuống 1 triệu tấn so với năm 2008 [12].

Việt Nam”.

1.1. TÌNH HÌNH DỊCH BỆNH VL&LXL TRÊN THẾ GIỚI VÀ VIỆT NAM

2. Mục tiêu

1.1.1. Thế giới

Phân lập và so sánh trình tự nucleotit của một số đoạn trong genome của
virut vàng lùn lúa (RGSV).

Từ thập kỷ 70 của thế kỷ XX trở lại đây, rầy nâu (Nilaparvata lugens Stal)
đã nổi lên nhƣ một vấn đề thời sự trong nghề trồng lúa ở Châu Á. Nhiều trận dịch
rầy đã xảy ra trên quy mô rộng lớn chƣa từng thấy ở nhiều nƣớc nhƣ Ấn Độ,
Indonesia, Triều Tiên, Nhật Bản, Philippin, Đài Loan... gây tổn thất nặng nề về kinh
tế [17]. Rầy nâu phá hại làm giảm một phần năng suất, hoặc khi cháy rầy làm mất
trắng. Ngoài tác hại trực tiếp, rầy nâu còn là môi giới truyền bệnh virut nguy hiểm
cho cây lúa nhƣ bệnh VL&LXL, bệnh héo lùn cây lúa ở Trung Quốc và bệnh vàng
lá lúa ở vùng núi phía Bắc Việt Nam. Theo thống kê của Dyck và Thomas (1979)
thiệt hại do rầy nâu và bệnh vàng lụi ở Châu Á trong năm 1966 – 1975 lên tới hơn
300 triệu USD [22].

3. Nội dung nghiên cứu
1> Tách dòng, xác định trình tự một số đoạn trong genome của chủng
RGSV.
2> So sánh các trình tự nucleotit của gen CP- RGSV thu đƣợc với các trình
tự tƣơng ứng trên GenBank để đánh giá độ tƣơng đồng về mặt di truyền giữa các
chủng virut.

Năm 1966, RGSV lần đầu tiên đƣợc phát hiện ở Nam và Đông Nam châu Á

Nam (11/2001), Trung Quốc (11/2002) và Việt Nam (04/2006), rầy nâu đƣợc coi là
mối đe dọa thƣờng xuyên đối với sản xuất lúa ở Châu Á [41], [61].

Liêu, Tiền Giang, Trà Vinh, Bình Thuận; Vụ Thu Đông là 18.747 ha tại Vĩnh Long,
Đồng Tháp, Cần Thơ, Bình Phƣớc, Trà Vinh, Hậu Giang, Tây Ninh. Diện tích
nhiễm VL&LXL vụ Hè Thu là 68 ha chủ yếu ở hai tỉnh Đồng Nai và Bình Thuận
[12].

1.1.2. Việt Nam
Bệnh VL&LXL trên lúa đƣợc ghi nhận sớm nhất tại Mỹ Tho và Long An
vào năm 1963. Tại miền Bắc, bệnh đƣợc ghi nhận trong những năm 1964, 1966 và
1970 trên giống Mộc Tuyền với diện tích khá lớn (khoảng 50.000 ha) [8]. Bệnh
cũng xuất hiện và gây thiệt hại 20.000 ha vụ Hè Thu 1990 tại vùng ven biển miền
Trung nhƣ Bình Định, Phú Yên và Khánh Hoà. Năm 1999 có 13.120 ha lúa bị
nhiễm ở các tỉnh Bến Tre, TPHCM, Bạc Liêu và Long An, riêng TPHCM có 242 ha
bị bệnh và không trổ bông đƣợc [9].
Đầu vụ Hè Thu 2006 dịch bệnh lại phát triển và lan rộng trên hầu hết các tỉnh
ĐBSCL, với mật số rầy nâu rất cao, diện tích bị nhiễm bệnh vàng lụi riêng tại Đồng
Tháp với thiệt hại dƣới 30% là 613 ha, và trên 30% là 2636 ha trong đó tiêu huỷ
khoảng 500 ha [54]. Cuối năm 2006, dịch bệnh VL&LXL đã đƣợc công bố ở
ĐBSCL và miền Đông Nam bộ. Bệnh VL&LXL lây lan trên lúa vụ Thu Đông và vụ
Đông Xuân ở các tỉnh vùng ĐBSCL, Đông Nam Bộ, Nam Trung Bộ và Tây
Nguyên. Theo báo cáo của các địa phƣơng, đến tháng 10 năm 2006, diện tích lúa vụ
Thu Đông 2006 và vụ Đông Xuân 2006- 2007 bị nhiễm rầy nâu của các tỉnh vùng
ĐBSCL và Đông Nam bộ là 33.323 ha, và diện tích nhiễm bệnh VL&LXL là
51.768 ha, trong đó có 26.283 ha nhiễm bệnh nặng cần phải tiêu huỷ [1]. Cũng
trong năm 2006, Rogelio Cabunagan (IRRI) cùng các chuyên gia Việt Nam đã đi
thực tế đồng lúa ở Trà Vinh, Long An, Bình Chánh (TPHCM), Bình Phƣớc, Đồng
Nai, Tiền Giang quan sát thấy cây lúa có dấu hiệu bị bệnh VL&LXL và xuất hiện
nhiều rầy nâu gây hiện tƣợng “cháy rầy”. Qua xét nghiệm bằng phƣơng pháp

“Nguồn: http://www.vaas.org.vn/”

Thời kỳ đẻ nhánh, bụi lúa bệnh đẻ quá nhiều nhánh, bụi lúa to hơn, vẫn có
chiều cao tƣơng đƣơng với các bụi khác, chƣa khác biệt lắm [64]. Càng về sau nhìn
toàn cảnh thấy lúa phát triển không đều do bụi lúa bị bệnh không phát triển chiều
cao, cuối cùng các bụi lúa bệnh sẽ khô và lụi dần nhƣ cháy rầy từng chòm. Cây lúa
bệnh có thể không có bông hoặc có rất ít bông nhƣng hạt bị đen và lép. Triệu chứng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


14

15

tồn tại rất lâu sau khi phát bệnh [26]. Lúa trƣởng thành khi bị nhiễm bệnh có lá bị
vàng, bông bị nâu và hạt lép [43].
1.3. ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC LOẠI VIRUT GÂY BỆNH VL&LXL Ở LÖA
1.3.1. Virut vàng lùn lúa (RGSV)

những năm vừa qua.
Thể virut bao gồm nhiều đoạn vRNA, vcRNA, protein vỏ virut, và vài phân
tử RdRp [35]. Thể virut khó đƣợc quan sát thấy trong dịch trích thực vật dƣới kính
hiển vi điện tử. Thể virut sau khi đƣợc ly trích có dạng sợi dài 2µm và rộng 6- 8 nm
khi đƣợc quan sát bằng cách nhuộm trong uranyl acetate [16], [29] (Hình 1.2).

Virut vàng lùn lúa đƣợc phát hiện chủ yếu trên lúa Oryza sativa [25], [43] và
có tên khoa học là Rice grassy stunt virus (RGSV), thuộc chi Tenuivirus [57]. Virut


http://www.lrc-tnu.edu.vn

Hình 1.2. RGSV quan sát dƣới kính hiển vi điện tử
Thanh đen dài 100 nm. “Nguồn: DPV”.

Lúa bị nhiễm virut có nhiều bó sợi đƣợc quan sát trong nhân và tế bào chất
hoặc trong các thể có màng bao bọc hiện diện ở phần tế bào chất của các tế bào diệp
lục [20]. Các thể hình ống đi kèm với các hạt có đƣờng kính 25 nm còn đƣợc tìm
thấy trong các tế bào mạch rây của lá lúa bệnh [47]. Các hạt 25 nm tƣơng tự cũng
xuất hiện dƣới dạng các mảng kết tinh trong các thể béo và khí quản của rầy nâu
nhiễm virut [43].
RGSV có 6 đoạn RNA khác nhau, với tổng chiều dài bộ gen của RGSV là
khoảng 25 kb (Hình 1.3) [21], [32]. Cả 6 đoạn RNA đều lƣỡng tính (ambisense, mã
hoá protein theo cả 2 chiều dƣơng và chiều bổ sung của phân tử RNA) và đều mang
đoạn mã kết thúc dài 17 nucleotit tƣơng tự nhau. Các đoạn mã kết thúc này có khả
năng tự cuốn lại và tạo nên cấu trúc hình cán chảo. Đoạn mã theo chiều bổ sung của
đoạn RNA dài nhất (RNA1) chứa một ORF mã hoá cho một RdRp tƣơng tự nhƣ
RdRp của RSV, loài chuẩn của chi Tenuivirus [35], [38] và có cùng 37 ± 9% axit
amin giống nhau trong tổng số 2140 axit amin. Tuy nhiên, khác với các Tenuivirus
khác, RNA1 của RGSV còn có thêm một ORF ngắn có chiều dƣơng ở gần đầu 5’.
Hai protein dự đoán đƣợc mã hoá bởi RNA2 chỉ tƣơng tự chút ít với các protein
đƣợc mã hoá bởi RNA2 của các Tenuivirus khác. Các protein dự đoán đƣợc mã hoá
bởi RNA3 và RNA4 rất khác biệt so với các protein đƣợc biết. Sự khác biệt giữa

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn



Rice ragged stunt virus (RRSV), thuộc chi Oryzavirus, họ Reoviridae [58].

(A): Thể virut với các protein gai dạng B “nguồn http://www.iah.bbsrc.ac.uk”.;
(B): Các thể virut liên kết lại tạo thành sợi dài, xem trong uranyl acetate, thanh đen
dài 50 nm. “Nguồn: DPV”.

1.3.2.2. Virut tungro hình cầu (RTSV)
Virut tungro hình cầu có tên khoa học là Rice tungro spherical virus
(RTSV), chi Waikavirus, thuộc họ Sequiviridae [27]. RTSV phân bố trên các loài
lúa Oryza spp. ở hầu hết các nƣớc trồng lúa tại vùng Nam và Đông Nam Á. RTSV
còn có thể phân bố ở những quốc gia khác nhƣng không đƣợc phát hiện bởi vì virut
này thƣờng không gây ra triệu chứng bệnh. Sự phân bố của RTSV có lẽ liên quan
lớn đến sự phân bố của côn trùng truyền bệnh [59].

RRSV xuất hiện tại nhiều nƣớc trồng lúa châu Á nhƣ Ấn Độ, Bangladesh,
Đài Loan, Indonesia, Malaysia, Nhật Bản, Philippin, Sri Lanka, Thái Lan, Trung
Quốc [60], và Việt Nam. RRSV là một virut quan trọng gây thiệt hại kinh tế đáng
kể. Virut không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bệnh [20]. Virut không đƣợc
truyền qua phấn hoa, qua chủng bệnh bằng tay, hoặc qua tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ
mạnh với cây lúa bệnh [60]. Rầy nâu Nilaparvata lugens là tác nhân truyền bệnh
duy nhất đƣợc biết [18], [48].

RTSV kết hợp với RTBV gây nên bệnh Tungro [14]. Đây là bệnh hại lúa gây
thiệt hại kinh tế rất lớn với thiệt hại ƣớc tính hàng năm tại vùng Đông Nam Á lên
đến hơn 1,5 tỉ USD [24]. RTSV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh.
Virut không đƣợc truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành
với cây lúa bị bệnh. RTSV có tác dụng nhƣ là một loài giúp đỡ cho RTBV trong
việc truyền bằng côn trùng [42]. RTSV đƣợc truyền dƣới dạng bán bền bởi một số
loài rầy xanh. Loài rầy truyền bệnh chủ yếu của RTSV tại vùng Đông Nam Á là rầy
xanh đuôi đen Nephotettix virescens (tên khác là N. impicticeps) [47], [59].


- Rầy non rất linh hoạt, mới nở có màu xám trắng, tuổi 2-3 trở lên có màu
nâu vàng, trong điều kiện mật độ cao có màu nâu sẫm (Hình 1.10.B).
- Con trƣởng thành có màu nâu tối, con đực nhỏ hơn con cái. Có 2 dạng rầy
trƣởng thành: loại cánh ngắn (Hình 1.10.C) và loại cánh dài (Hình 1.10.D).
A
B

1.3.2.3. Virut tungro hình nhộng (RTBV)

C

Virus tungro hình nhộng có tên khoa học là Rice tungro bacilliform virus
(RTBV), thuộc chi Tungrovirus, họ Caulimoviridae [27], [34]. RTBV đƣợc tìm
thấy tại hầu hết các nƣớc trồng lúa tại Nam và Đông Nam Á. Sự phân bố của virut
có lẽ có mối quan hệ chặt chẽ với sự phân bố của rầy xanh (côn trùng truyền bệnh
tungro) [59].
Giống nhƣ RTSV, RTBV không đƣợc truyền qua hạt của cây lúa bị bệnh.
Virut không đƣợc truyền qua chủng bệnh bằng tay hoặc tiếp xúc giữa cây lúa lành
với cây lúa bị bệnh. Virut chỉ đƣợc truyền bằng rầy xanh (Nephotettix virescens) khi
có sự giúp đỡ của RTSV. RTBV chỉ đƣợc truyền khi rầy xanh hút RTSV trƣớc hoặc
cùng thời gian [16].
RTBV có thể virut dạng hình nhộng, chứa 01 DNA sợi đôi và có dạng vòng.
Sợi DNA đôi này có một điểm đứt ở các vị trí nhất định trên mỗi sợi đơn [15],
[13]. Bộ gen của RTBV đƣợc dịch sang một RNA dài hơn chiều dài của bộ gen ban
đầu và RNA này đƣợc dịch ngƣợc sang DNA để tái tạo lại bộ gen của virut. RNA
này còn đƣợc dùng để dịch mã protein của các ORF 1, 2, 3. Ngoài ra, RNA này còn
đƣợc cắt nhỏ để dịch mã và tạo ra ORF 4 [27].

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

khó. Rầy nâu có phản ứng kháng, nhiễm với các giống lúa rất rõ, nó có khả năng
hình thành các nòi sinh học mới khi có sức ép chọn lọc của môi trƣờng đủ lớn. Rầy
có khả năng di cƣ đám đông rất xa và kháng thuốc cao. Rầy nâu còn có tác hại chủ
yếu là truyền lan các loại virut [10]. Nguy hiểm hơn cả là bệnh VL&LXL lúa khi
truyền các loại virut là RGSV và RRSV. Rầy nâu thích hợp với điều kiện khí hậu
ấm nóng, độ ẩm cao, mƣa nắng xen kẽ. Ở Miền Nam rầy có thể gây hại liên tục các
vụ lúa, còn ở phía Bắc cháy rầy thƣờng xảy ra vào tháng 5 (vụ xuân) và cuối tháng
9 đầu tháng 10 (vụ mùa) [54].

Từ năm 2003 đến nay tại Sóc Trăng đã áp dụng chế phẩm sinh học trên đồng
ruộng, và đã cho kết quả khả quan. Chế phẩm sinh học dựa trên nuôi cấy các loại
nấm kháng rầy trong tự nhiên, rồi đƣa loại nấm này ra đồng ruộng, rầy nâu gặp nấm
sẽ mang bệnh rồi truyền bệnh sang rầy khác, bằng phƣơng pháp này có thể diệt trừ
rầy nâu một cách hiệu quả mà không gây ảnh hƣởng đến sức khỏe con ngƣời [55].
Hiện nay, phƣơng pháp này cũng gặp nhiều hạn chế: về mặt qui mô (mỗi lần áp
dụng chỉ trên diện tích vài chục ha đất), về công nghệ chế biến, mƣa sau khi phun sẽ
làm trôi thuốc, phun thuốc phải trúng rầy, mƣa nhiều, nắng nhiều cũng làm ảnh
hƣởng tới chất lƣợng chế phẩm và hạn chế về mặt thời gian (rầy nâu không bị tiêu
diệt ngay sau khi phun thuốc) [6].

Tỉ lệ rầy nâu N. lugens có thể truyền bệnh khác nhau theo từng vùng trên
ruộng lúa, và biến động từ 5- 60 % [22], [28], [29]. Tỷ lệ rầy truyền bệnh có thể
đƣợc tăng lên bằng cách chọn lọc và nhân mật số các cá thể rầy có khả năng truyền
virut, nhƣng lại giảm đi khi không còn áp lực chọn lọc [28]. Với rầy nâu N. lugens,
tỉ lệ truyền bệnh không khác biệt rõ ràng giữa rầy đực và cái, giữa rầy đen đậm và
đen nhạt, giữa rầy cánh dài và cánh ngắn [28]. Tuy nhiên, rầy non có khả năng
truyền bệnh cao hơn và có giai đoạn ủ virut ngắn hơn rầy trƣởng thành [22].
1.5. PHÕNG TRỪ BỆNH VL&LXL
Bệnh VL&LXL cho đến nay chƣa có thuốc đặc trị. Vì vậy, biện pháp an toàn
và hữu hiệu nhất vẫn là phòng bệnh thông qua việc ngăn chặn, tiêu diệt rầy nâu

cDNA, tiến hành phản ứng PCR trên mRNA, và xác định trình tự của các axit
nucleic bằng phƣơng pháp sử dụng các dideoxynucleotit.
DNA ligase là enzym xúc tác sự hình thành liên kết nối hai đoạn DNA hay
RNA (RNA ligase). Enzym này đƣợc tách chiết từ E.coli và xúc tác cho phản ứng
nối hai trình tự DNA có đầu so le. T4 DNA ligase có nguồn gốc từ phage T4 xâm
nhiễm E.coli. Enzym này có cùng chức năng với ligase tách chiết từ E.coli nhƣng
đặc biệt còn có khả năng nối hai trình tự DNA đầu bằng nên T 4 DNA ligase đƣợc
dùng phổ biến nhất trong kỹ thuật tạo dòng.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


22

23

Enzym DNA polymerase xúc tác sự tổng hợp DNA theo chiều 5’-3’. phần
lớn các DNA polymerase dùng một bản mẫu là DNA đề làm khuôn cho sự tổng hợp
(DNA polymerase I, T4 DNA polymerase, Taq polymerase). Một DNA polymerase
đặc biệt là enzym phiên mã ngƣợc (Reverse Transciptase) sử dụng khuôn là RNA
để tổng hợp DNA. Ngoài ra, còn có Terminal transferrase là một DNA polymerase
không tổng hợp mạch mới từ mạch khuôn mà chỉ thêm các nucleotit vào đầu của
một phân tử DNA có sẵn. Các DNA mồi, là một đoạn DNA hay RNA ngắn bắt cặp
bổ sung với phần đầu của mạch khuôn (đầu 3’), để từ đó các polymerase mới nối
dài tạo mạch bổ sung.

nucleotit tự do có trong thành phần phản ứng ở một nhiệt độ thích hợp. Phản ứng
tổng hợp cDNA chỉ xảy ra trong một chu kỳ, theo lý thuyết sau khi kết thúc phản

intron thì ngƣời ta thƣờng tổng hợp cDNA từ mRNA với mồi oligo(dT)s. Nếu là
sinh vật nhân sơ hoặc virrut ngƣời ta có thể tổng hợp cDNA từ RNA tổng số với
mồi ngẫu nhiên hoặc mồi đặc hiệu cho gen cần nhân. Khi mồi gắn bổ sung với sợi
RNA khuôn, enzym phiên mã ngƣợc sẽ xúc tác cho quá trình tổng hợp cDNA từ các

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Khuếch đại gen bằng PCR: Sử dụng cDNA làm khuôn để khuếch đại gen
quan tâm bằng phản ứng RT-PCR với cặp mồi đặc hiệu (gồm mồi xuôi và mồi
ngƣợc). Nguyên tắc của kỹ thuật PCR đƣợc trình bày ở mục 1.6.3.

Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction – chuỗi phản ứng trùng hợp)
đƣợc Karl Mullis và cộng sự mô tả đầu tiên vào năm 1985. Đây là kỹ thuật in vitro
tƣơng đối đơn giản, cho phép nhân một số lƣợng không giới hạn nguyên bản một
đoạn DNA nhất định trong một khoảng thời gian ngắn, nhờ sự xúc tác của DNA
polymerase. Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp một đoạn DNA
mới từ mạch khuôn đều cần sự có mặt của những mồi đặc hiệu. Mồi là những đoạn
DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và DNA
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Quá trình nhân bản bằng enzym
này bao gồm 3 bƣớc đƣợc lặp lại nhiều lần:
1> Biến tính (denaturation): DNA từ dạng sợi kép thành dạng sợi đơn bằng
cách nâng cao nhiệt độ lên 94-95oC trong khoảng thời gian từ 0,5- 1 phút.
2> Lai (hybridization): Nhiệt độ đƣợc hạ thấp (thấp hơn Tm của các mồi) cho
phép các mồi bắt cặp với khuôn; trong thực nghiệm, nhiệt độ này dao động trong
khoảng 40oC – 70oC, tùy thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 0,5- 1 phút.
3> Kéo dài (elongation): Phản ứng polymerase tổng hợp phân tử DNA kéo
dài từ đoạn mồi. Hai phân tử DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ
hai đầu phân tử khuôn ban đầu. Thời gian kéo dài từ 30 giây đến vài phút. Để tránh

trƣờng chọn lọc để nhân lên các tế bào có plasmit tái tổ hợp. Trong quá trình biến
nạp, chỉ một phần rất nhỏ các tế bào khả biến đƣợc biến nạp. Mặc dù có nhƣợc điểm
rất lớn này, biến nạp vẫn là một kỹ thuật quan trọng, nó có thể tạo ra tới 10 9 các tế
bào biến nạp (tức cá thể biến nạp) khi đƣa 1µg DNA vào thí nghiệm. Trong thực tế,
với 1µg DNA ngƣời ta tạo ra đƣợc 106 đến 107 tế bào biến nạp.
1.6.5. Kỹ thuật tách dòng gen
Tách dòng gen là một công cụ hữu hiệu đƣợc sử dụng trong kỹ thuật di
truyền và là bƣớc khởi nguồn cho các kỹ thuật sau này. Mục đích của việc tách
dòng là nhằm thu đƣợc một lƣợng lớn bản sao của trình tự gen quan tâm. Đầu tiên,
DNA ngoại lai đƣợc nối vào một vectơ nhằm tạo ra DNA tái tổ hợp. Vectơ sử dụng
là plasmit thích ứng của vi khuẩn E.coli. Sau đó, vectơ tái tổ hợp đƣợc biến nạp vào
tế bào chủ và tế bào chủ đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng thích hợp để nhân vi
khuẩn lên nhiều lần. Tế bào chủ ở đây là vi khuẩn E.coli. Cuối cùng qua các bƣớc
tách chiết DNA, ngƣời ta sẽ thu đƣợc một lƣợng lớn plasmit tái tổ hợp.
Các nhân tố nhƣ vectơ, tế bào chủ có thể thay đổi nhƣng tiến trình tách dòng
nói chung đƣợc thực hiện qua 4 bƣớc: xử lý DNA cần tạo dòng, tạo vectơ tái tổ hợp,
biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ, chọn dòng.
- Xử lý DNA cần tạo dòng

Vectơ tái tổ hợp đƣợc tạo ra bằng cách gắn gen quan tâm (đoạn DNA cần tạo
dòng) vào vectơ tách dòng. Thông thƣờng, sau khi chạy PCR với enzym Taqpolymerase, enzym này sẽ gắn thêm một nucleotit là Adenin vào đầu 3’ của đoạn
gen đƣợc nhân lên. Lợi dụng tính chất này, các nhà khoa học đã nghiên cứu, thiết kế
các thế hệ vectơ tách dòng có mang 1 nucleotit là Thymin ở đầu 5’ của vectơ đã
đƣợc mở vòng sẵn tại PCS (polycloning site- vùng nhân dòng đa điểm cắt). Hiện
nay, có rất nhiều vectơ tách dòng có điểm cắt này, nhƣ pBT, pCR®2.1- TOPO,
pGEM®-T...
Vectơ tách dòng và DNA cần tạo dòng đƣợc trộn chung theo một tỷ lệ nhất
định dƣới sự xúc tác của enzym T4 ligase, DNA sẽ đƣợc gắn vào vectơ theo nguyên
tắc bổ sung A – T tại vị trí mở vòng.
- Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ


26

27

2.2. HÓA CHẤT, THIẾT BỊ, ĐỊA ĐIỂM
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. Hóa chất
- Các cặp mồi dùng để tách dòng gen mã hóa protein vỏ và các phân đoạn
khác đƣợc tổng hợp bởi hãng Invitrogen (Mỹ). Các hóa chất sinh học phân tử và các
thiết bị đều đƣợc các hãng nổi tiếng nhƣ Fermentas (Đức), QIAGEN (Đức),
Invitrogen (Mỹ), BIONEER (Hàn Quốc)... cung cấp.

2.1. VẬT LIỆU
- Vật liệu thực vật sử dụng trong nghiên cứu là các mẫu lá lúa nghi nhiễm
bệnh VL&LXL đƣợc thu từ các tỉnh đại diện có tỷ lệ nhiễm bệnh từ trung bình
đến cao ở khu vực Nam Trung Bộ, mỗi tỉnh thu mẫu từ 2- 3 địa điểm khác nhau
(Hình 2.1).

- Thang DNA chuẩn (Fermentas, Invitrogen)
- QIAamp® Viral RNA Mini Kit (QIAGEN).
- Bộ hóa chất sử dụng cho RT-PCR (Invitrogen- Super ScriptTM III OneStep RT-PCR system with Platinium® Taq High Fidelity) (Invitrogen).
- Kit tinh sạch DNA (QIAquick Gel Extraction Kit- QIAGEN).
- Kit tách và tinh sạch plasmit (QIAprep Spin Miniprep- QIAGEN)

STT

Tên tỉnh thu
mẫu

4

5

Bình Thuận

BT

1
2

5

- Các hóa chất thông dụng khác nhƣ: Ampicillin, IPTG, X-gal, agarose, ...
(Merck, Sigma, Amersham Pharmacia Biotech).
- Các hóa chất cho phản ứng PCR, H2O khử DEPC.
- Vectơ pBT (Viện Công nghệ Sinh học).
2.2.2. Thiết bị
Máy ly tâm, máy soi gel, bộ điện di, tủ cấy vô trùng, máy chụp ảnh, pipet
man, máy PCR, máy xác định trình tự nucleotit tự động và các trang thiết bị khác.
2.2.3. Địa điểm nghiên cứu
- Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa
học và Công nghệ Việt Nam.
- Phòng thí nghiệm Di truyền học và Công nghệ gen, Trƣờng Đại học Sƣ
phạm, Đại học Thái Nguyên.

Hình 2.1. Các điểm thu mẫu lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL
tại Nam Trung Bộ

2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

i) Thu thập các trình tự gen quan tâm từ GenBank:
Trƣớc khi thiết kế đoạn mồi đặc hiệu cho gen và các trình tự cần phân lập
của các chủng virut nghiên cứu (Ví dụ: trình tự gen CP của RGSV), trình tự đoạn
gen này đƣợc thu thập từ GenBank tại địa chỉ www.ncbi.nlm.nih.gov [63]. Trình tự
của các đoạn gen quan tâm có thể tìm kiếm thông qua tên của gen hoặc số hiệu của
gen đƣợc đăng kí trong ngân hàng gen. Sau khi có đƣợc trình tự của gen quan tâm,
các đoạn primer sẽ đƣợc thiết kế bằng việc sử dụng các chƣơng trình thiết kế.
ii) Sử dụng các phần mềm thiết kết primer chuyên dụng nhƣ Primer3 để thiết
kế các đoạn primer đặc hiệu cho các đoạn gen quan tâm. Chƣơng trình Primer3
đƣợc
đăng
kí
tại
địa
chỉ
http://www.bioinformatics.nl/cgibin/primer3plus/primer3plus.cgi [67].
Trong quá trình thiết kế mồi cần căn cứ vào một số điểm sau: Mồi phải có độ
đặc hiệu và hiệu suất khuếch đại cao. Cố gắng chọn trì nh tƣ̣ mồi có khoảng 50%
GC khi đó Tm trong khoảng 56- 620C sẽ tạo điều kiện để quá trình ủ đạt kết quả tốt.
Tránh G và C ở đầu 3’ của mồi vì nó có thể làm tăng
cơ hội tạo ra hiện tƣợng
primer-dimers (hai primer bắt cặp với nhau ). Tránh chọn các vùng có trình tự tƣơng
đồng để hạn chế các mồi tƣ̣ gắn với nhau . Tính toán nhiệt độ nóng chảy (Tm) của
primer với tổng số 40C cho GC và 20C cho AT theo công thức T m = 4(G+C) +
2(A+T), sau đó trƣ̀ đi 50C tƣ̀ giá trị này và đây chí nh là nhiệt độ ủ (Ta) của primer
[30], [39].
2.3.3. Tách chiết RNA tổng số của virut ở lúa
RNA tổng số từ các mẫu lá lúa nghi nhiễm bệnh VL&LXL đƣợc tách chiết
theo hƣớng dẫn sử dụng hóa chất trizol reagents. Lá lúa (khoảng 200g) đƣợc nghiền
trong nitrogen thành bột mịn; Bổ sung 1 ml trizol reagents, đảo nhẹ ở nhiệt độ

v/p trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột; bổ sung 500µl dung dịch QG, ly tâm
13.000v/p trong 1 phút; thêm 750µl dung dich PE vào cột, để ở nhiệt độ phòng
trong 5 phút; ly tâm 13.000 v/p trong 1 phút, đổ dịch chảy qua cột, ly tâm bổ sung 1
phút để loại bỏ hết dung dịch PE; hòa tan DNA trong 30- 50µl nƣớc cất hoặc dung
dịch EB, đã đƣợc làm ấm đến 500C, để ở nhiệt độ phòng 1 phút, ly tâm 13.000v/p
để thu DNA.
- Gắn gen vào vectơ: Sản phẩm thôi gel đƣợc gắn vào vectơ pBT với sự xúc
tác của T4 ligase. Phản ứng gắn dựa vào sự hình thành mối liên kết photphodieste

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


30

31

giữa nucleotit Adenin của sản phẩm PCR và nucleotid Thymin của vectơ. Các thành
phần của vectơ pBT đƣợc thể hiện trong hình 2.2. Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở nhiệt
độ phòng trong 02 giờ để phản ứng xảy ra hoàn toàn. Vectơ tái tổ hợp sau đó đƣợc
biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α và đƣợc cấy trải trên môi trƣờng LB đặc
có bổ sung ampicillin 0,01mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM.

đó đặt vào đá 5 phút. Bổ sung 700µl môi trƣờng LB lỏng, hỗn hợp đƣợc nuôi ở
370C, lắc 200v/p trong 1 giờ. Sử dụng que cấy trải, trải 150- 250µl dịch khuẩn lên
đĩa môi trƣờng LB đặc có chứa 0,1mg/l ampicillin, X-gal 0,004‰, IPTG 100µM. Ủ
đĩa ở 370C trong 16 giờ.

Thành phần phản ứng gắn gen vào vectơ pBT: Buffer T4 ligase 10X (2µl);

15 phút (lặp lại ba lần, để trong đá lần thứ hai 30 phút, lần thứ ba 60 phút). Đổ dịch
CaCl2, hòa tan trong 1ml CaCl2/100ml LB ban đầu. Bổ sung 15- 20% glycerol. Chia
50µl dịch tế bào khả biến vào mỗi ống eppendorf 1,5ml. Bảo quản tế bào khả biến
trong tủ lạnh -840C.
- Biến nạp: Bổ sung 20µl vectơ tái tổ hợp vào ống đựng tế bào khả biến và
trộn nhẹ, đặt ngay vào đá trong 30 phút rồi ủ ở 420C chính xác trong 1,5 phút, sau

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

2.3.7. Colony-PCR

Khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu đƣợc chọn lọc và đánh số thứ tự, thực hiện
phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18 để xác định khuẩn lạc có plasmit mang
gen quan tâm. Sản phẩm colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9%
để chọn ra các khuẩn lạc mang gel có kích thƣớc nhƣ mong muốn, đồng thời nuôi
những khuẩn lạc này trong 3ml LB lỏng có bổ sung ampicillin 100mg/l để tách
plasmit.
Thành phần phản ứng colony-PCR: Dung dịch đệm PCR 10X (2µl); MgCl2
25mM (2µl); dNTPs 2,5mM (2µl); Mồi pUC18-xuôi 10 pmol/µl (1µl); Mồi pUC18ngƣợc 10 pmol/µl (1µl); DNA polymerase 1u/1µl (1 µl); H2O khử ion (11µl). Tổng
thể tích là 20µl.
Chu kỳ nhiệt của phản ứng colony-PCR: bƣớc 1: 950C, 5 phút; bƣớc 2: 940C,
30 giây; bƣớc 3: 520C, 30 giây; bƣớc 4: 720C, 3 phút; từ bƣớc 2 đến bƣớc 4 lặp lại

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn



trong 1 phút, loại bỏ dịch chảy qua cột, rửa cột QIAprep Spin Miniprep bằng cách
bổ sung 0,5ml buffer PB và ly tâm 13.000v/p trong 1 phút. Loại bỏ dịch chảy qua
cột. Bƣớc này là rất cần thiết để loại bỏ hoạt tính của nuclease khi sử dụng chủng
endA+ nhƣ JM, HB101 hoặc các thế hệ khác của nó hoặc các chủng dại mà có mức
độ hoạt tính cao của nuclease hoặc nồng đọ carbohydrate cao. Chủng tế bào chủ
nhƣ XL-1 và DH5α không cần thiết phải thực hiện bƣớc rửa này. Rửa cột QIAprep
Spin Miniprep bằng cách bổ sung 0,75ml buffer WP và ly tâm ở 13.000v/p. Loại bỏ
dịch chảy qua cột, và ly tâm bổ sung 13.000v/p trong 1 phút để loại bỏ hết buffer
rửa. Chuyển cột sang một ống eppendorf 1,5ml mới. Hòa tan DNA bằng cách bổ
sung 50µl EL hoặc nƣớc cất tới tâm của mỗi cột QIAprep Spin Miniprep, để ở nhiệt
độ phòng 1 phút rồi ly tâm ở 13.000v/p trong 1 phút. Tiến hành điện di kiểm tra sản
phẩm tinh sạch plasmit trên gel agarose 0,9%.

Thành phần phản ứng cắt bằng enzym giới hạn : DNA plasmit 2,5- 3 µg/µl
(5µl); Enzym 10u/µl (1µl); Dung dịch đệm 10X (1µl); H2O khử ion (3,5µl ). Tổng
thể tích là 10µl.
2.3.10. Xác định trình tự và so sánh trình tự gen thu đƣợc với các trình tự
tƣơng ứng trên GenBank
Tách dòng và xác định trình tự gen: Sản phẩm PCR đƣợc gắn vào trong
vector tách dòng pBT [4] và biến nạp vào tế bào khả biến E. coli DH5α. Chọn lọc
các khuẩn lạc xanh/trắng trên môi trƣờng thạch LB có bổ sung 50 mg/l Ampicilin,
0,004% X-gal và 0,1 mM IPTG. Tách chiết plasmit theo hƣớng dẫn sử dụng của
Plasmit Extraction Kit. Kiểm tra sự có mặt của DNA tái tổ hợp bằng phƣơng pháp
colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngƣợc. Chọn các mẫu plasmit tái
tổ hợp có kích thƣớc nhƣ mong muốn để tinh sạch và xác định trình tự trên máy tự
động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Sử dụng các phần mềm DNAstar,
BioEdit và MEGA 4 để so sánh các trình tự gen và dựng cây phát sinh chủng loại theo
phƣơng pháp tối đa (Maximum Parsimony (MP)) trên cở sở các số liệu thu đƣợc qua so
sánh các trình tự gen.


tại các tỉnh Nam Trung Bộ, chúng tôi đã lựa chọn gen CP và các đoạn có trình tự
bảo thủ cao khác. Các cặp mồi đƣợc thiết kế thể hiện trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. Trình tự mồi sử dụng để nhân một số đoạn trong genome RGSV.
STT
1
2
3

Tên mồi

Chiều dài
gen (bp)

Trình tự mồi

RNA1-RGSV- xuôi

5’-CAAACATCCTCCCAAGCATTI-3’

RNA1-RGSV- ngƣợc

5’-ATGATCCAACGAGGAACTGGI-3’

RNA4-RGSV-xuôi

5'-AGCTGCCACTCAAGGTGTTTI-3'

RNA4-RGSV- ngƣợc

5'-GAGCTAGTGGGTGGTTCTCGI-3'

Hình 3.1. Điện di sản phẩm RT-PCR phân đoạn 1 và 4 của RGSV từ mẫu BT
bằng 2 cặp mồi RNA1-RGSV và RNA4-RGSV.
M. Thang chuẩn 1Kb; (-). Đ/c âm; (+). Đ/c dƣơng;
1. Phân đoạn1; 2. Phân đoạn 4.

Hình 3.1 cho thấy khi điện di sản phẩm RT-PCR từ các phân đoạn của
RGSV, tại giếng đối chứng âm không lên băng chứng tỏ thành phần phản ứng
không nhiễm DNA hoặc RNA, giếng đối chứng dƣơng lên 1 băng có kích thƣớc
khoảng 500bp (kết quả PCR từ plasmit mang đoạn DNA có kích thƣớc 500bp)
chứng tỏ phản ứng diễn ra tối ƣu. Giếng số 1 xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng
423bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc phân đoạn RNA1-RGSV. Giếng số 2 xuất hiện
băng có kích thƣớc khoảng 441bp tƣơng đƣơng với kích thƣớc phân đoạn RNA4RGSV. Nhƣ vậy, khi thực hiện phản ứng PCR bằng 2 cặp mồi đặc hiệu với phân
đoạn 1 và phân đoạn 4 của RGSV là RNA1-RGSV và RNA4-RGSV với mẫu RNA
phân lập từ lúa của tỉnh Bình Thuận đều thu đƣợc các băng điện di có kích thƣớc
nhƣ mong muốn.
Kết quả hình 3.2 cho thấy tại giếng số 1 không lên băng, trong khi tại giếng
số 2 xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 1Kb tƣơng đƣơng với băng đối chứng
dƣơng. Nhƣ vậy, khi thực hiện phản ứng RT-PCR bằng cặp mồi CP-RGSV-xuôi và
CP-RGSV-ngƣợc với các mẫu lúa BĐ và NT, chỉ mẫu NT thu đƣợc băng có kích
thƣớc phù hợp với đoạn gen CP của RGSV.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


36

37



http://www.lrc-tnu.edu.vn

Sau khi biến nạp vectơ vào tế bào khả biến E.coli DH5α bằng phƣơng pháp
sốc nhiệt, đĩa petri đƣợc ủ ở 370C trong 16 giờ. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình
3.4. Kết quả thu đƣợc gồm khuẩn lạc xanh và trắng. Toàn bộ khuẩn lạc phát triển
trên môi trƣờng có ampicillin đều là khuẩn lạc mang plasmit biến nạp. Vì sự có mặt
của gen kháng ampicillin trong plasmid biến nạp mà những vi khuẩn này có thể
phát triển trên môi trƣờng có ampicillin. Để kiểm tra các khuẩn lạc trắng chứa
plasmit mang đoạn DNA quan tâm, chúng tôi lựa chọn từ mỗi đĩa khuẩn một số
khuẩn lạc trắng để thực hiện phản ứng colony-PCR với cặp mồi pUC18-xuôi và
pUC18-ngƣợc.
3.2.3. Chọn lọc plasmit tái tổ hợp bằng colony-PCR
Chọn 4 đến 7 khuẩn lạc trắng của mỗi mẫu để chạy phản ứng colony-PCR
với cặp mồi pUC18-xuôi và pUC18-ngƣợc để xác định khuẩn lạc có plasmit mang
đoạn DNA mong muốn. Vì hai mồi nằm trên vectơ nên kích thƣớc của đoạn DNA

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


38

39

đƣợc khuếch đại sẽ lớn hơn đoạn DNA mong muốn khoảng 0,2Kb [4]. Sản phẩm
colony-PCR đƣợc điện di kiểm tra trên gel agarose 0,9% (Hình 3.5, Hình 3.6).

Dựa vào kết quả điện di trên hình 3.6 thấy rằng, các giếng số 1, 2, 6 và 13

tiến hành tách plasmit theo bộ kit QIAprep Spin Miniprep nhƣ đã trình bày ở mục
2.3.8. Để kiểm tra sản phẩm tách plasmit và khẳng định một lần nữa sự có mặt của
đoạn DNA quan tâm trong plasmit đã đƣợc tinh sạch, plasmit đƣợc cắt bằng enzym
cắt BamHI. Kết quả đƣợc thể hiện trong hình 3.7 và 3.8.

~ 2,7 Kb

0,5 Kb

~1Kb
Hình 3.7: Điện di sản phẩm cắt plasmit mang
phân đoạn 1 và 4 của RGSV tại Bình Thuận bằng BamHI
Hình 3.6. Điện di sản phẩm colony-PCR các dòng
RGSV bằng cặp mồi pUC 18.
M: Thang chuẩn 1 Kb; (-): Đ/c âm; (+): Đ/c dƣơng; 1, 2, 3, 4, 5, 6: mẫu NT;
7, 8, 9, 10, 11, 12, 13: mẫu BT.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

M: Thang chuẩn 100 bp; 1. phân đoạn 1; 2. phân đoạn 4.

Hình 3.7 cho thấy các giếng số 1, 2 đều xuất hiện 2 băng trong đó 1 băng có
kích thƣớc khoảng 2,7 Kb phù hợp với kích thƣớc của vectơ pBT. Băng còn lại lần

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


RNA1-RGSV

Bình Thuận

FM995215

2

RNA4-RGSV

Bình Thuận

FN179368

3

CP-RGSV

Bình Thuận

FM882251

4

CP-RGSV

Ninh Thuận

FM882252


gen CP-RGSV. Các trình tự thu đƣợc đƣợc đăng ký vào GenBank với mã số nhƣ
trong bảng 3.2.
3.4. SO SÁNH TRÌNH TỰ GEN CP-RGSV CỦA HAI TỈNH NINH THUẬN VÀ
BÌNH THUẬN VỚI CÁC TRÌNH TỰ TƢƠNG ỨNG TRÊN GENBANK
Kết quả ở bảng 3.3, hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự của gen CP- RGSV là
rất cao (96,5%- 99,9%) cho thấy gen CP- RGSV có mức độ bảo thủ cao. Đặc biệt,
hệ số tƣơng đồng giữa hai trình tự Ninh Thuận và Bình Thuận với các trình tự
tƣơng ứng đem so sánh đạt từ 98,0- 99,9%. Trong đó, hai trình tự này giống nhất
với trình tự VL2 (EU076544) của tỉnh Vĩnh Long (99,9%) và khác nhất với trình tự
CN(AF290947) của Trung Quốc (98,0%).

Căn cứ vào kích thƣớc thấy rằng các phân đoạn 1, 4 của RGSV từ mẫu BT
thu đƣợc sau khi xác định trình tự phù hợp với kích thƣớc lý thuyết khi thiết kế mồi.
Khi so sánh các trình tự này bằng cách Blast trên NCBI thấy rằng, hệ số tƣơng đồng

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


43

Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo phƣơng pháp Bootstrap của
phần mềm MEGA4 sử dụng kết quả so sánh ClustalW trình tự các gen CP-RGSV
của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận với trình tự của một số trình tự tƣơng ứng đại
diện cho các dòng RGSV khác nhau tại Việt Nam và trên thế giới (Hình 3.9).

LA(FN433644): Long An; LA(GQ329710): Long An; NT(FM882252): Ninh Thuận,
ST1(EU076537): Sóc Trăng1, ST2(EU076538): Sóc Trăng2, TG1(EU076539): Tiền
Giang1, TG2(EU076540): Tiền Giang2, TV1(EO076541): Trà Vinh1, TV2(EU076542):
Trà Vinh2, VL1(EU076543): Vĩnh Long1, VL2(EU076544): Vĩnh Long2.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


44

45

Qua hình 3.9 thấy rằng cây phát sinh chủng loại đƣợc chia thành hai nhánh chính
là: nhánh gồm các trình tự gen CP-RGSV của thế giới và nhánh gồm các trình tự
gen CP-RGSV của Việt Nam. Nhánh gồm các trình tự của Việt Nam lại đƣợc chia
thành hai nhánh nhỏ, trong đó hai trình tự gen phân lập tại hai tỉnh Nam Trung Bộ
thuộc nhánh nhỏ thứ hai gồm các trình tự: VL1, VL2, BL2, TG2, DT1, TV2
(ĐBSCL) và NT, BT (Nam Trung Bộ). Nhƣ vậy, hai dòng RGSV phân lập từ các
tỉnh Nam Trung Bộ có quan hệ gần gũi với các dòng RGSV phân lập từ ĐBSCL,
đặc biệt là với tỉnh Vĩnh Long và có sự khác biệt nhỏ với nhóm của thế giới. Vì vậy,
có thể giả thiết rằng các chủng virut RGSV phân lập đƣợc từ Ninh thuận và Bình
Thuận có quan hệ về nguồn gốc với các trình tự của gen CP- RGSV phân lập từ
ĐBSCL. Đồng thời, có thể thấy rằng các dòng virut phân lập tại Việt Nam (ĐBSCL
và Nam Trung Bộ) đều có nguồn gốc nội địa, nhƣ vậy dịch bệnh VL&LXL tại các
khu vực nghiên cứu của Việt Nam do virut nội địa gây ra chứ không phải do virut
ngoại lai xâm nhập vào.

Mặc dù số vị trí sai khác là rất lớn (20/978 = 2,05%), nhƣng cả trình tự của


Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn


46

47

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU ĐÃ CÔNG BỐ

1. Kết luận
1> Đã hoàn thiện và tối ƣu phản ứng RT-PCR với các cặp mồi đƣợc thiết kế
đặc hiệu để phát hiện virut RGSV với độ đặc hiệu cao.
2> Đã tách dòng, xác định trình tự các phân đoạn 1, 4 RGSV của mẫu lúa
Bình Thuận và gen CP- RGSV từ mẫu lúa của hai tỉnh Ninh Thuận, Bình Thuận.
Kích thƣớc của gen CP đã đƣợc xác định trình tự đầy đủ là 978 nucleotit, của các
phân đoạn 1 và 4 lần lƣợt là 423 và 441 nucleotit. Mã số đăng ký trên GenBank của
các trình tự thu đƣợc là: FM995215, FN179368, FM882251, FM882252.
3> Hệ số tƣơng đồng giữa các trình tự của gen CP- RGSV là rất cao (96,5%99,9%) cho thấy gen CP- RGSV có mức độ bảo thủ cao. Đặc biệt, hệ số tƣơng đồng
giữa hai trình tự Ninh Thuận và Bình Thuận với các trình tự tƣơng ứng đem so sánh
đạt từ 98,0- 99,9%. Trong đó, hai trình tự này giống nhất với trình tự VL2
(EU076544) của tỉnh Vĩnh Long (99,9%) và khác nhất với trình tự CN(AF290947)
của Trung Quốc (98,0%).
4> So sánh trình tự gen CP- RGSV Bình Thuận và Ninh Thuận với trình tự
tƣơng ứng của Trung Quốc thấy 20 điểm sai khác phân bố khá đều trên gen và dẫn
đến 2 sự sai khác có ý nghĩa trong hai chuỗi polypeptit do gen này mã hóa.

Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên

http://www.lrc-tnu.edu.vn