TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------

Nguyễn Thị Ngọc Hà

PHÂN TÍCH PROTEOMICS MÔ UNG THƯ CỦA BỆNH NHÂN
UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 30

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

PGS.TS. Trịnh Hồng Thái

Hà Nội


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS. TS. Trịnh Hồng Thái, người thầy
đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu khoa
học và thực hiện luận văn này.
Tôi cũng xin trân trọng cảm ơn các thầy giáo, cô giáo trong khoa Sinh học,
trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong suốt
thời gian học tập tại Trường.
Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các anh, chị, các bạn sinh viên làm
việc tại Phòng Proteomics và Sinh học Cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng
điểm Công nghệ Enzyme và Protein đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và thực hiện luận văn tại Phòng.

2.2.3. Điện di hai chiều............................................................................................................32
2.2.4. Phân tích hình ảnh bản gel điện di hai chiều .................................................................34
2.2.5. Cắt và thủy phân spot....................................................................................................36
2.2.6. Phân tích khối phổ và nhận dạng protein......................................................................37
Chương 3 - KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.................................................................................................39
3.1. TÁCH CHIẾT PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG .....................................................................39
3.2. PHÂN TÁCH PROTEIN MÔ ĐẠI TRỰC TRÀNG TRÊN BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU .................42
3.3. PHÂN TÍCH HÌNH ẢNH BẢN GEL ĐIỆN DI HAI CHIỀU.............................................................44
Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel mô ung thư đại trực tràng so với bản
gel mô đại trực tràng bình thường của các bệnh nhân, chúng tôi nhận thấy có 43 spot biểu hiện


khác chung bao gồm 16 spot biểu hiện tăng, 17 spot biểu hiện giảm và 10 spot không xuất hiện
ở bản gel mô ung thư đại trực tràng...........................................................................................48
3.4. XÁC ĐỊNH PROTEIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP MALDI-TOF MS..................................................48
3.5. ĐẶC ĐIỂM, VAI TRÒ CỦA CÁC PROTEIN BIỂU HIỆN KHÁC BIỆT ............................................52
3.5.1. Protein liên quan đến chu trình tế bào và apoptosis.....................................................56
3.5.2. Protein liên quan đến quá trình miễn dịch và bảo vệ cơ thể.........................................57
3.5.3. Protein tham gia cấu trúc tế bào..................................................................................60
3.5.4. Protein tham gia các quá trình trao đổi chất.................................................................62
3.5.5. Protein liên quan đến quá trình phiên mã, dịch mã, cải biến sau phiên mã, dịch mã....62
KẾT LUẬN.........................................................................................................................................65
KIẾN NGHỊ........................................................................................................................................66
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................................................66
PHỤ LỤC 1. DANH SÁCH BỆNH NHÂN UNG THƯ ĐẠI TRỰC TRÀNG ĐƯỢC SỬ DỤNG TRONG
NGHIÊN CỨU......................................................................................................................................i
PHỤ LỤC 2. KẾT QUẢ NHẬN DIỆN PROTEIN BẰNG CƠ SỞ DỮ LIỆU NCBI SỬ DỤNG PHẦN MỀM
MASCOT.............................................................................................................................................ii
§ Mascot Search Results....................................................................................................................ii
Mascot Score Histogram............................................................................................................ii

Điện di hai chiều (Two - Dimensional Electrophoresis)
Ammonium Bicarbonate
Acetonitrile
Hội chứng đa polyp tuyến nhẹ di truyền (Attenuated Familial
Adenomatous Polypsis)
Adenomatous Polyposis Coli
3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonic acid
α-Cyano-4-hydroxycinnamic acid
Kháng nguyên phôi thai (Carcinoembryonic Antigen)
Cytokeratin
Cộng sự
Dalton
Dithiothreitol
Enzyme-linked immunosorbent assay
Hội chứng đa polyp tuyến gia đình (Familial Adenomatous
Polyposis)
Suppressor of tumorigenicity 20 protein
Hội chứng ung thư đại tràng di truyền không phải đa polyp
(Hereditary Nonpolyposis Colon Cancer)
Protein sốc nhiệt (Heat sock protein)
Tổ chức nghiên cứu hệ protein người

IAA
IEF
IPG
LC-MS/MS

(Human Proteome Organisation)
Iodoacetamide
Điện di phân vùng đẳng điện (Isoelectric Focusing)

SELDI-TOF
Spot
TAA
TFA
TNM

(SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
Surface-enhanced laser desorption/ionization time - of - flight
Điểm protein
Kháng nguyên liên quan đến khối u (Tumor Associated Antigens)
Trifluoroacetic acid
Tumor – Lympho node – Metastases


DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1

Các giai đoạn bệnh trong TNM và tỉ lệ sống sót ở các giai đoạn bệnh

Bảng 2
Bảng 3
Bảng 4
Bảng 5

khác nhau
Các hóa chất chính sử dụng trong nghiên cứu
Các bước chạy điện di đẳng điện trên thanh IPG strip dài 17cm
Số lượng spot protein phân tách trên bản gel điện di hai chiều
Thống kê các spot protein biểu hiện khác biệt trên bản gel điện di hai



polyacrylamide 10% có SDS
Điện di kiểm tra mẫu tủa của phân đoạn dịch chiết protein PBS 1 và lysis 1

Hình 6

từ mô đại trực tràng bình thường và mô ung thư đại trực tràng
Phân tách protein mô đại trực tràng của bệnh nhân mã số 11781 trên

Hình 7

bản gel điện di hai chiều
Minh họa các spot biểu hiện khác biệt trên bản gel mô ung thư so với

Hình 8

mô bình thường
Các spot protein biểu hiện khác biệt giữa bản gel điện di hai chiều của
mẫu mô ung thư đại trực tràng so với mẫu mô đại trực tràng bình

Hình 9

thường của bệnh nhân ung thư đại trực tràng mã số 11781
Phân tích khối phổ các peptide thu được sau khi thủy phân protein

Hình 10

T17B33 bằng enzyme trypsin
Kết quả nhận dạng protein bằng tra cứu cơ sở dữ liệu NCBI sử dụng


bnh ung th i trc trng v con s ny ngy cng gia tng. Tớnh n thỏng 9 nm
2009, ó cú n trờn 220 bnh nhõn mi n iu tr ung th i trc trng ti õy
[54]. T l mc ung th i trc trng l 9% tng s bnh nhõn ung th [55].
Vic chn oỏn v phỏt hin sm ung th i trc trng cú ý ngha rt quan
trng, giỳp lm tng hiu qu iu tr bnh, gim t l t vong do loi ung th ny
gõy ra. Thc t cho thy, nu phỏt hin khi u i trc trng giai on u v cha
tr kp thi thỡ t l sng sút ca bnh nhõn sau 5 nm s l 80 100%. Hin nay,
mt s phng phỏp xột nghim lõm sng ang c ỏp dng chn oỏn ung th
i trc trng nh chn oỏn hỡnh nh thụng quan ni soi, sinh thit, chp X quang,
xột nghim tỡm mỏu trong phõn, thm khỏm trc tip, s dng ch th CEA. Nhc
im ca cỏc phng phỏp ny l thng phỏt hin bnh giai on mun, phng
phỏp ni soi thng gõy khú chu cho bnh nhõn, xột nghim mỏu trong phõn cho
nhiu kt qu dng tớnh v õm tớnh gi nờn hiu qu chn oỏn v iu tr bnh
khụng cao. Vỡ vy, nhu cu t ra cho cỏc nh khoa hc l lm th no tỡm ra
c cỏc ch th sinh hc c trng chn oỏn, phỏt hin ung th i trc trng
giai on sm.
Hin nay, mt trong nhng hng nghiờn cu ch th sinh hc cho ung th
1


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

i trc trng ang c cỏc nh khoa hc quan tõm l s dng cụng c proteomics.
Bng vic phõn tớch s bin i trong thnh phn, s lng cỏc protein cú mt trong
huyt thanh, dch c th, mụ ung th ca bnh nhõn ung th, cỏc nh khoa hc hi
vng tỡm ra c cỏc ch th sinh hc mi, d nhn bit ng dng chn oỏn ung
th i trc trng giai on sm, nhm phc v cụng tỏc chn oỏn, iu tr bnh
mt cỏch hiu qu.

i trng, ung th phỏt sinh t gan c gi l ung th gan [48].
Ung th l mt trong 8 nguyờn nhõn gõy cht i vi nhõn loi trờn ton th
gii. S lng ngi t vong do ung th cũn ln hn s lng t vong do nhim
HIV, lao v st xut huyt cng li. i vi cỏc nc cú nn kinh t phỏt trin, ung
th l nguyờn nhõn gõy t vong hng u. i vi cỏc nc ang phỏt trin, ung
th l nguyờn nhõn gõy t vong th hai, sau bnh tim mch [45]. Nm 2008, c
tớnh cú khong 12,66 triu ngi mc ung th v 7,56 triu ngi cht do cn bnh
ny. Trong ú 4 loi ung th l ung th phi, ung th vỳ, ung th d dy v ung th
i trc trng chim 2/5 tng s ca mc ung th trờn th gii [45].
Ung th i trc trng l loi ung th ph bin nht trong cỏc loi ung th
ng tiờu húa [28], bao gm ung th i trng v ung th trc trng c gi theo
tờn ca mụ, ni phỏt sinh ung th. i trng v trc trng l mt phn ca h tiờu
húa. i trc trng (hay cũn gi l rut gi) l phn cui ca ng tiờu húa ngi,
gm cú i trng (hay cũn gi l rut kt) v trc trng (hay cũn gi l rut thng).
i trng chia ra lm nhiu phn: manh trng, i trng lờn, i trng ngang, i
trng xung v i trng sigma (Hỡnh 1). Trc trng nm ngay trc hu mụn. Ung
th xy ra i trng gi l ung th i trng v ung th xy ra trc trng gi l
ung th trc trng. Ung th i trng xy ra thng xuyờn hn ung th trc
3


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

trng [21Error: Reference source not found].

Hỡnh 1. Hỡnh nh i trc trng [57]

Ung th i trc trng xy ra khi mt s t bo lp lút trong (cũn gi l niờm

ung th. S ca t vong do ung th i trc trng trong nm 2008 l 610.000 ca trờn
ton th gii, chim khong 8% s lng t vong do ung th [16, 45].
Ung th i trc trng thng gp cỏc nc phỏt trin nhiu hn cỏc nc
ang phỏt trin. Nm 2008, 60% cỏc ca c chn oỏn ung th i trc trng l
cỏc nc phỏt trin [16]. T l bnh nhõn mc ung th i trc trng cng tng lờn
cỏc khu cụng nghip v thnh th.
T l ung th i trc trng cỏc nhúm tui khỏc nhau l khỏc nhau. S lng
ngi mc ung th i trc trng nhúm tui trờn 75 tui l cao nht
(250/100.000/nm). Ung th i trng ớt xy ra tui di 45 tui v t l ny l
2/100.000/nm. nhúm tui t 45 n 54, t l mc ung th i trng l
20/100.000/nm. Nhúm tui t 55 n 64, t l mc ung th i trng l
55/100.000/nm. Nhúm tui t 65 n 74, t l ny l 150/100.000/nm [21Error:
Reference source not found, 30].
Ti Vit Nam, ung th i trc trng l loi ung th ng th nm trong cỏc
loi ung th thng gp, sau ung th d dy, phi, vỳ, vũm hng v bnh ny cú xu
hng ngy cng tng cao. Theo thng kờ ca Bnh vin Ung Bu TPHCM, nm
2007, bnh vin cú 218 ca bnh ung th i trc trng. Nm 2008 con s ny l 306
ca v tớnh n thỏng 9 nm 2009, ó cú n trờn 220 bnh nhõn mi n iu tr ung
th i trc trng [54]. Theo thng kờ ca Bnh vin K, t l mc ung th i trng
5


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

l 9% tng s bnh nhõn ung th [55]. Theo mt nghiờn cu c tin hnh ti
Bnh vin Ung bu Cn Th, tui mc ung th i trng trung bỡnh ca cỏc
bnh nhõn iu tr ung th i trc trng õy l 54 tui, t l mc bnh nam/n l
1,34 [3].

ng [22]. Mc nguy c s gim trung bỡnh l 40% n 50% nu c th cú mt
ch vn ng hp lý.
Ngoi ra, nguy c mc ung th i trc trng cng tng lờn nhng ngi hỳt
thuc. nhng bnh nhõn ung th i trc trng s dng thuc lỏ, nguy c tỏi phỏt
ung th i trc trng sau khi ct b polyp cng tng lờn.
Hu ht ung th i trc trng phỏt trin t polyp i trc trng. Do ú, vic
loi b cỏc polyp lnh tớnh l mt bin phỏp cú th phũng nga ung th i trc
trng. Cỏc polyp cú th phỏt trin thnh ung th khi cú s tn thng nhim sc th
xy ra cỏc t bo ti niờm mc ca i trc trng. Nhng tn thng ny to ra
nhng t bo bt thng. Cỏc t bo khi ó tớch ly cỏc tn thng nhim sc th thỡ
s phỏt trin khụng kim soỏt c hỡnh thnh ung th. Nh vy, polyp i trc
trng ban u l lnh tớnh, sau ú do s tớch ly cỏc tn thng v nhim sc th
nờn phỏt trin thnh ung th.
Cỏc nghiờn cu ch ra rng cú mi liờn h gia ung th i trng v chng
viờm i trng. Nguy c mc ung th i trng tng lờn sau 8 10 nm b viờm i
trng. Theo c tớnh hin nay, t l mc ung th i trng cú liờn quan n viờm
loột i trng l 2,5% sau 10 nm, 7,6% sau 30 nm v 10,8% sau 50 nm. Ngoi
ra, nguy c mc ung th i trng cng ph thuc vo v trớ v mc viờm loột i
trng [52].
Cỏc yu t di truyn
Trng hp ung th i trc trng liờn quan n bnh s ung th trong gia
ỡnh ch chim khong 20% trong tt c cỏc trng hp mc bnh. Trong ú, ch cú
5% cỏc trng hp l do di truyn cỏc gen gõy ung th t b, m sang con cỏi. S
bin i gen dn n s hỡnh thnh polyp v sau ú hỡnh thnh ung th. Nhng a
tr b di truyn nhng gen gõy ung th t b m cú nguy c cao b ung th giai
on sm ca cuc i.
Hi chng a polyp tuyn gia ỡnh (Familial Adenomatous Polyposis FAP)
l hi chng m cỏc thnh viờn trong gia ỡnh xut hin hng trm n hng nghỡn
7


H thng phõn loi theo Duke [12]
Nm 1932, Cuthbert E. Dukes, mt nh gii phu ngi Anh ó a ra h
thng phõn loi giai on cho ung th trc trng. Theo h thng phõn loi ny, ung
8


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

th trc trng c chia ra thnh 4 giai on:
Duke A: Khi u b gii hn thnh ca trc trng.
Duke B: Khi u xõm ln qua thnh ca trc trng nhng cha nh hng n
cỏc hch bch huyt.
Duke C: Khi u lan ti cỏc hch bch huyt cnh trc trng.
Duke D: Khi u di cn ti cỏc b phn khỏc trờn c th nh thn, gan,
phi
Cho ti nay, trờn th gii xut hin mt vi ci bin cho h thng phõn loi
Duke. Tuy nhiờn, h thng phõn loi ny gn nh ang c thay th bng h thng
phõn loi chi tit hn, ú l h thng phõn loi TNM.
H thng phõn loi TNM
H thng phõn loi ung th i trc trng TNM (Tumor Lympho node
Metastases) l h thng c s dng ph bin nht hin nay, do y ban Ung th
Hoa K sỏng lp. H thng phõn loi TNM phõn giai on ung th i trc trng
da vo kớch thc khi u (T), mc lõy lan ca khi u ti cỏc hch bch huyt
(N) v mc di cn ti cỏc c quan khỏc ca c th (M). Con s c thờm vo
phớa sau mi ch cỏi cho bit kớch thc hoc phm vi ca khi u v mc di cn.
T- Khi u nguyờn phỏt (Primary Tumor)




N0: Khụng cú hch bch huyt vựng liờn quan.



N1, N2, N3: Cú hch bch huyt vựng liờn quan (s lng hch bch

huyt).
M - Di cn (Distant Metastasis)


Mx: Khụng th ỏnh giỏ c mc di cn xa.



M0: Khụng cú di cn xa.



M1: Cú di cn xa.
nhiu loi ung th, cỏc cỏch phi hp TNM ny tng ng vi mt trong 5

giai on (hỡnh 2). Cỏc loi ung th khỏc nhau cú nhng tiờu chun phõn giai on
khỏc nhau. Chng hn nh ung th bng quang T3N0M0 c xp vo giai on III
trong khi ú ung th i trng T3N0M0 ch c xp giai on II.

Hỡnh 2. Cỏc giai on phỏt trin ca ung th i trc trng [50]

10


niờm mc ca i trc
trng

T12N0M0

8095%

Giai on

Mụ t

Giai on
0

Giai on
I

Hỡnh nh

11


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

TNM

Kh nng
sng sút


T12N1M0

5560%

T34N1M0

3542%

T bt k,
N2M0

2527%

T bt k,
N bt k,
M1

07%

Giai on

Mụ t

Giai on
IIA
Giai on
IIB
Giai on
IIIA

th t bo v ch th th dch. Ch th ung th dng t bo bao gm cỏc khỏng nguyờn
b mt cỏc t bo, cỏc th th hormone v th th yu t tng trng, nhng bin
i ADN, mARN, yu t phiờn mó ca t bo. Ch th ung th dng th dch bao
gm cỏc cht c phỏt hin nng bt thng cú mt trong huyt thanh, nc
tiu v cỏc loi dch khỏc ca c th [2]. Mt ch th ung th lý tng l ch th cú
th d dng xỏc nh c, cho kt qu ỏng tin cy, cỏc xột nghim s dng loi
ch th ny cú c hiu v nhy cao, chi phớ thp. Ngoi ra, ch th ung th lý
tng l loi ch th xut hin vi s lng cú th nh lng c trong giai on
u hoc giai on tin lõm sng. Hm lng ca ch th ung th s phn ỏnh mc
phỏt trin ca ung th [53].
Mt trong nhng thỏch thc t ra l lm th no xõy dng c mụ hỡnh
xột nghim s dng ch th ung th mt cỏch n gin, m bo nhy, c
hiu, chi phớ thp m vn cú giỏ tr lõm sng. Theo Hip hi phỏt trin v nghiờn
cu ch th ung th Hoa K, ch th sinh hc i vi ung th i trc trng cú th
13


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà

chia ra lm nhiu loi tuy theo mc ớch ng dng nh sau:
- Ch th sinh hc c s dng ỏnh giỏ nguy c, d oỏn bnh. Ch th
ny cú th c s dng xỏc nh nhng cỏ nhõn hay qun th cú nguy c cao
mc bnh. Ch th ny cú th l cỏc bin i di truyn hay ỏnh giỏ vic tip xỳc vi
c cht lm tng mc nguy c. Vớ d v loi ch th ny l t bin gen c ch
khi u APC (Adenomatous Polyposis Coli) c ng dng chn oỏn nhng
ngi cú hi chng a polyp tuyn di truyn (FAP).
- Ch th sinh hc c ng dng sng lc v chn oỏn giai on sm
ca bnh. Cỏc ch th ny giỳp h tr vic chn oỏn bnh giai on sm, t ú cú

trng .
- Ch th sinh hc c ng dng tiờn lng bnh, d oỏn tin trỡnh
phỏt trin ca bnh. Cỏc ch th ny s phn ỏnh kh nng di cn, mc lan rng
ca khi u. Cú nhiu loi ch th sinh hc c phỏt hin v xut ng dng trong
tiờn lng ung th nhng cỏc ch th ny u cha c thm nh [29].
1.2.2. Cỏc k thut sinh hc phõn t c ng dng nghiờn cu ch
th sinh hc ung th
Hiờn nay, ụi vi bờnh ung th ai trc trang, ni soi trc trng vn c coi
l phng phỏp vng trong chn oỏn bnh. Tuy nhiờn, õy l phng phỏp thm
khỏm trc tip, cú th gõy khú chu cho bnh nhõn. Mt phng phỏp khỏc hin
ang c s dng rng rói l xet nghiờm CEA. Protein nay thng c tỡm thy
trong mụ ca bo thai phỏt trin trong t cung. Nng trong mỏu ca protein ny
bin mt hoc gim xung rt thp sau khi sinh. ngi ln, hm lng CEA tng
lờn bt thng cú th c coi l ch th sinh hc ca ung th i trc trng. Tuy
nhiờn, phng phỏp xột nghim ỏnh giỏ hm lng CEA cú trong mỏu cú hn
ch l ch chn oỏn c bnh giai on mun (giai on III, IV). Hn na,
nhy v c hiu ca phng phỏp ny khụng cao v hm lng CEA cng cú
th tng lờn nhng ngi b viờm loột i trng, viờm ty, viờm gan, bnh Crohn
hoc nhng ngi hay hỳt thuc lỏ. Do vy, hiu qu ng dng CEA trong chn
oỏn ung th i trc trng l khụng cao v chi phớ xột nghim tng i tn kộm.
Phng phỏp xột nghim mỏu trong phõn l phng phỏp nhm mc ớch
phỏt hin cú mỏu trong phõn hay khụng. Hin tng trong phõn cú mỏu l triu
chng thng gp ca cỏc ca ung th i trc trng. Tuy nhiờn, phng phỏp ny
li cú mt t l cỏc kt qu dng tớnh gi v õm tớnh gi rt cao.
15


Luận văn thạc sĩ

Nguyễn Thị Ngọc Hà