ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

=======

VŨ ANH PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG PARAQUAT
TRONG MẪU HUYẾT TƯƠNG NGƯỜI BẰNG
PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã số: 60440118

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS.TS. TẠ THỊ THẢO
2. TS. HÀ TRẦN HƯNG

HÀ NỘI - 2015


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên cho tôi gửi lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS Tạ Thị Thảo và
TS. Hà Trần Hưng đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt
quá trình thực hiện đề tài và viết luận văn.
Tôi xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới ban lãnh đạo và toàn thể nhân
viên Trung tâm Chống Độc – Bệnh viện Bạch Mai đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi
được học tập và nghiên cứu.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô giáo giảng dạy tại khoa Hoá, đặc
biệt là các thầy cô trong bộ môn Hoá Phân tích, đã cho tôi những kiến thức quý giá

1.2.2. Phương pháp sắc ký khí khối phổ ............................................................10
1.2.3. Phương pháp sắc ký lỏng khối phổ ..........................................................11
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ..................................................13
1.3. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat ........................15
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................19
2.1. Đối tượng nghiên cứu .....................................................................................19
2.2. Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị..........................................................................19
2.2.1 Chất chuẩn .................................................................................................19
2.2.2 Hoá chất .....................................................................................................19
2.2.3. Thiết bị, dụng cụ .......................................................................................20
2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................21
2.3.1. Nghiên cứu xây dựng quy trình định lượng paraquat. .............................21
2.3.1.1. Chuẩn bị mẫu chuẩn...........................................................................21
2.3.1.2. Phương pháp tách PQ từ huyết tương ................................................21

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


2.3.1.3. Phương pháp khảo sát điều kiện sắc ký để định lượng PQ trong huyết tương ...21
2.3.2 Đánh giá phương pháp phân tích PQ trong huyết tương...........................22
2.3.2.1. Tính chọn lọc .....................................................................................22
2.3.2.2. Khoảng nồng độ tuyến tính ................................................................23
2.3.2.3. Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng ........................................23
2.3.2.4. Đánh giá độ đúng và độ chụm ...........................................................23
2.3.2.5. Độ ổn định..........................................................................................23
2.3.3. Phân tích PQ trong mẫu huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên
lượng bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ.........................24
2.3.3.1. Đối tượng nghiên cứu ........................................................................24

3.3.2.1. Đánh giá độ thu hồi của phương pháp ...............................................49
3.3.2.2. Đánh giá độ đúng của phương pháp phân tích ..................................50
3.3.3. Đánh giá độ lặp lại và tái lặp lại ...............................................................51
3.3.3.1. Đánh giá độ lặp lại của thiết bị ..........................................................51
3.3.3.2. Đánh giá độ chụm của phương pháp phân tích ..............................53
3.3.4. Độ ổn định ................................................................................................56
Độ ổn định trong thời gian phân tích ..............................................................56
3.4. Phân tích mẫu PQ trong huyết tương bệnh nhân - áp dụng thực tế tiên lượng
bệnh nhân và đánh giá hiệu quả lọc máu hấp phụ..........................................56
3.4.1. Đặc điểm chung nhóm BN nghiên cứu: ...................................................56
3.4.2. Nồng độ Paraquat huyết tương trong tiên lượng bệnh nhân và đánh giá
hiệu quả lọc máu hấp phụ ........................................................................58
KẾT LUẬN ..............................................................................................................65
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................66

Vũ Anh Phương

Trường ĐHKH Tự nhiên


DANH SÁCH BẢNG BIỂU
Bảng 3.1:

Ảnh hưởng của thể tích bơm mẫu .......................................................27

Bảng 3.2:

Ảnh hưởng của tỉ lệ pha động tới độ phân cực, thời gian lưu, hệ số đối
xứng pic ...............................................................................................31


Ảnh hưởng của nồng độ TCA đến hiệu quả chiết PQ ra khỏi huyết tương ..46

Bảng 3.13:
Bảng 3.14:
Bảng 3.15:
Bảng 3.16:
Bảng 3.17:
Bảng 3.18:
Bảng 3.19:
Bảng 3.20:

Ảnh hưởng của thời gian lắc xoay đến quá trình chiết .......................46
Kết quả xác định độ ổn định khác ngày ..............................................48
Kết quả đánh giá hiệu suất thu hồi đối với phương pháp phân tích PQ ....50
Kết quả phân tích lặp lại các mẫu huyết tương thêm chuẩn ...............51
Các đại lượng thống kê .......................................................................51
Độ lặp lại thời gian lưu và diện tích pic của các chất .........................52
Kết quả hàm lượng PQ tìm lại được bằng phương pháp thêm chuẩn
của 3 kỹ thuật viên khác nhau .............................................................53
Các dữ kiện thống kê đánh giá độ lặp lại của phương pháp phân tích

Bảng 3.21:
Bảng 3.22:
Bảng 3.23:
Bảng 3.24:
Bảng 3.25:

tiến hành bởi ba KTV khác nhau.........................................................54
Các dữ kiện đánh giá độ tái lặp của phương pháp phân tích...............55
Kết quả xác định độ ổn định trong ngày .............................................56


Sắc đồ khảo sát thể tích bơm mẫu .........................................................27

Hình 3.3:

Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi A ...............................................28

Hình 3.4:

Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi B ...............................................29

Hình 3.5:

Sắc đồ phân tích PQ với hệ dung môi C ...............................................29

Hình 3.6:

Sắc ký đồ khảo sát tỉ lệ pha động ACN : Đệm %v/v ............................30

Hình 3.7:

Sắc đồ khảo sát ảnh hưởng của pH........................................................32

Hình 3.8:

Sắc đồ khảo sát nồng độ của natriheptanesulfonate trong đệm pH 2,5 .34

Hình 3.9:

Sắc đồ của PQ khi thay đổi nồng độ của KCl trong pha động. .............35

% Độ lệch chuẩn tương đối

% Reproducibility standard

% Độ lệch chuẩn tái lặp

deviation

tương đối

Acetonitrile

Acetonitril

Asymmetry factor

Hệ số đối xứng pic

ATP

Adenosin Triphophate

Adenosin Triphophat

BN

Patient

Bệnh nhân


spectroscopy
Hemoperfusion
High performance liquid
Chromatography
Liquid Chromatography - Mass
Spectroscopy

Sắc ký khí khối phổ
Lọc máu hấp phụ
Sắc ký lỏng hiệu năng cao
Sắc ký lỏng khối phổ

LOD

Limit of Detection

Giới hạn phát hiện

LOQ

Limit of Quantification

Giới hạn định lượng

Methanol

Methanol

ppm


Trường ĐHKH Tự nhiên


Tên viết tắt
SD
SIPP
TCA
tR
UV-VIS

Vũ Anh Phương

Tên tiếng anh

Tên Tiếng việt

Standard deviation

Độ lệch chuẩn

Severity Index of Paraquat

Chỉ số độ nặng của ngộ độc

Poisoning

Paraquat

Trichloroacetic acid


trong huyết tương đóng vai trò đặc biệt quan trọng, giúp xác định mức độ nặng của
ngộ độc, tiên lượng bệnh nhân cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp điều
trị, đặc biệt là lọc máu hấp phụ. Tỷ lệ tử vong do ngộ độc cấp PQ rất cao vì thiếu
các biện pháp điều trị hiệu quả. Gần đây, các nghiên cứu của nhiều tác giả nước
ngoài và một số tác giả Việt Nam cho thấy các kĩ thuật lọc máu mới, nhất là lọc
máu hấp phụ bằng cột than hoạt hoặc cột resin nhằm tăng cường đào thải PQ cho
kết quả khả quan, cứu sống một số không nhỏ bệnh nhân ngộ độc cấp PQ. Xét
nghiệm định lượng nồng độ PQ huyết tương cung cấp công cụ quan trọng để đánh
giá hiệu quả của các biện pháp điều trị tăng thải trừ này.
Tuy nhiên, cho đến nay tại Việt Nam việc xét nghiệm PQ chỉ dừng ở mức độ
định tính trong nước tiểu bằng phương pháp so màu để xác định bệnh nhân ngộ độc

Vũ Anh Phương

1

Trường ĐHKH Tự nhiên


PQ mà chưa có cơ sở xét nghiệm nào có thể thực hiện việc định lượng nồng độ PQ
máu với kết quả đáng tin cậy. Điều này dẫn đến một khoảng trống lớn trong chẩn
đoán, tiên lượng cũng như đánh giá hiệu quả của các biện pháp lọc máu làm cho
việc điều trị ngộ độc PQ tại Trung tâm Chống độc và các khoa hồi sức cấp cứu trên
cả nước gặp rất nhiều khó khăn.
Để định lượng PQ trong huyết tương trên thế giới đã áp dụng các phương
pháp sắc ký khí khối phổ (GC-MS), điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng khối phổ
(LC-MS)... Tại Trung tâm chống độc bệnh viện Bạch Mai hiện đang sử dụng máy
sắc ký lỏng hiệu năng cao để xét nghiệm độc chất nhưng cũng chưa có quy trình
chuẩn định lượng PQ huyết tương. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu định lượng Paraquat trong mẫu huyết tương người bằng phương

PQ tan tốt trong nước (độ tan 700 g/l ở 20oC), ít tan trong cồn và hầu như
không tan trong các dung môi hữu cơ khác.
PQ bị phân hủy dưới ánh sáng UV, bị bất hoạt bởi các tác nhân hoạt động bề
mặt anionic và bởi đất sét, bị mất hoạt tính nhanh khi tiếp xúc với đất. PQ không
bay hơi. Dung dịch PQ đặc ăn mòn thép, tấm thiếc, sắt mạ kẽm và nhôm [43].

Vũ Anh Phương

3

Trường ĐHKH Tự nhiên


PQ được sản xuất bởi nhiều công ty khác nhau với các tên thương mại và
hàm lượng khác nhau, nói chung thường đều ở dạng dung dịch màu xanh. Một số
tên gọi thường gặp của PQ như: Gramoxone, Gfaxone, Hegaxone, Tungmaxone,
Owen... [42].
Do độc tính gây tử vong rất cao nên hầu hết các nước phát triển đều đã cấm
sử dụng PQ như là một loại hóa chất bảo vệ thực vật (Mỹ và các nước Châu Âu).
Một số nước như Nhật Bản chỉ cho phép lưu hành PQ dạng dung dịch với hàm
lượng thấp 4,5% sẽ giúp giảm thiểu nguy cơ nếu bị ngộ độc. Thực tế hiện nay trên
thế giới vẫn có gần 130 nước cho phép sử dụng PQ trong đó có Việt Nam [42].
Hiện ở Việt Nam thuốc từ cỏ PQ được lưu hành dạng dung dịch 20% do đó nguy cơ
ngộ độc cấp tính rất lớn.
Một điều đáng nói là công ty sản xuất PQ lớn nhất trên thế giới hiện nay là
Syngenta hay còn gọi là Zeneca đặt nhà máy tại Trung Quốc và Anh. Trên đất nước
họ đã cấm hoàn toàn PQ, hoạt động kinh doanh chủ yếu xuất khẩu sang các nước
thứ ba [39].
1.1.3. Cơ chế gây độc của paraquat
Cơ chế gấy độc của PQ được mô tả theo sơ đồ sau [37]:

PQ có tính ăn mòn và gây tổn thương giống như kiềm khi tiếp xúc với da,
mắt và các niêm mạc. Các cơ quan đích chủ yếu trong ngộ độc toàn thân PQ là
đường tiêu hoá, thận và phổi. Dạ dày, ruột bị tổn thương nặng nề do tác dụng ăn
mòn trực tiếp khi bệnh nhân uống PQ có chủ ý với nồng độ cao. Thận là cơ quan
đào thải PQ và DQ và có nồng độ bipyridyl cao hơn so với các cơ quan khác. Riêng
ở phổi, PQ vào các phế bào týp I và II không phụ thuộc bậc thang nồng độ mà theo
cơ chế vận chuyển tích cực phụ thuộc ATP.
Do vậy PQ gây tổn thương hầu hết tất cả các cơ quan trong cơ thể vì đều có
liên quan đến chuyển hóa và hô hấp tế bào, tuy nhiên tại các vị trí hấp phụ nhiều PQ

Vũ Anh Phương

5

Trường ĐHKH Tự nhiên


hoặc liên quan đến thải trừ PQ thì tổn thương đến sớm hơn, nặng hơn và cũng là
nguyên nhân hàng đầu gây tử vong như tổn thương phổi gây suy hô hấp, suy thận,
viêm gan, loét niêm mạc đường tiêu hóa và biến chứng nhiễm trùng [6][13][37].
Việc tiếp xúc với lượng PQ ít hơn sẽ làm chậm nguy cơ tử vong do xơ phổi tiến
triển và suy thận [33]. Một số nghiên cứu gần đây còn cho thấy phơi nhiễm PQ có
liên quan với hội chứng Parkinson [21][23].
Trong ngộ độc cấp PQ, có thể tiên lượng bệnh dựa trên nồng độ PQ trong
huyết tương. Một số báo cáo cho thấy nồng độ PQ huyết tương vượt qua 2 µg/ml thì
hầu hết tử vong, tuy nhiên một vài trường hợp bệnh nhân vẫn hồi phục khi nồng độ
trong máu cao hơn 2 µg/ml [7][10][22].
1.1.4. Dược động học paraquat
1.1.4.1. Hấp thu
Ở đường tiêu hoá PQ được hấp thu rất nhanh nhưng ít (5-10%). Hấp thu chủ

thận và quá trình bài tiết tích cực của ống thận. Trong vòng 12-24 giờ sau uống, trên
90% PQ được đào thải dưới dạng không đổi qua thận, nếu chức năng thận bình
thường [11].Tuy nhiên có thể xét nghiệm thấy PQ trong nước tiểu vài ngày sau do
có sự tái phân bố PQ từ các cơ quan. Thời gian bán thải của PQ có thể kéo dài 12120 giờ hoặc lâu hơn khi có suy thận. Ngoài ra PQ còn đào thải qua phân dưới dạng
không đổi [8][22].
1.1.5. Tiên lượng bệnh nhân dựa vào nồng độ paraquat trong huyết tương.
Tiên lượng bệnh nhân uống PQ có thể dựa vào nồng độ PQ huyết tương theo
thời gian. Nồng độ PQ phải đo trước khi điều trị vì các biện pháp điều trị có thể làm
giảm nồng độ PQ (dùng than hoạt, lọc máu hấp phụ…). Proudfoot và cộng sự [29]
lần đầu tiên trình bày biểu đồ tiên lượng khả năng sống từ kết quả định lượng nồng
độ PQ huyết tương tại nhiều thời điểm khác nhau trên 79 bệnh nhân. Những BN
sống có nồng độ dưới 2,0; 0,6; 0,3; 0,16 và 0,1 mg/l tương ứng ở 4, 6, 10, 16, và 24
giờ sau uống PQ. Schermann và cộng sự [35] mở rộng đường cong tiên lượng BN
này lên đến ngày thứ 7 sau nhiễm độc, và nghiên cứu này cho thấy những BN nồng
độ PQ huyết tương trên 10 mg/l (định lượng trong vòng 8 giờ), thường chết vì sốc
tim trong 24h, trong khi những BN có nồng độ thấp hơn (nhưng vẫn trên đường tiên
lượng), chết vì xơ phổi và suy hô hấp muộn hơn 24 giờ sau uống. Suzuki và cộng sự
(1991) [36] đã kết hợp dữ liệu của Proudfoot (1979), Bismuth (1982), Scherrmann
(1987), Sawada (1988) và thêm một nhóm 78 BN, kết luận rằng đồ thị tiên lượng
chính xác 101 trong 102 trường hợp tử vong và 61 trong 63 BN sống được đánh giá
trong vòng 24 h sau uống PQ. Mặc dù đồ thị khá chính xác, giúp xác định mức độ
nặng và tiên lượng tử vong nếu định lượng được PQ ngay lập tức, đồ thị này cũng

Vũ Anh Phương

7

Trường ĐHKH Tự nhiên



uống PQ. Các kết cục của BN dự đoán theo đồ thị của Proudfoot đã sai ở 1
trường hợp tử vong và 2 BN sống; trong khi đó, SIPP sai ở 1 BN sống và 10
trường hợp tử vong. Những khác biệt này có ý nghĩa thống kê, và tác giả kết luận
rằng dựa trên nồng độ PQ trong 24 h đầu sau uống, đồ thị của Proudfoot tiên
lượng chính xác hơn SIPP [36].
1.2. Các phương pháp xác định paraquat trong huyết tương
1.2.1. Phương pháp quang phổ
Rai M.K và cộng sự [30] định lượng PQ sử dụng NaBH4 để khử PQ trong
môi trường kiềm tạo ra dung dịch màu xanh hấp thụ cực đại ở bước sóng 600nm
trong khi Kato K. và cộng sự [20] lại dùng Tetrabromophenolphthalein Ethyl Ester
(TBPE) phản ứng với PQ để tạo ra dung dịch hữu cơ PQ-TBPE màu xanh da trời,
có thể chiết được bằng dichloromethane. Chang-bin Li và cộng sự [24] đã định
lượng PQ trong huyết tương dựa bằng đo quang phổ của dẫn xuất khi phản ứng với
Na2S2O4 10% và NaOH 5M.
Ưu điểm của phương pháp khử PQ bằng NaBH4 là độ nhạy cao, với các điều
kiện khử PQ là nhiệt độ 35-40°C, pH 10-11 thì màu có độ ổn định lên đến 12h và
không cần đệm để ổn định màu, khoảng nồng độ 0,05 - 0,5 µg/ml tuân theo định
luật Lambert – Beer, trong khi giới hạn phát hiện là 0,03 µg/ml. Trong khi đó,
phương pháp sử dụng TBPE thì mẫu được phép để tối đa trong 20 phút. Cả 2
phương pháp này đều đề cập đến DQ, trong khi Rai M.K [30] loại bỏ DQ thì Kato
K. [20] lại định lượng đồng thời cả PQ và DQ.
Phương pháp định lượng PQ bằng NaBH4 đã loại được sự ảnh hưởng của các
thuốc trừ sâu thông thường và các ion kim loại khác. DQ, có cấu trúc gần giống PQ,
sẽ gây ảnh hưởng khi định lượng PQ. Tuy nhiên DQ, nếu có, sẽ bị loại khi thêm
NaOH 0,2 N, trong khi PQ không bị mất đi. Các ion kim loại như Fe3+ và Al3+, có
thể ảnh hưởng do làm kết tủa hydroxide, sẽ bị loại đi khi thêm 1 ml Natri EDTA 5%

Vũ Anh Phương

9

hai nghiên cứu, các tác giả đã sử dụng hệ thống chọn lọc ion (selected ion
monitoring – SIM) để nhận biết PQ, đồng thời cũng thêm EPQ làm chất nội chuẩn,
khí He được dùng như là khí mang để đưa chất phân tích vào cột. Dung dịch mẫu

Vũ Anh Phương

10

Trường ĐHKH Tự nhiên


phân tích đều được khử bằng NaBH4 trước khi đem phân tích trên hệ sắc ký khí.
Tuy nhiên mỗi tác giả lại nghiên cứu các quy trình phân tích khác nhau.
Tác giả L. Gao và cộng sự [16] lại sử dụng cột mao quản (10 m × 0,18 mm,
độ dày màng 0,25 µm). Nhiệt độ của bơm tiêm, interface và nguồn ion lần lượt là
280, 280, 200oC. Khí mang được bơm đẳng dòng với tốc độ là 1,01 ml/phút. Mẫu
được đưa vào bằng chế độ tiêm chia dòng (10:1) và nhiệt độ giải hấp phụ lúc đầu là
70oC trong 1 phút và tăng đến 295oC với tốc độ 25oC/phút. Nhiệt độ 295oC được
duy trì trong 10 phút. Trong đó các mảnh ion 196 và 224 được dùng để định lượng
PQ & EPQ. Độ thu hồi của mẫu máu và nước tiểu lần lượt là 94,00 - 99,85% và
95,00 - 100,34%, khoảng tuyến tính 0,1 - 50 µg/ml. Giới hạn phát hiện (S/N = 3) là
0,01 µg/ml đối với cả máu và nước tiểu. Phương pháp này đã được áp dụng để phân
tích các mẫu sinh học thu được từ các nạn nhân chết do uống PQ.
Trong khi đó, Almeida R. M. và cộng sự [5] sử dụng trên hệ máy sắc ký GCMS (Gas chromatograph model 6890 và Mass selective detector MSD model 5972)
với cột mao quản fused-silica HP-5MS (30 m × 0,25 mm, độ dày màng phim 0,1
µm) và chế độ đẳng dòng với tốc độ 0,6 ml/phút. Nhiệt độ của bơm và interface (bộ
phận ghép nối giữa GC và MS) là 270oC. Bơm hoạt động ở chế độ chia dòng. Nhiệt
độ cột duy trì 80oC trong 1 phút, tăng nhiệt 10oC/phút đến 200oC và 20oC/phút đến
270oC và duy trì 270oC trong 4 phút. Số khối của các mảnh ion được chọn cho các
hợp chất là: m/z 108, 135, 190 (DQ); m/z 134, 148, 192 (PQ) và m/z 148, 162, 220

dòng PQ và ethyl viologen trong acetonitrile/dung dịch ammonium formate 250
mM (40:60, v/v) với tốc độ khí cone là 50 l/h và tốc độ dòng khí làm khô là 651 l/h
ở 350oC. Điện áp mao quản là 3,5 kV và điện áp cone là 20 V, điện áp extractor là
4,0 V và điện áp thấu kính RzFl à 0,5 V. Định lượng bằng kỹ thuật quét ion (multireaction monitoring, MRM), bắt các mảnh ion ban đầu có m/z 186 và các ion sản
phẩm có m/z 155 và 171 đối với PQ; mảnh ion ban đầu có m/z 214 và các ion sản
phẩm có m/z 158 và 185 đối với chuẩn nội ethyl viologen [41].
Còn với tác giả Proenca P [28] phát hiện phổ (MS) được thực hiện trên máy
khối phổ tứ cực Water ZQ 2000. Thiết lập các điều kiện: nguồn nhiệt 120oC; nhiệt
độ làm khô 400oC; tốc độ dòng khí cone (N2) 0 l/h và tốc độ dòng khí làm khô (N2)
600 l/h. Điện thế capillary 3,5 kV; điện thế cone 40 V; extractor 4 V; năng lượng
ion 0,5 V; Quét phổ từ m/z 130-500, thời gian quét 0,5 s và thời gian trễ (interscan)
0,1s. Đường chuẩn độ PQ trong máu tuyến tính từ 0,010-2,0 µg/ml trong máu
(y=0,0142x+0,1497 với r2=0,9994) và tuyến tính từ 0,025-10,0 µg/ml trong nước
tiểu (y = 0,0141x + 1,347 với r2 = 0,9994). Giới hạn phát hiện của PQ trong máu và

Vũ Anh Phương

12

Trường ĐHKH Tự nhiên


nước tiểu lần lượt là 0,004 µg/ml và 0,007 µg/ml (LOD, S/N = 3) và giới hạn định
lượng (LOD, S/N = 10) là 0,0012 µg/ml trong máu và 0,024 µg/ml trong nước tiểu.
Nghiên cứu cũng chứng minh mẫu máu trắng không có pic nào trùng thời gian lưu
với PQ và chất chuẩn nội
1.2.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Có rất nhều tác giả đã sử dụng phương pháp HPLC để định lượng PQ trong
dịch sinh học [7][17][26].
Arys K. và cộng sự [7] sử dụng hệ thống HPLC. Gồm bơm model 126 và

Shuuji Hara [17] định lượng đồng thời PQ và DQ trong huyết tương bằng
phương pháp HPLC. Hệ sử dụng bơm L-7120 (Hitachi, Tokyo, Nhật), van bơm
mẫu (20 µl) Rheodyne 7125. PQ, DQ, IS được tách trên cột pha đảo Capcell PaK
C18 UG120 (150-4,6 mm, cỡ hạt 5µm, của Shiseido Co., Tokyo, Nhật) bằng dung
dịch rửa giải của methanol và 200 mM axit phosphoric với diethyl amine 0,1M và
sodium 1-heptane sulphonate 12 mM (1:4, v/v). Tốc độ dòng của pha động 0,5
ml/phút và nhiệt độ cột trong khoảng từ 15-20oC. Dịch rửa từ cột HPLC được trộn
với dung dịch kiềm của Sodium hydrosulfite bằng thiết bị trộn. Tốc độ dòng 0,4
ml/phút. Hỗn hợp được dẫn vào sợi dây (1 m x 0,5 mm) và được làm ấm trong bể
nước SB-9 (EYELA, Tokyo, Nhật) ở nhiệt độ 20oC và đo ở bước sóng 391 nm bằng
detector UV Hitachi L- 7405. Độ cao của pic được dùng để định lượng bằng máy CR6A Chromatopak (Shimadzu, Kyoto, Nhật). Giới hạn phát hiện của PQ và DQ là
50 và 100 ng (0,19 và 0,29 nmol) trên ml huyết tương.
Định lượng PQ trong huyết tương sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo
cặp ion đã được Brunetto M.R. thực hiện trên hệ thống sắc ký được sử dụng có 2
bơm, 1 bơm 2 nòng để chuyển pha động vào cột phân tích và bơm Knauer Model
64 để chuyển pha động vào cột chiết. Van tiêm (V1) 6 cửa có các vòng mẫu 20, 100
hoặc 200 µl để đưa mẫu vào cột chiết. Sử dụng các cột 25 - 4 mm được lấp đầy các
hạt LiChrospher RP-18 ADS (kích thước hạt 25 µm) và cột VARIAN ODS C-18
(25 cm × 4,6 mm, hạt 5 µm) lần lượt là cột chiết và cột phân tích. Cột chiết và cột
phân tích được gắn với van xoay 6 cửa Rheodyne được điều khiển bằng bơm 2
nòng. Sử dụng detector UV-DAD Perkin-Elmer LC 235 ở bước sóng 258 nm với
flowcell 12 µm để phát hiện các tín hiệu.

Vũ Anh Phương

14

Trường ĐHKH Tự nhiên



1.3. Các phương pháp xử lý mẫu huyết tương phân tích Paraquat
Một trong những yếu tố quyết định đến hiệu quả của phương pháp định
lượng đó là phương pháp xử lý mẫu.

Vũ Anh Phương

15

Trường ĐHKH Tự nhiên


Có rất nhiều nghiên cứu sử dụng kỹ thuật chiết pha rắn để xử lý mẫu sinh
học trong phân tích PQ [5][16][20][28][41]. Một số tác giả dùng đệm phosphate để
thêm vào mẫu thử trước khi cho qua cột chiết pha rắn [5][16][41].
Cột chiết pha rắn C18 thường được dùng để chiết PQ & DQ trong mẫu thử
[20]. Dung dịch mẫu đã loại protein được chỉnh pH đến 11 bằng NaOH. Cột được
hoạt hóa bằng 5 ml nước, 5 ml methanol và 20 ml nước trước khi bơm mẫu vào cột.
3 ml nước cất được bơm qua cột để loại bỏ hoàn toàn các hợp chất khác trong máu.
Sau đó, 3 ml acid hydrochloric 0,2 M và 1 ml × 3 nước khử khoáng được cho qua
cột để rửa giải PQ & DQ. Với dịch thu được thêm 3 ml dung dịch NaOH 0.2 M.
Mẫu này được mang đi đo quang [20].
Chang-bin Li [5] cũng dùng cột C18 để chiết PQ, cột được rửa với 2 ml
methanol và 2 ml đệm phosphate (pH 8,0). Dung dịch mẫu được đưa qua cột rồi rửa
với 2 ml nước khử khoáng. Cuối cùng, rửa giải với 2 ml methanol và dịch rửa giải
được bay hơi ở nhiệt độ phòng dưới dòng khí nitrogen. Hòa tan cắn trong 100 µl
methanol và bơm 1 µl vào hệ thống GC-MS.
Zhaohong Wang [41] xử lý 1,0 ml máu, thêm 3 ml đệm phosphate 0,1M (pH
7) và dung dịch chuẩn nội 100 ng/ml. Ly tâm 8000 vòng/phút trong 10 phút. Các cột
Waters Oasis WCX 3 ml được cho chạy qua lần lượt 3 ml methanol, 3 ml nước khử
khoáng và 1 ml đệm phosphate 0,1 M (pH 7). Sau khi cho mẫu chạy qua cột, rửa cột