ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐẶNG THỊ HOA

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN LIÊN QUAN
ĐẾN KHẢ NĂNG KHÁNG MỌT
CỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC

THÁI NGUYÊN - 2015

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC

ĐẶNG THỊ HOA

NGHIÊN CỨU PHÂN LẬP GEN LIÊN QUAN ĐẾN
KHẢ NĂNG KHÁNG MỌTCỦA MỘT SỐ GIỐNG NGÔ

Chuyên ngành: Công nghệ sinh học
Mã số: 60.42.02.01

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC




LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan bản luận văn là công trình nghiên cứu của tôi dƣới sự
hƣớng dẫn của PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, sự giúp đỡ của các cán bộ
Khoa Khoa học sự sống - Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên, Viện
Công nghệ Sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Các số
liệu, kết quả trong luận văn là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.
Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về những số liệu trong luận văn này.
Thái Nguyên, ngày 1 tháng 05 năm 2015
Tác giả luận văn

Đặng Thị Hoa

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




MỤC LỤC
Trang
MỞ ĐẦU ........................................................................................................................... 1
Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 3
1.1. CÂY NGÔ .................................................................................................... 3
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại .......................................................................... 3
1.1.2. Đặc điểm sinh học .................................................................................. 4
1.1.3. Đặc điểm hóa sinh hạt ngô ..................................................................... 5
1.1.4. Giá trị kinh tế của cây ngô...................................................................... 7
1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới....................................................... 8

tinh sạch sản ph m RT – PCR ........................................................................ 43
3.2.2. Tách dòng đoạn mã hoá của gen Cys2 ................................................. 45
3.3. KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN CYSTATIN ............................ 47
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ............................................................................................ 53
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................. 54

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT

Nghĩa tiếng Anh
ABA
bp
cDNA

Nghĩa tiếng Việt

Abscisic acid
(cặp bazơ)

base pair
complementary DNA

đtg

đồng tác giả


messenger ribonucleic acid

OD

Optical density

PCR

Polymerase chain reaction

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium dodecyl sulfate

TAE

Tris-acetate-EDTA

X-gal

(Phản ứng chuỗi
trùng hợp)

5- bromo-4-chloro-3-indolyl-β-Dgalacto-pyranoside

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN

Bảng 2.3. Danh mục các thiết bị sử dụng ...................................................................... 31
Bảng 2.4. Thành phần hóa chất cho phản ứng tổng hợp cDNA .................................. 33
Bảng 2.5. Thành phần hóa chất của phản ứng PCR nhân gen Cystatin2 .................... 34
Bảng 2.6. Thành phần hóa chất gắn gen Cystatin2 vào vector tách dòng pBT .......... 35
Bảng 2.7. Thành phần hóa chất tách chiết plasmid ....................................................... 37
Bảng 3.1. Hình thái và khối lƣợng hạt của 10 mẫu ngô nghiên cứu............................ 41
Bảng 3.2. Lƣợng ngô hao hụt theo thời gian của 10 mẫu ngô nghiên cứu.................. 43
Bảng 3.3. Sự sai khác về trình tự nucleotide của gen Cys2 của mẫu ngô TQ1 và trình
tự có mã số D38130 ........................................................................................................ 48
Bảng 3.4. Hệ số tƣơng đồng nucleotide của gen Cys2 của mẫu ngô TQ1 và trình tự
có mã D38130.................................................................................................................. 48
Bảng 3.5. Sự sai khác giữa trình tự amino acid của mẫu ngô TQ1 với D38130........ 49
Bảng 3.6. Hệ số tƣơng đồng amino acid suy diễn của protein Cys2 của mẫu ngô TQ1
với D38130 ...................................................................................................................... 50

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




MỞ ĐẦU
1. LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI
Trên thế giới, ngô là một trong những cây ngũ cốc quan trọng, đứng thứ ba
về diện tích sau lúa mì và lúa nƣớc, đứng thứ hai về sản lƣợng và đứng thứ nhất
về năng suất [12].
Ở Việt Nam, ngô là cây lƣơng thực quan trọng không chỉ cung cấp lƣơng
thực cho ngƣời, vật nuôi mà còn là cây trồng xóa đói giảm nghèo tại các tỉnh có
điều kiện kinh tế khó khăn. Do đó, cây ngô cũng là cây lƣơng thực đƣợc chú
trọng trồng ở nƣớc ta. Và nếu trong tƣơng lai khi đã sản xuất đủ nhu cầu nội địa,
chắc chắn ngô sẽ là mặt hàng xuất kh u của nƣớc ta giống nhƣ lúa gạo, vì nhu

cây trồng chống lại các tác nhân gây bệnh và côn trùng. Theo những nghiên cứu
đã đƣợc công bố, đặc tính kháng mọt của hạt có liên quan đến gen Cystatin.
Xuất phát từ vấn đề này, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài
“Nghiên cứu phân lập gen liên quan đến khả năng kháng mọt của một số
giống ngô”.
2. MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Phân lập gen cystatin2 ở một số giống ngô có khả năng kháng mọt khác nhau.
3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Đánh giá khả năng kháng mọt của các giống ngô nghiên cứu.
- Tách dòng gen cystatin2 ở giống ngô có khả năng kháng mọt tốt.
- Xác định trình tự gen cystatin2 ở giống ngô có khả năng kháng mọt tốt.

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

1.1. CÂY NGÔ
1.1.1. Nguồn gốc và phân loại
Cây ngô có tên khoa học là Zea mays L., là một loại cây lƣơng thực thuộc
chi Maydeae, họ hòa thảo (Gramineae), bộ hòa thảo (Graminales) [60].
Có nhiều giả thuyết khác nhau về nguồn gốc cây ngô dựa trên những căn
cứ vào kết quả nghiên cứu khảo cổ học, tế bào học, di truyền học…Những
nghiên cứu di truyền học gần đây cho thấy cây ngô có nguồn gốc ở miền trung
Mexico. Việc gieo trồng ngô đã lan rộng từ Mexico vào tây nam Hoa Kỳ, sau đó
vào đông bắc nƣớc này cũng nhƣ đông nam Canada, làm biến đổi cảnh quan các
vùng đất này do thổ dân châu Mỹ đã dọn sạch nhiều diện tích rừng và đồng cỏ
để trồng ngô. Ngô lan truyền sang châu Âu và phần còn lại của thế giới sau khi

định quá trình sinh trƣởng phát triển của cây ngô, nó giúp cây hút nƣớc và các
chất dinh dƣỡng suốt đời sống của cây. Rễ chân kiềng mọc quanh các đốt thấp sát
mặt đất. Rễ này giúp cây chống đỡ và bám chặt vào đất, chúng cũng tham gia hút
nƣớc và thức ăn. Số lƣợng rễ, số lông rễ và độ dài rễ khác nhau ở mỗi giống. Đây
là một chỉ tiêu quan trọng để đánh giá khả năng chịu hạn của cây.
Thân ngô đặc, đƣờng kính từ 2 - 4 cm, cao từ 1,8 - 2 m. Thân ngô trƣởng
thành bao gồm nhiều lóng nằm giữa các đốt và kết thúc bằng bông cờ. Thân ngô
ngoài nhiệm vụ giúp cây đứng vững, là bộ phận dự trữ và vận chuyển chất hữu
cơ, ngoài ra còn có khả năng quang hợp để tổng hợp chất hữu cơ.
Lá ngô mọc từ mắt trên đốt và mọc đối xứng xen kẽ nhau. Các bộ phận của
lá bao gồm: bẹ lá, phiến lá, thìa lá. Theo hình thái và vị trí trên thân, lá ngô đƣợc
chia thành các nhóm: lá mầm, lá thân, lá bẹ, lá bi. Số lá, độ lớn của lá phụ thuộc
vào giống, điều kiện thời tiết, kỹ thuật canh tác, mùa vụ, số lá ngô thƣờng biến
động từ 15 - 20 lá. Đặc điểm nổi bật là lá ngô có rất nhiều khí khổng. Trung bình
một lá ngô có từ 2 - 6 triệu khí khổng, trên 1mm2 lá có từ 500 - 900 khí khổng.
Cơ chế đóng mở của lỗ khí khổng liên quan chặt chẽ tới điều kiện hạn hán. Lá
ngô là cơ quan làm nhiệm vụ quang hợp, đồng thời làm nhiệm vụ trao đổi khí,
hô hấp, dự trữ dinh dƣỡng…
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Ngô là loại cây có hoa khác tính cùng gốc. Cơ quan sinh sản đực (bông cờ)
và cái (bắp) tuy cùng nằm trên một cây song ở những vị trí khác nhau. Hoa đực
nằm ở đỉnh cây. Hoa cái phát sinh từ mầm nách lá trên thân, số mầm nách nhiều
nhƣng chỉ có từ 1 - 3 mầm nách trên cùng phát triển thành bắp. Số bắp trên cây
phụ thuộc vào giống, vùng sinh thái, mật độ và phân bón.
Hạt ngô thuộc loại quả dĩnh gồm 5 phần chính: vỏ hạt, lớp alơrôn, phôi, nội
nhũ và chân hạt. Vỏ hạt bao xung quanh hạt là một màng nhẵn. Lớp alơrôn nằm

khoảng 3,5%, lƣợng tro khoảng 1 - 2,4%, chất khoáng chiếm trên 60% khối
lƣợng của phôi [12].
Tinh bột ngô hình tròn, hình đa diện, góc cạnh rõ rệt, kích thƣớc khoảng 8 35 µm. Tinh bột tập trung chủ yếu ở nội nhũ và đƣợc chia thành hai dạng là tinh
bột mềm (tinh bột bột) và tinh bột cứng (tinh bột sừng). Đặc điểm tinh bột của
nội nhũ hạt là một tiêu chu n để phân loại loài ngô phụ. Hàm lƣợng tinh bột ở
ngô tẻ (68%) nhiều hơn ở ngô nếp (65%) [12].
Tỷ lệ chất béo trong hạt ngô tƣơng đối cao (3 - 6%), chủ yếu tập trung
trong mầm ngô. Trong chất béo của ngô có 50% là acid linoleic, 31% là acid
oleic, 13% là acid panmitic và 3% là stearic. Hàm lƣợng lipid là một chỉ tiêu
quan trọng để đánh giá chất lƣợng hạt [7].
Tỷ lệ protein trong hạt ngô 8 - 12%. Protein chính của ngô là zein, một loại
prolamin gần nhƣ không có lysine và tryptophan. Protein của ngô đƣợc chia
thành 3 loại chính: protein hoạt tính (enzyme), protein cấu tạo và protein dự trữ,
trong đó protein dự trữ chiếm tỷ lệ cao nhất. Hàm lƣợng protein cũng nhƣ các
thành phần amino acid bị thay đổi bởi những tác động của các yếu tố di truyền
(giống) và môi trƣờng, kỹ thuật canh tác.
Vitamin của ngô tập trung ở lớp ngoài hạt ngô và ở mầm. Ngô cũng có
nhiều vitamin C, vitamin B (B1, B2, B6..). Vitamin PP hơi thấp, cộng với thiếu
tryptophan, một amino acid có thể tạo vitamin PP. Riêng ngô vàng chứa nhiều
carotene (tiền vitamin A) [12].

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Bảng 1.1. Thành phần hóa học của ngô so với 3 loại hạt ngũ cốc khác [12]
Chỉ tiêu (Tính trên trọng lƣợng
khô)



4,5

2,6

Chất đƣờng bột

(%)

81,1

74,0

67,4

74,8

Chất xơ

(%)

1,2

2,3

4,8

0,9

Tro


0,38

0,34

Riboflavin (B2)

(mg/100g)

0,12

0,12

0,15

0,05

Niacin (B3)

(mg/100g)

4,3

2,2

3,9

4,7

Fe

đang sử dụng ngô để chế biến ethanol - năng lƣợng sạch của tƣơng lai.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Ngô là cây lƣơng thực nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới, tất cả các
nƣớc trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác nhau. Nếu nhƣ ở châu Âu
kh u phần ăn cơ bản là: bánh mỳ, khoai tây, sữa; châu Á là cơm (gạo), cá, rau
xanh (canh) thì châu Mỹ La Tinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt. Ngoài ra, bắp ngô
bao tử còn đƣợc sử dụng làm rau cao cấp, lấy hạt làm nguyên liệu chế biến các
mặt hàng có giá trị dinh dƣỡng cao nhƣ sữa ngô, ngô ngọt đóng hộp, đóng lọ…
Ngô là thức ăn giàu năng lƣợng, là thành phần quan trọng trong thức ăn hỗn
hợp cho gia súc và gia cầm. Hầu nhƣ 70% chất dinh dƣỡng trong thức ăn tổng
hợp là từ ngô. Cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tƣởng cho đại gia súc,
đặc biệt là bò sữa.
Ngô cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp. Ngƣời ta đã sản xuất khoảng
670 mặt hàng khác nhau của các ngành công nghiệp lƣơng thực - thực ph m,
công nghiệp dƣợc và công nghiệp nhẹ.
Ngoài ra ngô còn là nguồn hàng hóa xuất kh u có giá trị cao. Trên thế giới
hàng năm lƣợng ngô xuất nhập kh u khoảng 70 triệu tấn đem lại nguồn lợi
nhuận kinh tế lớn [12].
1.1.5. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
Ngô là cây có địa bàn phân bố rộng nhất thế giới, trải rộng từ 40o N đến gần
55o B, từ độ cao 1 - 2 m đến 400 m so với mực nƣớc biển. Do đó ngô đƣợc trồng
ở hầu hết các nơi trên thế giới [4]. Cho đến cuối thế kỷ XX, ngô vẫn còn kém
hai cây trồng là lúa nƣớc và lúa mì cả về diện tích và sản lƣợng. Nhƣng đến năm
2005, sản lƣợng ngô trên thế giới đạt 713,68 triệu tấn trong khi đó sản lƣợng lúa
mì là 623 triệu tấn và lúa nƣớc là 618 triệu tấn. Do điều kiện khí hậu, thổ
nhƣỡng, tập quán canh tác dẫn đến diện tích, sản lƣợng và năng suất ngô ở các

205,03

19,42

1962

103,50

204,88

19,80

2005

148,16

713,68

48,17

2006

146,96

706,84

48,10

2007


2011

172,05

888,01

51,61

2012

177,38

872,07

49,16

Năm

Nguồn: FAOSTAT 2013 [59].
Diện tích trồng ngô giữa các châu lục có sự chênh lệch nhau, trong đó châu
Mỹ là khu vực có diện tích trồng ngô lớn nhất (67,66 triệu ha - 2012), chiếm gần
38,14% diện tích ngô trên toàn thế giới và 47,96% về sản lƣợng. Châu Âu có
diện tích trồng ngô thấp, khoảng 10,33% tổng diện tích gieo trồng (18,3 triệu ha)
nhƣng luôn đứng thứ hai về năng suất (51,7 tạ/ha). Châu Á đứng thứ hai về diện
tích (32,47%) và sản lƣợng (288,8 triệu tấn) nhƣng năng suất thấp hơn một chút
(50,2 tạ/ha) [59].
Do có nhiều giá trị sử dụng và giá trị kinh tế nên ngô trở thành cây trồng
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN



77,44

Trung Quốc

34,97

208,23

59,55

Ấn Độ

8,40

21,06

25,07

Ý

0,98

8,19

83,58

Hy Lạp

0,18


Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




Bảng 1.4. Tình hình sản xuất ngô ở Việt Nam từ 1975 – 2012
Diện tích

Sản lƣợng

Năng suất

(triệu ha)

(triệu tấn)

(tạ/ha)

1975

0,267

0,28

10,51

1990

0,432


1,440

4,57

31,75

2009

1,089

4,37

40,14

2010

1,126

4,61

40,90

2011

1,121

4,84

43,13


lai đã chiếm khoảng 90% diện tích ngô cả nƣớc. Việt Nam đã đuổi kịp các nƣớc
trong khu vực về trình độ nghiên cứu tạo giống ngô lai và đang ở giai đoạn đầu
đi vào công nghệ cao (công nghệ gen, nuôi cấy bao phấn và noãn) [4], [19].
Những vùng trồng ngô lớn ở Việt Nam là khu vực Đông Nam Bộ, Tây
Nguyên, trung du miền núi phía Bắc, đồng bằng sông Hồng và duyên hải miền
Trung [5]. Trong đó, khu vực miền núi phía Bắc trồng chủ yếu là các giống ngô
địa phƣơng. Năng suất của các giống ngô địa phƣơng thƣờng thấp, tuy nhiên các
giống ngô địa phƣơng vẫn tiếp tục đƣợc quan tâm nghiên cứu vì các ƣu điểm
nhƣ khả năng chịu hạn, kháng sâu bệnh tốt và có thể gieo trồng trên nhiều loại
đất khác nhau.
Tuy nhiên, sản lƣợng ngô của Việt Nam vẫn thấp hơn so với sản lƣợng ngô
thế giới. Có nhiều nguyên nhân khiến sản lƣợng ngô của nƣớc ta chƣa cao nhƣ:
do chƣa tập trung sản xuất ngô, do điều kiện khí hậu, tập quán canh tác,…Ngoài
ra, tại một số vùng miền núi khó khăn về sản xuất lúa nƣớc nên nông dân phải
trồng ngô làm lƣơng thực thay thế gạo, làm thức ăn chăn nuôi. Các giống ngô
đƣợc trồng đều là các giống truyền thống của địa phƣơng, giống cũ nên năng
suất rất thấp. Do đó, sản lƣợng ngô trong nƣớc không đủ phục vụ cho con ngƣời
cùng với sự phát triển của ngành chăn nuôi. Hàng năm Việt Nam vẫn phải nhập
kh u một lƣợng lớn ngô, đậu tƣơng làm thức ăn cho gia súc. Chính vì vậy, cần
tiếp tục nghiên cứu để có biện pháp cải tạo giống ngô theo hƣớng tăng năng suất
và chất lƣợng là rất cần thiết.
1.2. MỌT NGÔ VÀ ẢNH HƢỞNG CỦA NÓ TỚI QUÁ TRÌNH BẢO
QUẢN NÔNG SẢN
1.2.1. Thành phần côn trùng hại ngô bảo quản
Hầu nhƣ ở đâu có sự tồn trữ và lƣu giữ thì ở đó xuất hiện các loài sinh vật gây
hại. Nhiều khi chỉ cần sau vài tuần sinh vật đã phát triển thành quần thể lớn và gây
ra những vụ “cháy ngầm”, tiêu hủy một phần hoặc toàn bộ hàng hóa bảo quản.
Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




zeamays),

mọt

gạo (Sitophilus oryzae) và mọt bột đỏ

Số hóa bởi trung tâm Học liệu– ĐHTN




(Tribolium castaneum) là loài có mật độ xuất hiện lớn [2].
Nguyễn Kim Hoa và đtg (2008), thành phần mọt hại ngô bảo quản tại hộ gia
đình ở vùng Bắc Hà - Lào Cai gồm 10 loài thuộc 9 họ của 2 bộ côn trùng
(Coleoptera và Lepidoptera) và 1 họ thuộc bộ nhện Acarina. Mọt ngô S. zeamais là
loài gây hại nguy hiểm nhất, tiếp đó là mọt bột sừng G. cornutus [8], [9].
1.2.2. Mọt ngô
1.2.2.1. Vị trí phân loại, phân bố
- Vị trí phân loại:
+ Giới (Kingdom): Animalia
+ Ngành (Phylum): Arthropoda
+ Lớp (Class): Insecta
+ Bộ (Order): Coleoptera
+ Họ (Family): Curculionidae
+ Tên khoa học: Sitophilus zeamais Motschulsky
Mọt ngô phân bố phổ biến ở nhiều nƣớc trên thế giới, gây hại đáng kể ở
những vùng ấm áp trên thế giới, nhất là ở châu Á, vùng Địa Trung Hải và Bắc
Mỹ. Ở nƣớc ta có thể gặp ở tất cả các địa phƣơng. Chúng có thể đẻ trứng ở
ngoài đồng và cả trong kho.